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    新疆小海子墾區(qū)牛梨形蟲感染情況的調(diào)查

    2021-12-14 08:25:08王正榮蔣建軍薄新文張艷艷賈春英
    動物醫(yī)學(xué)進展 2021年12期
    關(guān)鍵詞:登錄號梨形貝斯

    張 峰,王正榮,蔣建軍,薄新文,張艷艷,賈春英

    (1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院,新疆石河子 832000 ;2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室,新疆石河子 832000;3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第三師畜牧獸醫(yī)工作站,新疆圖木舒克 843901)

    梨形蟲病(Piroplasmosis)是一類經(jīng)硬蜱傳播,由巴貝斯屬(Babesia)和泰勒屬(Theileria)原蟲所引起的血液原蟲病的總稱[1],主要引起宿主貧血消瘦、黃疸高熱、血紅蛋白尿等臨床癥狀,嚴重時可導(dǎo)致宿主的死亡[2]。梨形蟲種類繁多,迄今為止,全球范圍內(nèi)所記載的各種哺乳動物的巴貝斯蟲有67種[3],泰勒蟲有13種[4]。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計,蜱及蜱傳原蟲病每年對畜牧業(yè)造成約70億美元的經(jīng)濟損失。及早地發(fā)現(xiàn)、確診是有效防控該病的關(guān)鍵,目前最為簡單的臨床診斷方法為血涂片(或淋巴結(jié)穿刺)鏡檢,但無法準確鑒定不同蟲種,且靈敏度較低。血清學(xué)診斷方法雖然靈敏度、特異性較高,但不一定能證明寄生蟲感染的存在,也不一定能證明保護性免疫的存在,因為常出現(xiàn)不同蟲種的交叉反應(yīng),造成大量的假陽性[5-6]。近些年來,PCR技術(shù)已經(jīng)逐漸成熟,用以檢測血液中梨形蟲DNA的分子方法具有較高的靈敏度和特異性,已被證明是進行流行病學(xué)調(diào)查的有力工具。本研究旨在調(diào)查小海子墾區(qū)牛梨形蟲具體病原種類,以采集牛血液樣本作為研究對象,應(yīng)用PCR技術(shù)揭示該區(qū)域梨形蟲種群分布,形成該區(qū)潛在或外來入侵病原對人畜健康、公共衛(wèi)生安全的風(fēng)險評估及預(yù)警報告。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 樣品 2020年5月至2020年11月在新疆小海子墾區(qū)7個采樣點(紅旗農(nóng)場、東風(fēng)農(nóng)場、葉城牧場、伽師總場、44團、45團、51團)共采集??鼓?68份,使用一次性靜脈采血針和EDTA抗凝管采集動物頸靜脈血,帶回實驗室放置-20 ℃冰箱進行冷凍保存,并進行相關(guān)檢測。

    1.1.2 主要儀器與試劑 梯度PCR儀,賽默飛公司產(chǎn)品;凝膠成像儀,美國Bio-Rad公司產(chǎn)品;血液/細胞/組織基因組DAN提取試劑盒,天根(TIANGEN)生化科技有限公司產(chǎn)品;DNA標準DL 2 000,TaKaRa公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 基因組DNA的提取 取200 μL抗凝血置于1.5 mL PE管中,并按照血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書來提取DNA。

    1.2.2 牛梨形蟲18S rRNA基因擴增 引物參考已發(fā)表的巴貝斯蟲和泰勒蟲18S rRNA特異性引物[7-8](表1),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(20 μL):Mix 10 μL,ddH2O 8 μL,模板DNA 1 μL,上、下游引物各0.5 μL。巴貝斯蟲反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 1 min,62 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共30個循環(huán);72 ℃ 5 min。泰勒蟲反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 45 s,58 ℃ 1 min,72 ℃ 90 s,共30個循環(huán);72 ℃ 10 min。最后取10 μL PCR產(chǎn)物進行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

    表1 引物序列及目的片段長度

    1.2.3 序列測定與分析 將PCR陽性擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。登錄美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站,通過Blast進行基因的同源序列對比。應(yīng)用Clustal W軟件進行多序列比對,最后利用MEGA7軟件,使用鄰接法(Neighbor-joinning)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,其自展值檢驗(Bootstrap test)為1 000。

    2 結(jié)果

    2.1 牛梨形蟲不同地區(qū)檢測結(jié)果

    使用巴貝斯蟲和泰勒蟲特異性引物對于小海子墾區(qū)568份牛血樣品進行PCR檢測,經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳,共檢測出44份陽性樣品,總陽性率在7.75%。其中45團的牛感染率較高,約14.58%;葉城牧場與53團的牛感染率較低,均在5%以下;46團的牛未發(fā)現(xiàn)梨形蟲。不同地區(qū)牛梨形蟲檢測率見表2。

    表2 小海子墾區(qū)各地區(qū)牛泰勒蟲PCR檢測結(jié)果

    2.2 牛梨形蟲種類鑒定

    在568份牛血樣中,共檢測出44份陽性樣品。將44份陽性樣品全部送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序,測序結(jié)果在NCBI上進行Blast搜索,結(jié)果顯示,其中42份為環(huán)形泰勒蟲(T.annulata),其余2份為東方泰勒蟲(T.orientalis)。經(jīng)15 g/L凝膠電泳檢測,結(jié)果顯示,泰勒蟲陽性條帶約1 530 bp。凝膠電泳結(jié)果見圖1。

    2.3 牛梨形蟲序列分析

    隨機挑選測序成功的樣本,與GenBank中已經(jīng)注冊的牛梨形蟲18S rRNA序列進行比較,檢出的2種泰勒蟲與GenBank上已發(fā)表的泰勒蟲蟲種序列的同源性均大于97%。以牛巴貝斯蟲未定種新疆株(Babesiasp.Xinjiang,XM029015910)作為外類群,使用MEGA 7軟件,以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn),測定的環(huán)形泰勒蟲(T.annulata)與環(huán)形泰勒蟲意大利株(GenBank登錄號:MT341858)、環(huán)形泰勒蟲喀什株(GenBank登錄號:MK415058)的同源性均為100%。測定的東方泰勒蟲(T.orientalis)與東方泰勒蟲東北株(GenBank登錄號:HM538201)、東方泰勒蟲巴基斯坦株(GenBank登錄號:MG599096)的同源性均為99%。2種泰勒蟲系統(tǒng)發(fā)育進化樹見圖2和圖3。

    M.DNA 標準DL 2 000;1~5.陽性樣本; 6.陽性對照; 7.陰性對照

    圖2 基于環(huán)形泰勒蟲18S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

    圖3 基于東方泰勒蟲18S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

    3 討論

    小海子墾區(qū)位于新疆葉爾羌河流域下游,地處塔克拉瑪干沙漠西北邊緣,屬于暖溫帶大陸性干旱氣候。小海子墾區(qū)作為新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第3師三大墾區(qū)之一,養(yǎng)殖業(yè)為其主要基礎(chǔ)產(chǎn)業(yè),也是重要的經(jīng)濟來源,主要飼養(yǎng)牛、羊等家畜。因其獨特的地理氣候以及豐富的宿主資源,為牛梨形蟲的生存提供了適宜的環(huán)境。

    通過對于牛血樣進行PCR檢測,發(fā)現(xiàn)了環(huán)形泰勒蟲(T.annulata)、東方泰勒蟲(T.orientalis),且環(huán)形泰勒蟲(T.annulata)為優(yōu)勢種,但并未發(fā)現(xiàn)巴貝斯蟲。本文所發(fā)現(xiàn)的環(huán)形泰勒蟲(T.annulata)與環(huán)形泰勒蟲意大利株(GenBank登錄號:MT341858)的同源性為100%,這與王冰潔[9]在吐魯番地區(qū)所發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相同。此外,本文所發(fā)現(xiàn)的環(huán)形泰勒蟲(T.annulata)與環(huán)形泰勒蟲喀什株(GenBank登錄號:MK415058)的同源性也為100%,造成這種結(jié)果的原因可能是由于小海子墾區(qū)與喀什相鄰,兩地牲畜頻繁交易。簡子健等[10]在2006年-2008年曾對全疆14個地、州、市進行了流行病學(xué)調(diào)查,結(jié)果發(fā)現(xiàn)了環(huán)形泰勒蟲(T.annulata)是新疆牛梨形蟲病的主要病原,感染率居高不下(>11%),遍及各個州市,也確定了環(huán)形泰勒蟲(T.annulata)在新疆地區(qū)為優(yōu)勢種。自1930年在俄羅斯發(fā)現(xiàn)東方泰勒蟲(T.orientalis)以來,澳大利亞、日本、韓國、越南、印度等地都有相關(guān)的報道。在我國,東方泰勒蟲主要存在于吉林、遼寧、甘肅、河南、河北、湖南、貴州等地。本文所發(fā)現(xiàn)的東方泰勒蟲(T.orientalis)與東方泰勒蟲東北株(GenBank登錄號:HM538201)、東方泰勒蟲巴基斯坦株(GenBank登錄號:MG599096)的同源性均為99%,證明了新疆地區(qū)也存在東方泰勒蟲(T.orientalis)。但目前新疆地區(qū)有關(guān)東方泰勒蟲(T.orientalis)的報道較少,對于新疆地區(qū)東方泰勒蟲(T.orientalis)的研究有待深入。

    綜上所述,本文對新疆小海子墾區(qū)牛梨形蟲的感染情況和感染蟲種進行了調(diào)查,提供了分子依據(jù),為摸清小海子墾區(qū)牛梨形蟲病基線提供了技術(shù)支撐。

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