血清外泌體miR-122 及miR-194 在心肌梗死患者中診斷早期心衰的價值

孫曉燕，亓良森，趙海鴻，周洪偉，馬 靖

1 北京市大興區(qū)中西醫(yī)結合醫(yī)院 內三科，北京 100076；2 解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學中心 健康醫(yī)學科，北京 100853

作為多種心血管系統(tǒng)疾病的終末期，心力衰竭長期預后總體較差，正成為全球范圍內的公共醫(yī)療負擔[1]，多種危險因素與心力衰竭患病率和發(fā)病率密切相關，包括年齡、肥胖、糖尿病和高血壓，以及既往心血管疾病特別是急性心肌梗死[2]，急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)發(fā)生時常伴隨左心室形態(tài)、大小以及室壁厚度的改變，即左心室重構；左心室重構會進一步引發(fā)惡性心律失常或心力衰竭，進而增加患者死亡率[3]。急診經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI) 是目前臨床上治療急性心肌梗死特別是伴有ST 段抬高型心肌梗死的有效方式，可以快速改善患者梗死部位的血流供應，但術后易發(fā)生心力衰竭，不利于血運再建并最終影響患者預后[4]。因此盡早發(fā)現(xiàn)和診斷AMI 后心衰并進行有效干預有利于提高患者獲益。目前臨床上診斷心力衰竭的標準之一是檢測血液中N-末端腦鈉肽前體(N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP)水平，NT-proBNP 在心室容量負荷以及室壁張力增大、心肌缺血時會大量合成和分泌，且其表達水平與心衰嚴重程度之間存在顯著正相關，屬于心力衰竭診斷和預后預測的關鍵評價指標[5]。外泌體是廣泛存在于人體內多種體液中的一種特殊物質，由于其所包含的微小RNA(microRNA，miRNA)可通過對細胞凋亡的調控實現(xiàn)對血管內皮細胞的功能調節(jié)，在心血管疾病調節(jié)中發(fā)揮重要作用[6]，在病理條件下會發(fā)生顯著變化，因此也屬于潛在的活檢指標之一。其中miR-194、miR-122 分別是富集于腎和肝的外泌體miRNA，臨床研究均證實AMI 患者miRNA 與正常人相比存在差異表達，但兩者表達水平與NTproBNP 濃度以及心衰嚴重程度之間是否存在相關性仍需進一步研究[7]。本研究以AMI 患者作為研究對象，探討血清外泌體miR-122 及miR-194 在心肌梗死早期的動態(tài)變化及兩者對早期心衰的診斷價值，旨在為微小RNA 在AMI 后心衰發(fā)病過程中作用機制以及該疾病的診斷治療、預后評估提供參考價值。

對象和方法

1 研究對象 將北京市大興區(qū)中西醫(yī)結合醫(yī)院2018 年1 月-2020 年6 月收治的96 例急性心肌梗死患者作為研究對象。所有研究對象均在知情同意書上簽字，且本研究得到北京市大興區(qū)中西醫(yī)結合醫(yī)院倫理委員會批準。納入標準：1)診斷為AMI 且于發(fā)病12 h 內接受PCI 術治療[8]；2)心力衰竭患者診斷標準：①表現(xiàn)出疲乏及不同程度呼吸困難等新發(fā)心力衰竭典型臨床癥狀；②有心率加快或奔馬律、肺部濕啰音、頸靜脈充盈或怒張、肢體水腫等體征；③胸部X 線檢查結果顯示胸腔積液、肺淤血或肺水腫；④出現(xiàn)心源性休克[9]；3)無認知功能障礙且年齡 ≥ 18 周歲。排除標準：1)合并嚴重肝、腎功能不全或全身性炎癥者；2)存在嚴重心力衰竭、風濕性心臟病、心肌梗死或心臟瓣膜病等病史；3) 患有先天性心臟病、主動脈夾層；4)患有全身血液疾病、惡性腫瘤或自身免疫性疾??；5)一年內接受重大外科手術或創(chuàng)傷；6)既往接受過冠脈支架置入術。

2 研究方法將入選的96例研究對象根據(jù)AMI 后是否發(fā)生心力衰竭，分為AMI 后發(fā)生心力衰竭組(35 例)和未發(fā)生心力衰竭組(61 例)。檢測并比較兩組患者術后1 h 以及發(fā)病后12 h、20 h、24 h 和48 h 靜脈血血清miR-122、miR-194 水平以及NT-proBNP 濃度，并采用Pearson 相關性分析法分析血清miR-122、miR-194 水平與NT-proBNP濃度之間的相關性。采用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC) 分析患者各時間點的miR-122、miR-194 表達水平對心衰發(fā)生的診斷價值。同時收集兩組患者一般臨床資料并進行比較，主要包括性別、年齡、體質量指數(shù)(body mass index，BMI)、血壓、再灌注時間(指患者AMI 發(fā)病至球囊擴張時間)、腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate，eGFR) 以及高血壓、糖尿病、高脂血癥、心絞痛等病史。

3 血清miR-122、miR-194 水平檢測 采用逆轉錄聚合酶鏈反應技術(RT-PCR)檢測血清miR-122、miR-194 水平，并比較兩組患者PCI 術后1 h 以及發(fā)病后12 h、20 h、24 h 和48 h 的miR-122、miR-194 水平。分別于各時間點采集4 mL 外周肘靜脈血，靜置1 h 后3 000 r/min 離心10 min，取上清液保存于-80℃條件下，待測。按照RNAisoTMPlus 試劑盒步驟提取總RNA，miR-122、miR-194 以及內參U6 引物探針由上海閃晶分子生物有限公司提供，引物序列見表1。采用miRNA 逆轉錄試劑盒(Takara 公司) 逆轉錄miRNA 并進行PCR 擴增，反應條件為95℃預變性5 min，95℃變性20 s，60℃退火20 s，共50 個PCR 循環(huán)。采用ABI Prisme Step-one 熒光定量PCR 儀(Applied Biosystems AB)進行檢測以2-△△ct表示miR-122、miR-194 相對表達量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

4 NT-proBNP 濃度檢測 分別采集所有患者術后1 h 內以及發(fā)病12 h、20 h、24 h、48 h 外周靜脈血5 mL 置于含有抗凝劑(EDTA)的真空采血管中，采用免疫熒光法檢測全血NT-proBNP 濃度(分別計為P1～P5)，檢測試劑盒購自深圳微點生物技術有限公司，測定的濃度范圍為5～5 000 pg/mL。

5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以百分比(%) 表示，采用χ2檢驗。計量資料以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多時點觀測資料比較采用重復測量方差分析。采用Pearson 相關檢驗分析血清miR-122、miR-194 表達水平與NT-proBNP 濃度之間的相關性。采用ROC 分析探討血清miR-122、miR-194水平對預測心力衰竭發(fā)生的診斷價值。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 兩組臨床資料比較 兩組患者的年齡、性別、體質量指數(shù)、eGFR、既往病史以及血壓等一般臨床資料大體相近(P＞ 0.05)；但AMI 后發(fā)生心力衰竭組再灌注時長長于未發(fā)生心衰組(P＜ 0.001)。見表2。

表2 兩組患者一般及臨床資料比較Tab.2 Comparison of general and clinical data between the two groups

2 兩組NT-proBNP 及miR-122、miR-194 水平動態(tài)比較 經(jīng)整體分析(兩因素重復測量方差分析)知各指標的組間、時間及交互作用的整體差異均有統(tǒng)計學意義(P＜ 0.05)。兩兩比較并結合主要數(shù)據(jù)分析，組內比較：兩組術后1 h 以及發(fā)病后12 h、20 h、24 h 和48 h 靜脈血血清NT-proBNP濃度和miR-194 水平均呈先上升后下降趨勢，并于發(fā)病后24 h 達到峰值的單峰趨勢，miR-122 水平呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，發(fā)病后24 h 時間點相對表達水平最低；組間比較：除術后1 h 時間點外，AMI 后發(fā)生心力衰竭組患者各時間點的血清NT-proBNP 濃度、miR-194 水平均高于未發(fā)生心衰組，miR-122 水平低于未發(fā)生心衰組，差異均存在統(tǒng)計學意義(P＜ 0.05)。見表3。

表3 兩組血清NT-proBNP 及miR-122、miR-194 水平動態(tài)比較Tab.3 Dynamic changes of serum NT-proBNP concentration and miR-122 and miR-194 levels between the two groups

3 miR-122 與NT-proBNP 相 關性 分析 Pearson相關性分析結果顯示血清miR-122 表達水平與NT-proBNP 呈負相關(r=-0.667，P=0.012)，血清miR-194 表達水平與NT-proBNP 呈正相關(r=0.854，P=0.004)。見圖1、圖2。

圖1 miR-122 與NT-proBNP 相關性分析Fig.1 Correlation analysis between miR-122 and NT-proBNP

圖2 miR-194 與NT-proBNP 相關性分析Fig.2 Correlation analysis between miR-194 and NT-proBNP

4 各時間點血清miR-122、miR-194 水平對心力衰竭診斷價值分析 將AMI 后是否發(fā)生心力衰竭表征為二分類變量(未發(fā)生=0，發(fā)生=1)，對血清miR-122、miR-194 水平預測心力衰竭發(fā)生的診斷價值進行ROC 分析。結果顯示，除AMI 患者術后1 h miR-122 和miR-194 水平對心衰不具有較佳診斷價值外，其余時間點的miR-122、miR-194 水平對于心衰均具有較高的診斷價值，且以發(fā)病后12 h 診斷價值最高，ROC 曲線下面積分別為0.941(95%CI：0.901～0.965)、0.867(95%CI：0.829～0.906)。見圖3、圖4、表4。

表4 各時間點血清miR-122、miR-194 水平對心力衰竭診斷價值Tab.4 Diagnostic value of serum miR-122,miR-194 for heart failure

圖3 各時間點血清miR-122 水平診斷心力衰竭診斷的ROC 曲線Fig.3 ROC curve of serum miR-122 level in the diagnosis of heart failure at each time point

討論

外泌體最早發(fā)現(xiàn)于1983 年，具有雙層囊泡樣結構，通過細胞的內吞、融合、外排的形式形成，其直徑為30～150 nm[10]。外泌體被多種細胞分泌，并且其內部包含核酸、脂質、特異性蛋白等細胞間的信息分子，最早被認為是細胞排泄的廢棄物[11-12]。近年來隨著對外泌體miRNA 認知的不斷發(fā)展和進步，發(fā)現(xiàn)外泌體攜帶的miRNA 在AMI、心力衰竭等心血管疾病的發(fā)生和進展過程中發(fā)揮重要作用[13]。AMI 發(fā)生后會導致心肌急性缺血甚至壞死，因此心臟收縮力下降、順應性減弱，進而造成心率加快、心肌牽張以及心臟室壁張力負荷升高，從而引發(fā)BNP 呈爆發(fā)式合成及分泌[14]。以往大量臨床研究已經(jīng)證實AMI 發(fā)生后檢測患者血清BNP 濃度對病情評估、臨床治療方案選擇以及患者預后預測具有重要指導價值。但BNP 檢測時間點選取至關重要，選取合適的檢測時間點有利于提高檢測效率和避免資源浪費，更重要的是可以避免檢測時間點選取過晚造成干預措施不及時導致的患者病情延誤[15]。

miR-122 是一種在肝中高表達的miRNA，占據(jù)肝中miRNA 含量70% 左右。近年有研究證實，miR-122-5p 也參與了心衰等心臟疾病的發(fā)生和發(fā)展。徐澤民等[16]通過高通量測序法對心肌梗死后心衰大鼠心肌組織中的miRNA 表達譜進行檢測，研究發(fā)現(xiàn)心衰大鼠心肌中的miR-122 表達量相較于健康大鼠顯著下降，并通過進一步研究證實了miR-122-5p 的促凋亡作用。國外有學者通過qRT-PCR 法對急性心衰患者血清中miR-122 的表達水平進行檢測，證實miR-122 的表達水平呈明顯下降趨勢，且與心衰病程進展程度存在顯著負相關(P＜ 0.05)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，兩組患者術后1 h 以及發(fā)病后12 h、20 h、24 h 和48 h 靜脈血血清NT-proBNP 濃度和miR-194 水平均呈先上升后下降趨勢，并于發(fā)病后24 h 達到峰值的單峰趨勢；miR-122 水平呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，發(fā)病后24 h 時間點相對表達水平最低。且除術后1 h，AMI 后發(fā)生心力衰竭組血清NT-proBNP 濃度以及miR-194 水平高于未發(fā)生心衰組，miR-122 水平低于未發(fā)生心衰組，差異均存在統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。經(jīng)分析，NT-proBNP 該表達趨勢可能與其在AMI 后的特殊合成分泌機制有關，正常人體內的少量BNP 以 BNP 前體(proBNP)形式儲存于心房分泌顆粒中，且血循環(huán)中BNP 濃度一般為10 pg/mL以下，AMI 發(fā)生后心房分泌顆粒中proBNP 發(fā)生快速裂解并釋放入血，表現(xiàn)為早期BNP 升高；AMI 后期發(fā)生心肌壞死，左心室舒張末期壓力大大升高，室壁張力以及心室容量負荷增大，進一步刺激心室中大量BNP 的合成與釋放[18]。Pearson相關性分析結果顯示血清miR-122 表達水平與NT-proBNP 呈顯著負相關，血清miR-194 表達水平與NT-proBNP 呈顯著正相關(r=-0.667，P=0.012；r=0.854，P=0.004)。推測AMI 發(fā)生后外泌體miR-122 及miR-194 濃度動態(tài)演變規(guī)律可能具有相似的分泌機制，但具體分泌機制仍有待進一步研究。

ROC 曲線分析結果顯示，除AMI 患者術后1 h miR-122 和miR-194 水平對心衰不具有較佳診斷價值外，其余時間點的miR-122、miR-194 水平對于心衰均具有較高診斷價值，且以發(fā)病后12 h診斷價值最高，ROC 曲線下面積分別為0.941(95%CI：0.901～0.965)、0.867(95%CI：0.829～0.906)，顯著高于各單項檢測(P＜ 0.05)，診斷效能最佳，同時具有較高的敏感度和特異性。提示不同時間點的miR-122、miR-194 水平診斷心衰的診斷價值存在差異，臨床上若采用上述血清學指標對AMI 超早期(術后1 h)是否發(fā)生心衰進行診斷，診斷效能較低，容易發(fā)生漏診或誤診情況。臨床醫(yī)生在該階段應密切觀察患者臨床癥狀以及體征，并結合患者心功能以及不同時間點血清指標臨界值對心衰進行預測和診斷，從而可以更精準地診斷心衰[19]。本研究仍存在局限性：納入病例數(shù)偏少；心臟超聲檢查可以更準確地評價患者的心臟功能，可以考慮在后續(xù)研究中將其與血清指標結合對心衰進行聯(lián)合診斷，可能更有利提高診斷效能。