血管性癡呆小鼠空間工作記憶障礙的機(jī)制探討

楊惠云，劉迢迢，齊成璽，田 心，張榮信

1 天津醫(yī)科大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，天津 300070；2 廣東藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東廣州 510006

血管性癡呆 (vascular dementia，VaD)是常見(jiàn)的癡呆原因之一，約15%的癡呆病例由血管性癡呆引起，主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙，包括學(xué)習(xí)、記憶、思維功能的降低等[1]。工作記憶是人類(lèi)認(rèn)知的核心部分，空間工作記憶可對(duì)空間信息進(jìn)行暫時(shí)保存和控制，是一個(gè)動(dòng)態(tài)編碼的過(guò)程[2-3]。海馬是空間工作記憶的重要腦區(qū)，是大腦重要的信息處理部位[4-5]。N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptors，NMDAR)是一種離子型谷氨酸受體，對(duì)學(xué)習(xí)、記憶的形成和維持以及神經(jīng)元突觸可塑性至關(guān)重要[6-8]。NMDAR2A 基因是功能性NMDAR 離子通道最主要的組成部分。NMDAR2A 基因敲除的小鼠不但表現(xiàn)出海馬突觸可塑性的減退，而且在水迷宮實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶能力的下降[9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立VaD 小鼠模型，應(yīng)用Longa 評(píng)分法和平衡木行走實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)性評(píng)分，通過(guò)T 迷宮對(duì)小鼠的工作記憶行為學(xué)進(jìn)行分析，氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色法評(píng)價(jià)VaD小鼠的腦梗死體積，應(yīng)用蛋白免疫印跡法對(duì)小鼠海馬蛋白NMDAR2A 表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，以探討VaD 小鼠空間工作記憶障礙的發(fā)病機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康的清潔級(jí)雄性ICR 小鼠16 只，2 月齡，分籠飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物在明/暗周期為12 h/12 h、室溫(23 ±2)℃、濕度55% ± 5%的安靜舒適條件下適應(yīng)飼養(yǎng)3 d，食物和水隨機(jī)獲取。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的倫理規(guī)范。上述小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(8 只)和VaD 組(8 只)。

2 主要儀器與試劑電子天平(瑞 士Mettler Toledo 公司)；純水儀(德國(guó)Millipore 公司)；冷光源(中國(guó)上海精密儀器有限公司)；小動(dòng)物麻醉機(jī)(中國(guó)深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；體視顯微鏡(中國(guó)深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；小鼠腦立體定位儀(中國(guó)深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；蛋白質(zhì)電泳儀(美國(guó)Bio-Rad 公司)；蛋白質(zhì)印 跡轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad 公司)；TTC(美國(guó)Sigma 公司)；異氟烷（中國(guó)深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；小鼠抗-NMDAR2A 抗體(美國(guó)Santa Cruz 公司)；小鼠抗β-actin 抗體(美國(guó)Santa Cruz 公司)。

3 動(dòng)物VaD 模型的制備 小鼠于手術(shù)前8～12 h禁食，不禁水。5%異氟烷對(duì)小鼠進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，2.5%異氟烷維持小鼠的麻醉狀態(tài)。將小鼠仰臥固定，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，并用動(dòng)脈夾夾閉20 min后再灌注10 min，重復(fù)2 次。傷口用慶大霉素處理防止感染，縫合皮膚。術(shù)中注意防止過(guò)分牽拉刺激或損傷迷走神經(jīng)。采用同樣方法分離對(duì)照組小鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈，但不對(duì)其進(jìn)行血管夾閉。兩組小鼠術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)[10]。

4 神經(jīng)功能評(píng)價(jià)VaD模型制備后，采用Longa 評(píng)分法和平衡木行走實(shí)驗(yàn)方法對(duì)小鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)[11-12]。1)Longa 評(píng)分法：評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：正常，記0 分；小鼠出現(xiàn)輕度轉(zhuǎn)圈并伴隨非持續(xù)性翻轉(zhuǎn)，提尾時(shí) <50%的可能性試圖轉(zhuǎn)至對(duì)側(cè)，記1 分；中度持續(xù)轉(zhuǎn)圈，提尾時(shí) >50%的可能性試圖轉(zhuǎn)至對(duì)側(cè)，記2 分；持續(xù)強(qiáng)烈轉(zhuǎn)圈，提尾并保持旋轉(zhuǎn)姿勢(shì)，記3 分；自發(fā)性嚴(yán)重翻轉(zhuǎn)，失去行走能力，記4 分；昏迷或垂死，記5 分。分?jǐn)?shù)越高，表明小鼠的神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。2)平衡木行走實(shí)驗(yàn)：取直徑12 mm，長(zhǎng)約60 cm 的圓柱狀平衡木，放置離地面約1 m 高度，平衡木一端放置一黑箱子，記錄小鼠滑落平衡木的時(shí)間。在正式實(shí)驗(yàn)前，給予每只小鼠30 s 的適應(yīng)時(shí)間。每只小鼠測(cè)試3 次，測(cè)試間隔時(shí)間為5 min。

5 T 迷宮行為學(xué)測(cè)試 小鼠造模后進(jìn)行T 迷宮行為學(xué)工作記憶實(shí)驗(yàn)。T 迷宮由1 條起始臂和2 條目標(biāo)臂拼接組成，目標(biāo)臂呈對(duì)稱(chēng)。小鼠從起始點(diǎn)出發(fā)，交替選擇目標(biāo)臂。在臂的末端放置食物誘導(dǎo)小鼠做出選擇，在起始臂的起始點(diǎn)處有一個(gè)可移動(dòng)閘門(mén)。T 迷宮工作記憶范式由3 個(gè)相位構(gòu)成(圖1)：打開(kāi)閘門(mén)，小鼠從起始點(diǎn)出發(fā)，進(jìn)入T 迷宮的主干臂，隨機(jī)選擇一個(gè)目標(biāo)臂并得到食物獎(jiǎng)勵(lì)，將此次選擇記為起始選擇；小鼠得到獎(jiǎng)勵(lì)后回到起始點(diǎn)，關(guān)閉閘門(mén)，延時(shí)5 s；打開(kāi)閘門(mén)，小鼠再次選擇目標(biāo)臂，若選擇與前一次相同的目標(biāo)臂記為行為學(xué)錯(cuò)誤，若選擇與上一次相反的目標(biāo)臂記為行為學(xué)正確。每只小鼠每天訓(xùn)練1 次，每次訓(xùn)練正確選擇次數(shù)10 次以上。連續(xù)3 d 小鼠選擇正確率達(dá)到80%以上，則代表小鼠形成工作記憶，可停止實(shí)驗(yàn)。

圖1 T 迷宮空間工作記憶范式[13]Fig.1 Schematic of spatial working memory in T-maze task

6 TTC 染色計(jì)算小鼠腦梗死體積 應(yīng)用TTC 染色法對(duì)小鼠腦組織缺血范圍進(jìn)行測(cè)量。小鼠T 迷宮行為學(xué)測(cè)試后，各組隨機(jī)取其中3 只麻醉并斷頸取腦（除去嗅球），于-20℃冰箱中速凍。20 min后取出行冠狀面切片，平均切成5～6 片，厚度約2 mm。隨后將切片浸沒(méi)于2%的TTC 溶液中，于37℃溫箱避光孵育20 min。染色過(guò)程中視腦片染色情況進(jìn)行緩慢翻轉(zhuǎn)，以使腦片進(jìn)行充分染色。正常腦組織染成紅色，缺血或梗死組織則不染色(呈白色)。染色后使用1 × PBS 洗去多余的TTC 溶液，再用4%多聚甲醛固定。采用Image Pro Plus 6.0 測(cè)量腦梗死面積和全腦面積，計(jì)算腦梗死區(qū)域所占百分比 (腦缺血或梗死面積/全腦面積 × 100%)。

7 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)海馬NMDAR2A 蛋白的表達(dá) 小鼠T 迷宮行為學(xué)測(cè)試后，取患側(cè)海馬置于-80℃冰箱保存。需要時(shí)取出，進(jìn)行組織裂解、研磨、超聲破碎，加入蛋白酶抑制劑，冰上孵育20 min。4℃ 16 000 r/min 離心15 min，取上清，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。電泳100 V、2.5 h，轉(zhuǎn)膜400 mA、2 h，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，孵育一抗 (1∶500) 4℃過(guò)夜。第2 天，TBST 緩沖液洗滌3 次 × 10 min，孵育二抗(IgG 1∶5 000) 2 h，TBST 緩沖液洗滌3 次 × 10 min，ECL 發(fā)光液顯影并采集蛋白條帶，通過(guò)Image J 軟件處理分析統(tǒng)計(jì)。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS18.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對(duì)兩組小鼠在T 迷宮的工作記憶行為學(xué)正確率及任務(wù)完成時(shí)間進(jìn)行重復(fù)測(cè)量雙因素方差分析，然后進(jìn)行Bonferroni post hoc 檢驗(yàn)。計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，兩組間行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 兩組小鼠神經(jīng)功能評(píng)價(jià) VaD 小鼠模型制備后，對(duì)小鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。采用Longa 評(píng)分法，對(duì)照組小鼠無(wú)神經(jīng)功能損傷癥狀，VaD 組小鼠的神經(jīng)功能明顯受損(P<0.05)。平衡木行走實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，VaD 組小鼠滑落平衡木的時(shí)間明顯縮短(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 兩組小鼠的神經(jīng)功能評(píng)價(jià)(A：Longa 評(píng)分法對(duì)兩組小鼠的神經(jīng)功能評(píng)價(jià)；B：平衡木實(shí)驗(yàn)對(duì)兩組小鼠的神經(jīng)功能評(píng)價(jià))Fig.2 Comparison of neurological score between the two groups(A:Evaluation of neurological score by Longa method;B:Evaluation of neurological score by balance beam test)

2 兩組小鼠工作記憶行為學(xué)正確率比較 兩組小鼠經(jīng)過(guò)10 d 的工作記憶行為學(xué)訓(xùn)練后，對(duì)照組小鼠的行為學(xué)正確率從訓(xùn)練第1 天的64.81% ±8.02%逐步增加到第10 天的87.3% ± 2.68%，連續(xù)3 d 的工作記憶行為學(xué)正確率均達(dá)到80%以上，說(shuō)明對(duì)照組小鼠經(jīng)過(guò)10 d 的工作記憶任務(wù)訓(xùn)練，形成了工作記憶。VaD 組小鼠在工作記憶訓(xùn)練的10 d 內(nèi)，訓(xùn)練的正確率均沒(méi)有超過(guò)60%。重復(fù)測(cè)量雙因素方差分析顯示，組別因素 × 訓(xùn)練天數(shù)交互效應(yīng)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但兩組間的行為學(xué)正確率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，同時(shí)兩組小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的行為正確率也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。進(jìn)一步對(duì)兩組小鼠在第10 天的工作記憶行為學(xué)正確率進(jìn)行比較，經(jīng)Bonferroni post hoc 檢驗(yàn)，VaD 組小鼠與對(duì)照組相比，行為學(xué)正確率顯著降低(P<0.05)，表明VaD 組小鼠的空間工作記憶能力受到損壞。見(jiàn)圖3。

圖3 兩組小鼠工作記憶行為學(xué)正確率統(tǒng)計(jì)比較(A)及第10 天正確率比較(B)Fig.3 Comparison of accuracy of working memory behavior (A),and accuracy at the 10th day (B) between the two groups

3 兩組小鼠工作記憶任務(wù)完成時(shí)間比較 對(duì)照組小鼠的工作記憶完成時(shí)間由第1 天的 (15.49 ±4.36) s 減少到第10 天的(1.66 ± 0.43) s；VaD 組小鼠在T 迷宮工作記憶的完成時(shí)間由第1 天的(24.82 ± 4.12) s 減少到第10 天的(7.28 ± 1.27) s，重復(fù)測(cè)量雙因素方差分析顯示，組別因素 × 訓(xùn)練天數(shù)交互效應(yīng)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但兩組的完成時(shí)間有顯著性差異(P<0.05)。同時(shí)兩組小鼠在不同時(shí)間的工作記憶任務(wù)完成時(shí)間也有顯著性差異(P<0.05)。對(duì)兩組小鼠第10 天的工作記憶任務(wù)完成時(shí)間進(jìn)行Bonferroni post hoc檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，VaD 組小鼠與對(duì)照組相比，完成時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05)，表明VaD 組小鼠的空間工作記憶能力受到損壞。見(jiàn)圖4。

4 兩組小鼠腦梗死體積比較 經(jīng)TTC 染色后，VaD 組小鼠腦梗死組織呈現(xiàn)白色(圖5A)。與對(duì)照組小鼠相比，VaD 組小鼠的腦梗死體積顯著增加(P<0.05)(圖5B)。

5 兩組小鼠海馬NMDAR2A 蛋白表達(dá)量比較免疫印跡分析顯示，與對(duì)照組相比，VaD 組小鼠海馬NMDAR2A 蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

圖6 兩組小鼠海馬NMDAR2A 表達(dá)量的比較(A：Western blotting結(jié)果；B：定量分析結(jié)果)Fig.6 Comparison of expression of hippocampal NMDAR2A between the two groups (A:Western blotting results;B:Quantitative analysis result)

討論

本研究對(duì)VaD 小鼠空間工作記憶障礙的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，VaD 組小鼠的神經(jīng)功能明顯受損(圖2)，工作記憶行為學(xué)正確率顯著降低(圖3)，工作記憶任務(wù)的完成時(shí)間顯著延長(zhǎng)(圖4)，腦梗死體積顯著增加，海馬NMDAR2A 蛋白表達(dá)水平顯著降低(圖5)。

圖4 兩組小鼠工作記憶行為學(xué)時(shí)間-訓(xùn)練天數(shù)比較(A)及第10 天完成時(shí)間比較(B)Fig.4 Comparison of completion time of working memory behavior(A) and completion time at the 10th day (B) between the two groups

圖5 TTC 染色后腦梗死區(qū)域代表圖(A)及兩組小鼠腦梗死體積比較(B)Fig.5 Representative pictures of TTC stained brain portions for cerebral infarction (A) and comparision of cerebral infarct volume between two groups of mice (B)

VaD 被認(rèn)為是由腦血流量減少引起的進(jìn)行性疾病，是繼阿爾茨海默病之后最常見(jiàn)的癡呆原因之一，并且隨著人口老齡化而增加，越來(lái)越多的老年人患有VaD。VaD 的風(fēng)險(xiǎn)涉及許多危險(xiǎn)因素，包括高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙、心房顫動(dòng)和高同型半胱氨酸血癥[14-16]。研究VaD 的記憶障礙機(jī)制，具有重要的社會(huì)效益和醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。

缺血所致的VaD 會(huì)影響認(rèn)知能力，尤其是執(zhí)行能力[17]。VaD 小鼠在八臂迷宮和T 迷宮實(shí)驗(yàn)中有更高的錯(cuò)誤率，同時(shí)在水迷宮實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期更長(zhǎng)[18-20]。本研究通過(guò)T 迷宮行為學(xué)測(cè)試發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠連續(xù)3 d 的行為學(xué)正確率達(dá)到80%以上，形成了工作記憶；而VaD 組小鼠經(jīng)過(guò)訓(xùn)練沒(méi)有形成工作記憶。同時(shí)對(duì)照組小鼠在T 迷宮中工作記憶行為學(xué)任務(wù)完成時(shí)間顯著短于VaD 組小鼠，表明應(yīng)用頸總動(dòng)脈結(jié)扎再灌注方法能成功制備VaD 小鼠模型，并使其工作記憶能力和執(zhí)行能力遭到損壞。這可能是由于腦缺血后腦組織發(fā)生Ca2+內(nèi)流紊亂，大量Ca2+蓄積在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性作用，并導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，從而影響工作記憶能力和執(zhí)行能力。

海馬在人類(lèi)高級(jí)認(rèn)知活動(dòng)中擔(dān)認(rèn)存儲(chǔ)信息及學(xué)習(xí)記憶的重要作用。腦組織缺血缺氧后，神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生破壞，進(jìn)而導(dǎo)致突觸功能障礙，學(xué)習(xí)記憶功能及認(rèn)知功能下降。Yang 等[21]對(duì)VaD 大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，海馬突觸結(jié)構(gòu)損壞，突觸囊泡數(shù)量降低，突觸后膜增厚且突觸間隙消失，同時(shí)海馬CA3-CA1 突觸的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng) (long-term potentiation，LTP)降低。NMDAR 是一種興奮型氨基酸特異性受體，在大腦信號(hào)傳導(dǎo)和發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，在海馬神經(jīng)元可塑性中發(fā)揮重要作用，并參與LTP 的形成。NMDAR2A 和NMDAR2B 是NMDAR 重要的調(diào)節(jié)亞基，在學(xué)習(xí)記憶中起重要作用[22]。人巨噬細(xì)胞病毒感染大鼠后，海馬NMDAR2A 表達(dá)降低[23]。NMDAR2A 和NMDAR2B 基因敲除后，小鼠海馬突觸可塑性降低，學(xué)習(xí)記憶能力下降，海馬興奮性突觸后電位消失，移植轉(zhuǎn)染NMDAR2B基因細(xì)胞可使大鼠記憶明顯增高[8]。Zhang 等[24]發(fā)現(xiàn)大鼠缺血再灌注后NMDAR2A 表達(dá)量降低。本研究通過(guò)免疫印跡分析方法發(fā)現(xiàn)，VaD 組小鼠海馬區(qū)NMDAR2A 蛋白表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，提示NMDAR2A 表達(dá)量下降在VaD 小鼠空間工作記憶受損中具有不可或缺的作用。

VaD 所致的記憶障礙是一個(gè)極其復(fù)雜的病理過(guò)程，包括氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能障礙、線粒體功能障礙和生長(zhǎng)因子改變等[25-26]。盡管近些年取得了很大進(jìn)展，但仍有一些爭(zhēng)議有待解決，今后應(yīng)對(duì)VaD 記憶功能障礙的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。