急性髓系白血病患者WT1基因表達(dá)水平及其在微小殘留病灶監(jiān)測(cè)中的臨床意義

寧 可，王海峰，徐 莉，李麗寧

(1.西北大學(xué)附屬醫(yī)院 西安市第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710018；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院血液內(nèi)科，陜西 西安 710032)

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)是一種常見(jiàn)的血液系統(tǒng)腫瘤，約占成人急性白血病的60%～70%[1]。盡管化療方案不斷完善和各種新藥相繼出現(xiàn)，AML患者無(wú)病生存率和總生存時(shí)間也不斷提高，但是疾病復(fù)發(fā)仍是治療失敗、影響患者長(zhǎng)期生存的主要原因。白血病患者復(fù)發(fā)的根本原因是體內(nèi)微小殘留病灶(Minimal residual disease，MRD)的存在，患者能否長(zhǎng)期生存與其關(guān)系密切，因此監(jiān)測(cè)MRD對(duì)于AML患者療效評(píng)估、預(yù)后指導(dǎo)和個(gè)體化治療具有重要意義。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative polymerase chain reaction，RQ-PCR)因靈敏度高、特異性強(qiáng)，可以用來(lái)檢測(cè)AML特定融合基因，已經(jīng)成為臨床上監(jiān)測(cè)MRD的常用手段[2-3]，但是超過(guò)50%的AML患者無(wú)特異性分子生物學(xué)標(biāo)志，治療后無(wú)法用RQ-PCR監(jiān)測(cè)MRD。為了尋找基因中AML的預(yù)后指標(biāo)，進(jìn)而連續(xù)監(jiān)測(cè)和動(dòng)態(tài)觀察AML患者的病情變化，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者開(kāi)始研究WT1基因。最早WT1基因是從兒童腎臟腎母細(xì)胞瘤中分離出來(lái)的腫瘤抑癌基因，位于11p13，由10個(gè)外顯子組成，長(zhǎng)度約50 kb。研究[4-6]發(fā)現(xiàn)，WT1基因是調(diào)控造血細(xì)胞增殖和分化的轉(zhuǎn)錄抑制劑，可能在惡性血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生中起重要作用，尤其在大部分AML呈高表達(dá)，而在正常骨髓中少量表達(dá)或者不表達(dá)。因此，WT1基因較早地被認(rèn)為是“泛白血病”基因標(biāo)志，很有希望成為無(wú)特異融合基因標(biāo)記的AML患者M(jìn)RD監(jiān)測(cè)靶點(diǎn)[7-11]。本研究采用RQ-PCR技術(shù)檢測(cè)AML患者體內(nèi)WT1基因的表達(dá)情況，分析WT1與AML分型及臨床病程之間的關(guān)系，探討其作為MRD監(jiān)測(cè)AML預(yù)后的意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年1月至2018年12月空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院血液內(nèi)科收治的初發(fā)AML患者59例(AML組)，其中男性37例，女性22例；年齡15～69歲，中位年齡49歲。所有患者的診斷均符合FAB分型和WHO 2016年血液系統(tǒng)腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)骨髓形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)檢測(cè)等確診。另選取同時(shí)期就診的骨髓分類(lèi)正常的16例患者作為對(duì)照組，其中男性11例，女性5例；年齡23～65歲，中位年齡44歲。兩組患者一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。所有患者均未發(fā)現(xiàn)其他惡性腫瘤或傳染性疾病。

1.2 基因表達(dá)水平檢測(cè) 取EDTA-Na2抗凝的患者骨髓標(biāo)本4 ml，加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后，2000 r/min離心5 min，得到白細(xì)胞沉淀，然后用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水混勻溶解。以此RNA作為PCR反應(yīng)模板，使用美國(guó)安捷倫公司的熒光定量RCR儀(Mx 3000p)檢測(cè)AML患者各階段WT1基因及相關(guān)基因(AML1-ETO、PML-RARa、CBFβ-MYH11)mRNA表達(dá)水平，內(nèi)參基因選用ABL(所有基因定量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海源奇生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別是AML-ETO基因(CA100008)、PML-RARa基因(CA100012)、CBFβ-MYH11基因(CA110010)、WT1基因(CA000022))。同時(shí)檢測(cè)各基因標(biāo)準(zhǔn)品和患者樣本。每次實(shí)驗(yàn)均以ABL基因作為陽(yáng)性對(duì)照，各基因的陰性標(biāo)本作為陰性對(duì)照，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)有效可靠?；虮磉_(dá)水平計(jì)算：目的基因拷貝數(shù)/ABL拷貝數(shù)×100%。

1.3 細(xì)胞遺傳學(xué)檢查 培養(yǎng)患者初發(fā)時(shí)骨髓細(xì)胞，24 h后加入秋水酰胺使分裂細(xì)胞停止在分裂中期，制備染色體標(biāo)本，應(yīng)用G顯帶技術(shù)，在油鏡下分析20個(gè)分裂中期細(xì)胞。根據(jù)《國(guó)際人類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)命名法(ISCN)2005》描述異常核型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。WT1及相關(guān)基因表達(dá)水平以M(P0，P100)表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。各基因間相關(guān)性分析采用Pearson法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者WT1基因表達(dá)水平比較 對(duì)照組骨髓WT1基因表達(dá)水平為0.21%(0%，0.53%)，AML組骨髓WT1基因表達(dá)水平為43.32%(0.56%，98.06%)，AML組WT1基因表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn)資料，將WT1閾值設(shè)為WT1 mRNA≥0.60%[2]。

2.2 不同臨床特征AML患者WT1基因表達(dá)水平比較 見(jiàn)表1。不同年齡、性別及白細(xì)胞計(jì)數(shù)AML患者WT1基因表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。FAB分型中，M3與M4型患者WT1基因表達(dá)水平較高，但兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與M2型患者比較，M3型患者WT1基因表達(dá)水平較高，M5型患者WT1基因表達(dá)水平較低(均P<0.05)；M5型患者WT1基因表達(dá)水平亦低于M4型患者(P<0.05)。

表1 不同臨床特征AML患者WT1基因表達(dá)水平比較(%)

2.3 不同核型AML患者WT1基因表達(dá)水平比較 見(jiàn)表2。異常核型檢出率為64.4%(38/59)，異常核型患者WT1基因表達(dá)水平高于正常核型患者(P<0.05)。在38例異常核型AML患者中，核型包括復(fù)雜核型、t(8；21)/AML1-ETO、t(15；17)/PML-RARa、t(16；16)/CBFβ-MYH11四種類(lèi)型。t(15；17)/PML-RARa和t(16；16)/CBFβ-MYH11患者WT1基因表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。復(fù)雜核型和t(8；21)/AML1-ETO患者WT1基因表達(dá)水平低于t(15；17)/PML-RARa患者(均P<0.05)。

表2 不同核型AML患者WT1基因表達(dá)水平比較(%)

2.4 AML患者WT1與AML1-ETO、CBFβ-MYH11基因表達(dá)水平相關(guān)性分析 急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)是AML的一種特殊亞型，靶向藥物全反式維甲酸、三氧化二砷聯(lián)合常規(guī)化療使得APL成為可被治愈的急性白血病，因此本研究?jī)H將AML1-ETO、CBFβ-MYH11基因作為研究對(duì)象。將11例AML伴AML1-ETO患者治療前后標(biāo)本51份與3例AML伴CBFβ-MYH11患者治療前后標(biāo)本10份進(jìn)行RQ-PCR。病例跟蹤結(jié)果包括持續(xù)緩解和血液學(xué)復(fù)發(fā)兩種情況。AML1-ETO陽(yáng)性患者中，持續(xù)緩解的6例患者30份標(biāo)本AML1-ETO與WT1基因表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.76，P<0.05)；4例血液學(xué)復(fù)發(fā)患者治療前后15份標(biāo)本W(wǎng)T1與AML1-ETO基因表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.81，P<0.05)；而有1例血液學(xué)復(fù)發(fā)患者6份標(biāo)本AML1-ETO升高而WT1基因未升高，仍在初始表達(dá)水平(1.27%)附近浮動(dòng)，且兩者沒(méi)有相關(guān)性。CBFβ-MYH11陽(yáng)性患者中，CBFβ-MYH11與WT1基因表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.74，P<0.05)。

3 討 論

AML是一種高度異質(zhì)性疾病，不同F(xiàn)AB亞型有不同的治療效果，即使相同亞型也可能出現(xiàn)截然不同的疾病轉(zhuǎn)歸，因此監(jiān)測(cè)MRD對(duì)于識(shí)別高?；颊?、了解疾病緩解程度和預(yù)測(cè)早期復(fù)發(fā)具有十分重要的意義。MRD定期監(jiān)測(cè)及評(píng)估是白血病治療過(guò)程中的重要一環(huán)。熒光原位雜交、流式細(xì)胞術(shù)和RQ-PCR都可以進(jìn)行MRD檢測(cè)，但目前RQ-PCR是敏感度較高的一項(xiàng)技術(shù)，可以達(dá)到103～105，在臨床上通常作為診斷和監(jiān)測(cè)MRD的金標(biāo)準(zhǔn)[3，12]。但是急性白血病分型較多，擁有特異性融合基因的相對(duì)有限，除了部分含有AML1-ETO、PML-RARa、CBFβ-MYH11等融合基因外，仍有50%～60%患者并不表現(xiàn)出特異性的分子生物學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)異常[13]，這些患者治療效果的評(píng)價(jià)及治療后MRD的監(jiān)測(cè)相對(duì)比較困難，因此尋找新的分子靶點(diǎn)變得尤為重要。研究[6，13-17]發(fā)現(xiàn)，WT1幾乎在所有的白血病中都有表達(dá)，尤其在超過(guò)70%的AML中高表達(dá)，被認(rèn)為是一種潛在的血液學(xué)腫瘤MRD標(biāo)志物，并且有望用于疾病診斷、預(yù)后判斷及MRD監(jiān)測(cè)。

本研究通過(guò)比較不同臨床特征AML患者WT1基因表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，WT1基因表達(dá)水平高低與AML患者初發(fā)時(shí)的年齡、性別以及發(fā)病時(shí)的白細(xì)胞計(jì)數(shù)沒(méi)有明顯相關(guān)性。關(guān)于AML各亞型之間WT1基因表達(dá)水平的高低，目前普遍認(rèn)為M3型患者WT1基因表達(dá)水平最高，M5型表達(dá)水平最低[18-20]。本研究結(jié)果顯示，M3與M4型患者WT1基因表達(dá)水平較高，但兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與M2型患者比較，M3型患者WT1基因表達(dá)水平較高，M5型患者WT1基因表達(dá)水平較低；M5型患者WT1基因表達(dá)水平亦低于M4型患者。也有學(xué)者認(rèn)為各亞型WT1基因表達(dá)水平比較都無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，各家統(tǒng)計(jì)結(jié)果之間不一致的原因可能是樣本量不夠大，也有可能是在AML診斷方面存在偏差。與此同時(shí)，異常核型患者WT1基因表達(dá)水平高于正常核型患者；t(15；17)和t(16；16)核型AML患者WT1基因表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；復(fù)雜核型和t(8；21)患者WT1基因表達(dá)水平低于t(15；17)患者。

我們跟蹤觀察了11例 AML1-ETO陽(yáng)性AML患者51份標(biāo)本和3例CBFβ-MYH11陽(yáng)性AML患者10份標(biāo)本W(wǎng)T1及AML1-ETO、CBFβ-MYH11融合基因表達(dá)水平的變化，發(fā)現(xiàn)除1例AML1-ETO復(fù)發(fā)患者AML1-ETO水平顯著升高，WT1表達(dá)水平始終在初始水平附近，沒(méi)有提示復(fù)發(fā)外，其他病例WT1變化情況均與疾病發(fā)展呈正相關(guān)。因?yàn)檫@例患者初診時(shí)WT1基因呈低水平表達(dá)(WT1基因初始表達(dá)水平1.27%)，能否將低水平表達(dá)的WT1基因作為監(jiān)測(cè)MRD的指標(biāo)還需要大量的樣本驗(yàn)證。本研究通過(guò)比較完全緩解和復(fù)發(fā)AML患者WT1基因表達(dá)水平變化情況也進(jìn)一步證實(shí)，對(duì)那些無(wú)特異性分子生物學(xué)標(biāo)志的急性白血病來(lái)說(shuō)，WT1基因可以作為白血病細(xì)胞的特異性標(biāo)志監(jiān)測(cè)MRD[6-7，21-22]。

綜上所述，采用RQ-PCR檢測(cè)WT1基因表達(dá)水平，可以監(jiān)測(cè)AML患者M(jìn)RD、評(píng)估治療效果、預(yù)后以及預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。