急性髓系白血病患者巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子表達(dá)水平及其與療效、預(yù)后相關(guān)性分析

馬 兵，張麗紅，趙 丹，尹婉宜，沈 揚(yáng)，董 雯，劉清池

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院血液內(nèi)科，河北 石家莊 050031)

急性髓系白血病(Acute myeloid teukemia，AML)是一種因髓系造血干細(xì)胞改變并導(dǎo)致原始和幼稚髓細(xì)胞比例異常變化的惡性腫瘤[1]。流行病學(xué)研究[2]顯示，AML發(fā)病復(fù)雜，與環(huán)境、遺傳、化學(xué)物質(zhì)接觸等均有關(guān)，占成年急性白血病的80%～90%，且男性發(fā)病率更高。目前，臨床治療AML仍以化療及造血干細(xì)胞移植為主，但治療后完全緩解(Complete remission，CR)僅為50%～70%，預(yù)后較差[3]。另外，大約50%的AML患者染色體檢查正常，但預(yù)后卻存在較大差異，5年內(nèi)生存率為24%～42%[4]。基于此背景，從分子遺傳學(xué)角度探究AML發(fā)病機(jī)制，對患者治療方案的調(diào)整及預(yù)后改善均具有重要意義。巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor，MIF)屬于免疫調(diào)節(jié)因子的一種，可廣泛參與人體炎癥釋放、氧化應(yīng)激、腫瘤形成等病理過程[5]?，F(xiàn)臨床上針對MIF與冠心病、腎癌、慢性阻塞性肺疾病等疾病的關(guān)系已有報(bào)道[6-8]，但其與AML患者預(yù)后的相關(guān)性研究尚無確切定論。因此，本研究探討AML患者M(jìn)IF表達(dá)水平與預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年9月至2019年9月收治的急性髓系白血病(AML)初診患者132例，其中男性81例，女性51例；年齡31～57歲，平均(42.15±5.46)歲；美國西南腫瘤協(xié)作組(SWOG)分型中，良好42例，中危52例，高危38例；美國和英國協(xié)作組(FAB)診斷標(biāo)準(zhǔn)分型中，M1型12例，M2型58例，M4型40例，M5型22例；骨髓幼稚細(xì)胞比例<60%者56例。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《成人急性髓系白血病(非急性早幼粒細(xì)胞白血病)中國診療指南(2017年版)》[9]中AML診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)骨髓細(xì)胞學(xué)、免疫分型、遺傳學(xué)等檢查確診；②自愿簽署知情同意書；③臨床各項(xiàng)檢查資料完整；④年齡≥18歲；⑤初次確診為白血病，并于我院接受柔紅霉素聯(lián)合阿糖胞苷化療誘導(dǎo)及中大劑量阿糖胞苷鞏固治療；⑥染色體核型正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重器官功能衰竭、全身免疫系統(tǒng)疾病、精神類疾病等；②合并其他惡性腫瘤；③合并活動(dòng)性肺結(jié)核或其他器官感染；④哺乳及妊娠期婦女。本研究已通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 骨髓液及外周血標(biāo)本采集：入組患者均于化療前無菌采集骨髓液3 ml，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，淋巴細(xì)胞分離液密度梯度分離單核細(xì)胞，然后以1500 r/min離心5 min，棄上清，-80 ℃保存待測。入院次日清晨采集空腹肘靜脈血5 ml，加入抗凝劑，以3000 r/min離心15 min，留上清，-80 ℃保存待測。

1.2.2 MIF表達(dá)水平檢測：取適量骨髓液及外周血標(biāo)本，加入1 ml總RNA提取試劑TRIzol，混勻后靜置5 min。加入200 μl氯仿，再次震蕩后混勻并靜置5 min。室溫下12000 r/min離心15 min，取上層加入等量異丙醇溶液，震蕩混勻后靜置10 min，12000 r/min離心15 min，棄上層液體，加入75%乙醇溶液多次洗滌。待干后加入焦碳酸二乙酯(DEPC)溶液溶解。采用美譜達(dá)UV-1800PC紫外可見分光光度計(jì)測定總RNA濃度及純度，以O(shè)D260/OD280在1.8～2.0為合格標(biāo)準(zhǔn)。于美國國家生物技術(shù)信息中心建立的DNA序列數(shù)據(jù)庫中檢索MIF序列引物，吸取2 μg總RNA，加入Oligo(dT)再生溶液1 μl、Reaction Mix Easy溶液10 μl、Trans Script兩步法RT-PCR試劑1 μl，并加入去RNA酶水至20 μl，構(gòu)成總反應(yīng)體系。PCR參數(shù)為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 50 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 60 s，共30個(gè)循環(huán)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)作為內(nèi)參?；蛞镄蛄幸姳?。

表1 基因引物序列

1.2.3 療效判定標(biāo)準(zhǔn)：參考《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》第3版[10]，貧血、發(fā)熱、出血等相關(guān)癥狀體征基本消失，男性患者血紅蛋白(Hb)水平≥100 g/L，女性患者Hb水平≥90 g/L，血小板(PLT)水平≥100×109/L，中性粒細(xì)胞絕對值(ANC)≥1.5×109/L，外周血標(biāo)本檢測無白血病細(xì)胞，骨髓原始細(xì)胞比例≤5%，判定為CR；貧血、發(fā)熱、出血等相關(guān)癥狀體征有所改善，生化指標(biāo)檢測中有1項(xiàng)及以上未達(dá)CR標(biāo)準(zhǔn)，5%<骨髓原始細(xì)胞比例≤20%，判定為部分緩解(PR)；臨床癥狀體征及生化指標(biāo)均未達(dá)到以上標(biāo)準(zhǔn)，骨髓原始細(xì)胞比例>20%，判定為未緩解(NR)。有效=CR+PR，無效=NR。

1.3 觀察指標(biāo) 比較不同臨床特征AML患者骨髓液和外周血中MIF表達(dá)水平，臨床特征包括年齡、性別、抗原類型[人類白細(xì)胞DR抗原(HLA-DR)、白細(xì)胞分化抗原(CD)34、CD33、髓過氧化物酶(MPO)、CD13]、骨髓原始細(xì)胞數(shù)；比較不同療效患者M(jìn)IF表達(dá)水平；比較不同MIF表達(dá)水平患者無病生存期(DFS)；分析AML患者M(jìn)IF表達(dá)水平與療效及預(yù)后的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 不同臨床特征AML患者骨髓液和外周血中MIF表達(dá)水平比較 見表2。不同性別及抗原類型的AML患者骨髓液和外周血中MIF表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)?！?5歲AML患者骨髓液及外周血中MIF表達(dá)水平均明顯高于<45歲患者，骨髓原始細(xì)胞數(shù)≥60%的AML患者骨髓液及外周血中MIF表達(dá)水平均明顯高于骨髓原始細(xì)胞數(shù)<60%的患者(均P<0.05)。

表2 不同臨床特征AML患者骨髓液和外周血中MIF表達(dá)水平比較(ng/ml)

2.2 不同療效AML患者骨髓液和外周血中MIF表達(dá)水平比較 見表3。治療有效患者骨髓液及外周血中MIF表達(dá)水平均明顯低于治療無效患者(均P<0.05)。

表3 不同療效AML患者骨髓液和外周血中

2.3 不同MIF表達(dá)水平AML患者DFS比較 以所有患者入院初診時(shí)MIF表達(dá)水平中位數(shù)為臨界值分為高表達(dá)組及低表達(dá)組。高表達(dá)組患者DFS平均(14.25±4.12)個(gè)月，低表達(dá)組DFS平均(17.56±5.24)個(gè)月。高表達(dá)組患者DFS低于低表達(dá)組(t=4.034，P<0.05)。

2.4 MIF表達(dá)水平與AML患者療效及預(yù)后相關(guān)性分析 見表4。Spearman相關(guān)性分析顯示，骨髓液及外周血中MIF表達(dá)水平與AML患者療效及DFS呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)。

表4 MIF表達(dá)水平與AML患者療效及DFS相關(guān)性

3 討 論

AML為高度異質(zhì)性疾病，具有細(xì)胞增殖快、高侵襲性、預(yù)后差等特點(diǎn)[11]。近年來，隨遺傳及生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，臨床對AML發(fā)病、細(xì)胞分化及生物學(xué)行為等的認(rèn)知更為深入，但其發(fā)病機(jī)制仍無法詳細(xì)闡明[12]。炎癥介質(zhì)相關(guān)表達(dá)蛋白可能參與白血病的發(fā)病進(jìn)程，MIF作為其中一種，劉兵華等[13]發(fā)現(xiàn)其水平與冠心病患者冠狀動(dòng)脈狹窄程度具有顯著相關(guān)性，認(rèn)為MIF通過促進(jìn)吞噬細(xì)胞對低密度脂蛋白的氧化作用而加速血栓形成，使得冠心病患者病情惡化。而江曉珍等[14]研究發(fā)現(xiàn)，MIF還可激活磷脂酰肌醇-3-激酶信號通路，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，提示其可能參與腫瘤細(xì)胞的分化與增殖。

p53基因?yàn)槿梭w抑癌基因的一種，為53 kDa的蛋白質(zhì)，野生型可在促使癌細(xì)胞凋亡的同時(shí)控制其增殖分化[15]。但該基因極易突變，可在體外致癌因素誘導(dǎo)下突變，在化療、氧化應(yīng)激、內(nèi)環(huán)境改變等一系列生理應(yīng)激后可激活，發(fā)揮致癌作用[16]。研究[17]發(fā)現(xiàn)p53基因突變可能與MIF的存在有關(guān)。方瑜等[18]認(rèn)為宮頸癌患者M(jìn)IF及p53基因表達(dá)呈協(xié)同作用，這也是MIF參與腫瘤發(fā)生與進(jìn)展的主要原因。本研究結(jié)果顯示，不同性別及抗原類型的AML患者M(jìn)IF表達(dá)水平相當(dāng)，表明MIF在AML患者體內(nèi)表達(dá)無性別差異，且不受抗原類型影響。而≥45歲AML患者骨髓液及外周血中MIF表達(dá)水平高于<45歲患者，骨髓原始細(xì)胞數(shù)≥60%的AML患者骨髓液及外周血中MIF表達(dá)水平高于<60%的患者，分析可能是因?yàn)镸IF參與AML的發(fā)病與進(jìn)展，另外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞主要介導(dǎo)白血病細(xì)胞分化增殖，具有免疫調(diào)節(jié)特性，而中老年患者免疫功能下降，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能更傾向于惡性生物行為，加重病情發(fā)展，導(dǎo)致MIF表達(dá)顯著升高。

MIF作為多重功能的細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素的生理活動(dòng)、促進(jìn)炎癥反應(yīng)加劇、造成血管內(nèi)皮損傷等作用[19]。研究[20]表明，其還可影響細(xì)胞分離，并參與癌基因誘導(dǎo)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)換過程。張娟娟等[21]發(fā)現(xiàn)AML患者M(jìn)IF高度表達(dá)，并證實(shí)其可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞大量表達(dá)白細(xì)胞介素-8，加重炎癥反應(yīng)。但既往研究缺乏MIF與AML患者預(yù)后相關(guān)性的分析，本研究結(jié)果顯示，經(jīng)規(guī)范化治療后療效好的患者骨髓液及外周血中MIF表達(dá)水平更低，且MIF高表達(dá)的AML患者DFS更低，表明MIF確實(shí)隨著AML疾病的進(jìn)展而升高，與其預(yù)后具有一定聯(lián)系。而Spearman相關(guān)性分析顯示，骨髓液及外周血中MIF表達(dá)水平與AML患者療效及DFS呈明顯負(fù)相關(guān)。MIF的作用方式途徑繁多，可通過非經(jīng)典胞吞、激活磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2、阻止p53基因介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。MIF可參與體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)、促炎、細(xì)胞分裂等病理過程，阻止自然殺傷細(xì)胞對白血病細(xì)胞的溶解并加速細(xì)胞增殖，且MIF可由腫瘤細(xì)胞分泌生成，二者互相影響，加重病情惡化。

綜上所述，AML患者M(jìn)IF表達(dá)水平較高，且與療效及患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。早期檢測其表達(dá)情況可為臨床治療方案的制定提供可靠依據(jù)。然而，AML發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，p53基因與MIF相互影響的具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步探究。