恒古骨傷愈合劑對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)、分化的影響及機(jī)制研究

張 瑞，柳圍堤，程自超，杜懷峰

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬3201醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，陜西 漢中 723000)

成骨細(xì)胞介導(dǎo)骨形成，破骨細(xì)胞介導(dǎo)骨吸收，兩者平衡在維持正常骨代謝過程中具有關(guān)鍵作用，調(diào)控該平衡對(duì)防治骨質(zhì)疏松有積極意義[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)系存在于骨髓基質(zhì)的非造血細(xì)胞來源細(xì)胞亞群，骨髓液含量最多，近年來其誘導(dǎo)成骨分化的作用日益引起骨科研究者的重視[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)信號(hào)通路在BMSCs成骨分化中有重要作用，間充質(zhì)干細(xì)胞TGF-β1信號(hào)通路可促成其增殖及成骨分化，成骨細(xì)胞TGF-β1信號(hào)則可調(diào)控成骨晚期分化，參與鈣鹽沉積及膠原分泌過程。Smad蛋白為TGF-β受體作用信號(hào)傳導(dǎo)的中介分子，其中Smad2、Smad3可被TGF-β1受體活化，通過磷酸化方式激活，與Smads4形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)導(dǎo)骨形態(tài)發(fā)生蛋白與受體結(jié)合，協(xié)同影響成骨基因轉(zhuǎn)錄[4]。目前對(duì)中藥調(diào)控TGF-β1/Smads信號(hào)通路的研究相對(duì)少見。恒古骨傷愈合劑主要成分為三七、紅花、黃芪、人參等，早期民間常用于骨病、骨折治療[5-6]。有臨床報(bào)道[7-8]證實(shí)，恒古骨傷愈合劑對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折有肯定的效果，對(duì)改善骨質(zhì)疏松模型動(dòng)物骨微結(jié)構(gòu)有重要意義。但對(duì)于恒古骨傷愈合劑是否存在促骨形成作用及其對(duì)TGF-β1/Smads信號(hào)的調(diào)節(jié)作用，目前尚未明確。因此，本研究應(yīng)用全骨髓貼壁法分離及培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Human bone mesenchymal stem cells，hBMSCs)，并以恒古骨傷愈合劑誘導(dǎo)hBMSCs，探討恒古骨傷愈合劑對(duì)TGF-β1/Smads信號(hào)通路成骨細(xì)胞分化的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源 hBMSCs均取自健康成年志愿者。

1.2 主要試劑 恒古骨傷愈合劑(批號(hào)：Z20025103；云南克雷斯制藥股份有限公司)，胎牛血清(批號(hào)：11011-8611；北京索萊寶科技有限公司)，F(xiàn)12和DEME培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，四氮唑鹽比色(MTT)試劑盒和胰蛋白酶(美國(guó)Bid-Rad公司)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(批號(hào)：12104A46；美國(guó)Thermo Fisher公司)，TRIzol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，RNA抽提試劑盒和DNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Sigma公司)，SYBR Green super Mix(大連寶生生物科技有限公司)，定量PCR試劑盒和引物設(shè)計(jì)及合成(日本TaKaRa公司)，堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，ALP染液(上海碧云天生物科技有限公司)，鼠單克隆Smad2/3/4抗體(一抗)(批號(hào)：AG07244496；美國(guó)Abcam公司)，辣根標(biāo)記羊抗小鼠IgG(二抗)(批號(hào)：No.BSTiZH24C54；美國(guó)Proteintech公司)。

1.3 主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，熒光定量PCR儀(美國(guó)Biometra公司)，DYY-2電泳儀(北京六一儀器廠)，ELX 800型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bid Tek公司)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 取健康志愿者捐獻(xiàn)骨髓，無菌條件下髂后上棘骨穿刺，抽取肝素化骨髓液2～5 ml，全骨髓貼壁法[9]培養(yǎng)hBMSCs，細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%時(shí)按1∶2比例進(jìn)行傳代，吸去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入胰蛋白酶消化30 s，80%細(xì)胞變圓后輕拍培養(yǎng)瓶促使細(xì)胞脫壁，加F12完全培養(yǎng)基3 ml終止消化。細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，1200 r/min離心5 min，棄上清，加3 ml F12培養(yǎng)基重選，按3×104個(gè)細(xì)胞/cm2接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加4 ml F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞均勻貼壁厚，取生長(zhǎng)良好第3代細(xì)胞，按5×103個(gè)/孔接種于96孔板，加完全培養(yǎng)基200 μl/孔培養(yǎng)24 h。細(xì)胞充分貼壁后，PBS洗滌3次，分為對(duì)照組(含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基)和研究組(恒古骨傷愈合劑誘導(dǎo)，1.0 mg/ml)。研究組24 h細(xì)胞周期同步后添加含1.0 mg/ml恒古骨傷愈合劑血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后去培養(yǎng)基，加MTT工作液100 μl，37 ℃培養(yǎng)4 h后棄上清，加100 μl二甲基亞砜，震蕩10 min，分別于48、72、96 h應(yīng)用酶標(biāo)儀于490 nm處讀取吸光度(OD)值，重復(fù)3次取均值，繪制培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞增殖曲線。

1.5 ALP染色 取生長(zhǎng)良好第3代hBMSCs，按5×104個(gè)/孔接種于96孔板，加1.5 ml完全培養(yǎng)基。細(xì)胞貼壁至80%后，對(duì)照組繼續(xù)完全培養(yǎng)基，研究組給予含恒古骨傷愈合劑血清培養(yǎng)基，均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，1周后加ALP染液，37 ℃孵育0.5 h后棄染液，蒸餾水漂洗3次，干燥后封片，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)目的基因相對(duì)表達(dá)量 兩組細(xì)胞培養(yǎng)1周后，參照RNA抽屜試劑盒使用說明提取總RNA。濃度及純度滿意后，1%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA完整性，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-PCR儀測(cè)定TGF-β1、ALP、人Ⅰ型膠原(Col Ⅰ)、骨鈣素(OCN)、核因子-κB活化因子受體配體(RANKL)、破骨細(xì)胞抑制因子(OPG)相對(duì)表達(dá)量。PCR反應(yīng)體系：cDNA 1.0 μg+正反向引物各0.5 μg+雙蒸水10.5 μl+SYBR Green 12.5 μl，引物序列見表1。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性180 s，95 ℃變性30 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min，以GAPDH為內(nèi)參。循環(huán)反應(yīng)完畢后PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，凝膠成像系統(tǒng)成像。以2-△△CT法計(jì)算各目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 各基因引物序列

1.7 Western blot測(cè)定p-smad2/3蛋白表達(dá) 兩組細(xì)胞融合至80%時(shí)，細(xì)胞裂解液裂解提取總蛋白，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量蛋白質(zhì)，每孔30～50 μg，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，PBS沖洗3次，加一抗孵育，4 ℃過夜。洗膜3次，加二抗(1∶5000稀釋)孵育1 h。洗膜3次，化學(xué)發(fā)光法顯色，以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)p-Samd2/3蛋白水平，采用Quantity one軟件分析條帶灰度值，以靶條帶灰度值與內(nèi)參灰度值比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 兩組hBMSCs培養(yǎng)48 h細(xì)胞形態(tài)比較 見圖1。生長(zhǎng)狀態(tài)良好第3代hBMSCs輪廓清晰，細(xì)胞大小均勻，呈長(zhǎng)梭形，聚集化生長(zhǎng)，細(xì)胞間隙增大，呈旋渦或平行排列。恒古骨傷愈合劑培養(yǎng)48 h后細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)閳A形、多邊形，細(xì)胞界限模糊，呈現(xiàn)聚集特點(diǎn)，類似成骨細(xì)胞形態(tài)，見數(shù)量不均微小顆粒物質(zhì)，部分見發(fā)育成熟礦化物。對(duì)照組培養(yǎng)48 h后細(xì)胞形態(tài)呈梭形，突起變長(zhǎng)，分散生長(zhǎng)，細(xì)胞兩極朝向不規(guī)律，可見少量微小顆粒物質(zhì)。

圖1 研究組(左)與對(duì)照組(右)hBMSCs

2.2 兩組hBMSCs培養(yǎng)1周ALP染色結(jié)果比較 見圖2。研究組hBMSCs含藥血清培養(yǎng)1周后ALP染色程度高、顯色范圍廣，對(duì)照組ALP著色弱、強(qiáng)度低，表明研究組hBMSCs分化潛能高。

圖2 研究組(左)與對(duì)照組(右)hBMSCs

2.3 兩組hBMSCs培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞增殖活性比較 見表2。研究組hBMSCs培養(yǎng)不同時(shí)間增殖活性均高于對(duì)照組(F組間=9.785，F(xiàn)時(shí)間=14.265，F(xiàn)交互=12.175，均P<0.05)。

表2 兩組hBMSCs培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞增殖活性比較(%)

2.4 兩組hBMSCs培養(yǎng)1周各目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 見表3。研究組hBMSCs培養(yǎng)1周TGF-β1、Col Ⅰ、OCN、OPG mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，RANKL mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組(均P<0.05)。

2.5 兩組hBMSCs培養(yǎng)1周p-Smad2/3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 見圖3。研究組hBMSCs培養(yǎng)1周后p-Smad2/3蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.465±0.125，對(duì)照組為0.147±0.019，研究組高于對(duì)照組(t=5.623，P<0.001)。

表3 兩組hBMSCs培養(yǎng)1周各目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：左圖為p-Smad2/3蛋白電泳圖；右圖中，與對(duì)照組比較，*P<0.05

3 討 論

調(diào)查[10-11]顯示，我國(guó)有超過90%人群無法從日常飲食中攝取足夠的鈣，骨質(zhì)疏松已成為威脅公眾健康的重要問題。骨質(zhì)疏松屬退行性老年疾病，表現(xiàn)為骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞，其發(fā)病主要與破骨細(xì)胞活性上升、骨吸收增多、成骨分化減少有關(guān)，導(dǎo)致成骨細(xì)胞功能衰竭、骨形成減少，造成骨代謝負(fù)平衡，故理想的治療骨質(zhì)疏松藥物需圍繞促骨形成展開，輔以抑制骨吸收。目前多應(yīng)用雙磷酸鹽類、雌激素類藥物等拮抗骨質(zhì)疏松，它們均為抑制骨吸收類藥物，可控制骨吸收，但無明顯促骨形成效應(yīng)，長(zhǎng)期應(yīng)用可能增加頜骨壞死、乳腺癌等發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[12]。重組人甲狀腺激素具有促骨形成作用，但可能誘發(fā)骨肉瘤發(fā)生[13]。中醫(yī)藥以補(bǔ)腎、壯骨及含黃酮類藥物為主，分子生物研究[14]發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥可通過多信號(hào)通路調(diào)控骨吸收、骨形成平衡，進(jìn)而防治骨質(zhì)疏松。李建國(guó)等[15]研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿提取物及其總黃酮可促進(jìn)BMSCs成骨分化，上調(diào)Col Ⅰ、TGF-β1等成骨細(xì)胞特異性分子表達(dá)。李三華等[16]應(yīng)用杜仲醇提取物誘導(dǎo)BMSCs，發(fā)現(xiàn)其可上調(diào)成骨分化因子表達(dá)。以上均顯示中醫(yī)藥在防治骨質(zhì)疏松方面有較好的前景。

已有文獻(xiàn)[17]報(bào)道，恒古骨傷愈合劑可促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟及增殖。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[18]證實(shí)，恒古骨傷愈合劑可促進(jìn)壞死股骨頭內(nèi)源性骨形成蛋白表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，研究組hBMSCs培養(yǎng)1周后分化潛能較對(duì)照組高，ALP染色增強(qiáng)，細(xì)胞增殖活性隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而上升，推測(cè)恒古骨傷愈合劑可能存在促骨形成效應(yīng)。ALP系成骨成熟的關(guān)鍵標(biāo)志酶，其活性上升提示成骨分化及成熟[19]，而恒古骨傷愈合劑培養(yǎng)后ALP染色增強(qiáng)，推測(cè)恒古骨傷愈合劑可誘導(dǎo)ALP表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。目前臨床公認(rèn)hBMSCs具多向分化潛能，如何誘導(dǎo)其定向分化為成骨細(xì)胞在骨質(zhì)疏松及骨組織重建中有重要意義。我們發(fā)現(xiàn)恒古骨傷愈合劑可誘導(dǎo)其分化，進(jìn)一步觀察其機(jī)制發(fā)現(xiàn)，hBMSCs含恒古骨傷愈合劑血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1周后，成骨特異性標(biāo)志物TGF-β1、Col Ⅰ、OCN mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，破骨細(xì)胞抑制因子OPG mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，破骨分化特異性標(biāo)志物RANKL mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，提示恒古骨傷愈合劑可能存在促進(jìn)骨形成及抑制骨吸收雙重效應(yīng)。TGF-β系調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及細(xì)胞外基質(zhì)合成的關(guān)鍵細(xì)胞因子，其中TGF-β1已被證實(shí)與骨折、骨質(zhì)疏松及動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生緊密相關(guān)[19-20]。但早期TGF-β生物學(xué)功能多集中于組織修復(fù)、炎癥及胚胎發(fā)育等方面[21-22]。近年來發(fā)現(xiàn)，TGF-β對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化起到不同程度的調(diào)節(jié)作用[23-24]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β對(duì)間充質(zhì)起源細(xì)胞有明顯刺激效應(yīng)。骨組織細(xì)胞分泌大量TGF-β1，與跨膜受體結(jié)合形成受體多元體啟動(dòng)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，刺激BMSCs增殖，促使其向成骨分化，實(shí)現(xiàn)骨形成及重建。早期TGF-β1已廣泛應(yīng)用于骨折修復(fù)及骨質(zhì)疏松治療效果評(píng)估中[25]。OCN系成骨細(xì)胞分泌的特異性蛋白，直接反映骨形成及骨轉(zhuǎn)化水平，成骨分化早期以ALP表達(dá)為主，成骨細(xì)胞成熟后期骨橋蛋白出現(xiàn)，分化為骨細(xì)胞，在礦化階段骨橋蛋白及OCN表達(dá)增加。本研究發(fā)現(xiàn)，恒古骨傷愈合劑可促進(jìn)成骨特異性分子TGF-β1、OCN、Col Ⅰ mRNA表達(dá)，提示其有促骨形成作用，考慮恒古骨傷愈合劑可調(diào)控TGF-β1/Smads信號(hào)通路，激活成骨特異性因子表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞特異性分子表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮促骨形成作用。RANKL為破骨細(xì)胞形成的關(guān)鍵因子，可促進(jìn)干細(xì)胞成破骨分化，通過調(diào)控RANKL表達(dá)可抑制骨吸收[26]。我們發(fā)現(xiàn)恒古骨傷愈合劑可抑制破骨相關(guān)抑制RANKL表達(dá)，推測(cè)其可能存在抑制骨吸收效應(yīng)。

Smad家族為TGF-β關(guān)鍵受體，系TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)重要細(xì)胞內(nèi)介質(zhì)，Smad2、Smad3通過C端受體介導(dǎo)磷酸化反應(yīng)后激活，與Smad4形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)節(jié)特異性基因轉(zhuǎn)錄過程。TGF-β激活Smads后細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，間充質(zhì)上皮細(xì)胞發(fā)生遷移。代光明等[27]研究發(fā)現(xiàn)，抑制TGF-β1/Smads通路可抑制成骨分化相關(guān)基因表達(dá)，阻礙成骨細(xì)胞增殖及礦化。在TGF-β1/Smads通路中，Smad2/3參與TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過調(diào)控下游靶基因發(fā)揮促骨形成作用。我們發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)1周后，研究組Smad2/3蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，提示恒古骨傷愈合劑可促進(jìn)Smad2/3蛋白表達(dá)，考慮恒古骨傷愈合劑可通過刺激TGF-β1分泌激活Smad2/3表達(dá)，發(fā)揮促骨形成作用。

綜上所述，恒古骨傷愈合劑很可能是通過上調(diào)TGF-β1/Smads通路成骨細(xì)胞特異性分子基因表達(dá)促進(jìn)骨形成，同時(shí)存在抑制骨吸收效應(yīng)，有望作為骨質(zhì)疏松治療的新靶點(diǎn)，但對(duì)其具體生物學(xué)效應(yīng)尚待進(jìn)一步臨床試驗(yàn)證實(shí)。