銀環(huán)蛇傷中毒巴馬小香豬模型構(gòu)建與評(píng)估

李亞蘭，黃 智，何冬凌，程曉陽，莫財(cái)鋒，宋天麟，廖 明

(廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，廣西 南寧 530021)

毒蛇咬傷中毒是發(fā)展中國(guó)家的一個(gè)主要公共衛(wèi)生問題，全世界每年有180萬～270萬人被蛇咬傷，至少造成10萬人死亡，40萬人致殘。在我國(guó)每年有3萬～40萬人被蛇咬傷，病死率達(dá)5%～10%[1-3]。銀環(huán)蛇是我國(guó)十大毒蛇之一，毒性極強(qiáng)，咬傷中毒致死率居蛇傷首位，病死率為7%～50%[4-6]，如果不及時(shí)提供抗蛇毒血清治療，咬傷后6～30 h即死亡。銀環(huán)蛇咬傷中毒后，雖局部癥狀輕微，但由于銀環(huán)蛇毒主要是神經(jīng)毒素，如果搶救不及時(shí)，病情將迅速惡化，一旦出現(xiàn)呼吸停止，容易造成患者死亡，是急診科一種常見危急重癥[7-9]。目前，對(duì)于銀環(huán)蛇咬傷的研究大多是回顧性的臨床急救與護(hù)理，對(duì)于深入的毒性機(jī)制、代謝變化研究較少，特別是缺乏精準(zhǔn)的動(dòng)物模型以支持更深入的基礎(chǔ)研究，因此亟待構(gòu)建一種成熟穩(wěn)定的銀環(huán)蛇傷中毒動(dòng)物模型。巴馬小香豬作為我國(guó)特有大型哺乳實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源，具有遺傳穩(wěn)定、解剖結(jié)構(gòu)與人類非常類似的優(yōu)勢(shì)，近年來被廣泛應(yīng)用于器官移植等實(shí)驗(yàn)外科研究[10-11]，然而迄今為止還未見銀環(huán)蛇傷中毒巴馬小香豬模型的構(gòu)建。本研究首次以巴馬小香豬構(gòu)建銀環(huán)蛇咬傷中毒動(dòng)物模型；為最大限度地貼合臨床實(shí)際，采用了肌內(nèi)注射銀環(huán)蛇毒方式；通過分析巴馬小香豬生物學(xué)行為狀態(tài)、血常規(guī)及血生化指標(biāo)、組織病理學(xué)變化來評(píng)估模型的穩(wěn)定性，以期為銀環(huán)蛇咬傷中毒基礎(chǔ)研究及臨床治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 KM種小鼠50只，體重18～22 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK桂2014-0003。健康巴馬小香豬24只，體重10 kg左右，由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院提供，許可證號(hào)：SCXK桂2018-0003。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境，室溫20～22 ℃，濕度40%～70%，光照12 h明暗交替。本研究根據(jù)廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)指導(dǎo)，按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》對(duì)動(dòng)物進(jìn)行操作。

1.2 主要試劑及耗材 銀環(huán)蛇毒凍干粉(由廣西醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所提供)，0.9%氯化鈉注射液(山東省辰欣藥業(yè)股份有限公司)，5 ml注射器[北侖河(上海)醫(yī)療技術(shù)有限公司]，一次性真空采血管(平安醫(yī)療器械)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 銀環(huán)蛇毒對(duì)巴馬小香豬理論半數(shù)致死量(LD50)探索：依據(jù)文獻(xiàn)[12-14]，銀環(huán)蛇傷小鼠LD100和LD0為肌內(nèi)注射劑量范圍。通過隨機(jī)數(shù)字表法將50只小鼠分為五組，分別為0.1 mg/kg組、0.075 mg/kg組、0.056 mg/kg組、0.042 mg/kg組、0.032 mg/kg組，每組10只，注射相應(yīng)劑量后連續(xù)觀察7 d，記錄小鼠呼吸暫停時(shí)間及生存率。采用概率單位法(Bliss法)計(jì)算銀環(huán)蛇毒對(duì)小鼠的LD50，按照體表面積比率換算等效劑量法得出銀環(huán)蛇毒對(duì)巴馬小香豬的理論LD50

1.3.2 銀環(huán)蛇毒對(duì)巴馬小香豬理論LD50驗(yàn)證：根據(jù)1.3.1得出銀環(huán)蛇毒對(duì)巴馬小香豬的理論LD50后，將18只健康巴馬小香豬隨機(jī)分為對(duì)照組(0.9%氯化鈉注射液)、0.12 mg/kg組、0.09 mg/kg組、0.06 mg/kg組、0.03 mg/kg組、0.01 mg/kg組，注射相應(yīng)劑量后連續(xù)觀察7 d，記錄巴馬小香豬呼吸暫停時(shí)間及生存率。

1.3.3 銀環(huán)蛇傷中毒巴馬小香豬模型構(gòu)建與評(píng)估：選取健康巴馬小香豬6只，隨機(jī)分為對(duì)照組及模型組，每組3只。對(duì)照組肌內(nèi)注射0.9%氯化鈉注射液，模型組根據(jù)1.3.2結(jié)果肌內(nèi)注射0.03 mg/kg銀環(huán)蛇毒建立銀環(huán)蛇傷中毒巴馬小香豬模型。通過行為學(xué)觀察、血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)和組織病理學(xué)研究對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估。

1.3.3.1 行為學(xué)觀察：建模后，時(shí)刻觀察巴馬小香豬的生物學(xué)行為狀態(tài)，如精神狀態(tài)，對(duì)刺激的反應(yīng)，有無呼吸困難、眼瞼下垂，是否出現(xiàn)四肢癱軟、口腔分泌物增多等情況。

1.3.3.2 血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)：分別于注射蛇毒前以及注射蛇毒后3、12、24 h取小香豬前腔靜脈血用于檢測(cè)超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、肌酸激酶(CK)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌酐(Cr)、碳酸氫根(HCO3-)、鉀離子(K+)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)等指標(biāo)。

1.3.3.3 組織病理學(xué)研究：于實(shí)驗(yàn)72 h后處死巴馬小香豬，采集心、肺、肝、腎及腦組織標(biāo)本，放入10%福爾馬林內(nèi)固定。固定的標(biāo)本經(jīng)充分水洗、酒精脫水和二甲苯透明后，用石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度5 μm，經(jīng)HE染色后做病理組織形態(tài)學(xué)檢查。

2 結(jié) 果

2.1 銀環(huán)蛇毒對(duì)巴馬小香豬的理論LD50根據(jù)各劑量組小鼠7 d內(nèi)死亡情況(表1)，采用Bliss法計(jì)算出銀環(huán)蛇毒對(duì)小鼠肌內(nèi)注射的LD50為0.049 mg/kg，95%置信區(qū)間為0.03795～0.060012 mg/kg。根據(jù)人與動(dòng)物間體表面積折算的等效劑量比值推算，得出銀環(huán)蛇毒對(duì)巴馬小香豬的理論LD50為0.094 mg/kg。

2.2 銀環(huán)蛇毒對(duì)巴馬小香豬理論LD50的驗(yàn)證 注射劑量為0.12 mg/kg時(shí)，巴馬小香豬7 d內(nèi)病死率為100%；注射劑量為0.06、0.09 mg/kg時(shí)，巴馬小香豬病死率為66.67%；注射劑量為0.03 mg/kg時(shí)，巴馬小香豬病死率為33.33%；注射劑量為0.01 mg/kg時(shí)，巴馬小香豬均未出現(xiàn)死亡。從巴馬小香豬肌內(nèi)注射銀環(huán)蛇毒劑量對(duì)應(yīng)的病死率來看，由小鼠推斷出的銀環(huán)蛇毒對(duì)巴馬小香豬的理論LD50可信度較高。同時(shí)，參照常規(guī)毒理學(xué)造模方法、參照銀環(huán)蛇傷中毒臨床病死率7%～50%，以8/25 LD50=0.03 mg/kg作為銀環(huán)蛇傷中毒巴馬小香豬造模劑量。

2.3 兩組巴馬小香豬行為學(xué)變化 與對(duì)照組相比，模型組巴馬小香豬在注射蛇毒后2 h局部傷口癥狀表現(xiàn)不明顯，但出現(xiàn)嗜睡、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、站立不穩(wěn)、呼吸加快、口腔分泌物增多、垂涎等全身中毒癥狀；3 h后出現(xiàn)刺激反應(yīng)減弱、眼瞼下垂、呼吸進(jìn)一步加重、四肢癱軟；隨著中毒時(shí)間的推移，12 h后刺激反應(yīng)極弱、呼吸由快變慢淺、呼吸無力、出現(xiàn)呼吸鳴音、臥地不起。

表1 各組小鼠肌內(nèi)注射銀環(huán)蛇毒7 d內(nèi)死亡情況[只(%)]

2.4 兩組巴馬小香豬血液學(xué)指標(biāo)比較 見表2。與對(duì)照組相比，模型組注射蛇毒后3 h后，WBC、K+顯著降低，ALT、Cr、CK及HCO3-顯著增加(均P<0.05)；注射蛇毒12 h后，RBC顯著增加(P<0.05)；hs-CRP則在注射蛇毒3～24 h內(nèi)維持升高狀態(tài)(均P<0.05)。

表2 兩組巴馬小香豬血液學(xué)指標(biāo)比較

2.5 兩組巴馬小香豬心肌、肺、腦、肝及腎組織HE染色結(jié)果比較 見圖1。對(duì)照組心肌纖維排列尚整齊，肌纖維無腫脹，細(xì)胞核形態(tài)、大小均勻；肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔未見增寬，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；腦組織神經(jīng)元細(xì)胞及星型膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、大小均一正常，核染色質(zhì)均勻，無明顯核周空暈。模型組心肌纖維腫脹，細(xì)胞核形態(tài)、大小不均勻，可見點(diǎn)狀壞死、心肌間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；肺泡結(jié)構(gòu)可見塌陷，肺泡間隔明顯增寬，肺泡上皮細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)濁腫和脂肪變性；腦組織神經(jīng)元細(xì)胞可見急性腫脹、尼氏小體溶解，細(xì)胞空泡變形壞死。對(duì)照組及模型組巴馬小香豬肝腎組織未見明顯異常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細(xì)胞胞質(zhì)豐富，肝細(xì)胞索排列致密整齊；腎小球無皺縮，腎小囊腔無擴(kuò)張，腎間質(zhì)無水腫，間質(zhì)內(nèi)無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

3 討 論

銀環(huán)蛇屬前溝牙毒蛇，毒性劇烈，其蛇毒主要含有α-毒素(α-BTX)、β-毒素(β-BTX)及各種酶等成分。該蛇毒屬神經(jīng)毒素，是一種小分子蛋白質(zhì)或多肽類，可阻斷運(yùn)動(dòng)-肌肉接頭傳導(dǎo)，導(dǎo)致全身肌麻痹、呼吸衰竭[8]。銀環(huán)蛇傷患者局部傷口無紅腫、出血、壞死，但在傷后1～4 h逐漸出現(xiàn)全身性中毒癥狀，腱反射消失，呼吸困難，尿潴留，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)多系統(tǒng)臟器衰竭，導(dǎo)致呼吸停止[15-16]。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，在我國(guó)銀環(huán)蛇咬傷占各類毒蛇咬傷的8.2%，居第五位，而死亡人數(shù)卻居蛇傷首位，尤以華南和華東南部銀環(huán)蛇咬傷的病死率最高[17-19]。目前，對(duì)于銀環(huán)蛇毒這種急性毒，國(guó)內(nèi)外大多以小鼠、大鼠及兔進(jìn)行建模來探究銀環(huán)蛇傷機(jī)制，然而小型動(dòng)物模型具有病程短、不穩(wěn)定、難以長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)分析中毒機(jī)制等不足。巴馬小香豬作為優(yōu)良的地方豬種，具有體型小、遺傳穩(wěn)定、性情溫和、耐飼養(yǎng)、生理特點(diǎn)與人相似等優(yōu)點(diǎn)，常作為病理和藥理實(shí)驗(yàn)的良好載體[20-21]。

A-E：對(duì)照組；F-J；模型組。A、F：心肌組織；B、G：肺組織；C、H：腦組織；D、I：肝組織；E、J：腎組織

本研究利用巴馬小香豬構(gòu)建銀環(huán)蛇傷中毒模型。同時(shí)，為判斷造模是否成功，進(jìn)行了行為學(xué)觀察、血液學(xué)及組織病理學(xué)分析。巴馬小香豬肌內(nèi)注射銀環(huán)蛇毒后，局部中毒癥狀不明顯，2 h內(nèi)出現(xiàn)全身中毒癥狀，包括嗜睡、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、站立不穩(wěn)及口角流涎等現(xiàn)象，此癥狀是由于神經(jīng)毒素中的α-BTX與終板區(qū)膽堿能受體結(jié)合，使乙酰膽堿不能作用于N2受體，從而產(chǎn)生了非去極化型神經(jīng)-肌肉阻斷作用[22-23]；3 h后巴馬小香豬出現(xiàn)刺激反應(yīng)減弱、四肢癱軟、呼吸無力等進(jìn)一步的中毒癥狀。臨床上，銀環(huán)蛇傷患者早期常無明顯癥狀，一般在3～3.6 h出現(xiàn)首發(fā)癥狀，包括咽痛、上瞼下垂、全身肌痛、呼吸困難和吞咽困難，進(jìn)一步發(fā)展將出現(xiàn)腱反射減弱、瞳孔散大、呼吸肌麻痹及四肢癱瘓[24-25]?？梢?，銀環(huán)蛇傷中毒巴馬小香豬模型基本符合銀環(huán)蛇神經(jīng)毒素臨床中毒癥狀。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，注射蛇毒后3 h WBC顯著低于對(duì)照組，CK、hs-CRP則顯著高于對(duì)照組，12 h后RBC顯著升高，可能是由于銀環(huán)蛇毒進(jìn)入血液循環(huán)造成中毒感染、呼吸衰竭、心肺組織病變等導(dǎo)致相關(guān)血液學(xué)指標(biāo)反饋性異常。ALT、Cr、HCO3-于注射蛇毒后3 h顯著升高，K+顯著降低，AST未見明顯變化，提示蛇毒對(duì)于巴馬小香豬體內(nèi)肝腎組織功能可能造成一定影響。病理學(xué)結(jié)果顯示，模型組心肌、肺及腦組織損傷明顯，心肌細(xì)胞明顯排列紊亂，細(xì)胞多渾濁腫脹，肺泡間隔明顯增寬，其間可見大量炎性細(xì)胞滲出，腦組織神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生腫脹，尼氏小體消失，核偏位。病理組織損傷結(jié)果印證了血液學(xué)相關(guān)指標(biāo)的變化，與既往研究[7，26-27]結(jié)果相一致。

綜上所述，以0.03 mg/kg銀環(huán)蛇毒肌內(nèi)注射，可以成功構(gòu)建穩(wěn)定性好、重復(fù)性高、符合臨床特點(diǎn)的銀環(huán)蛇咬傷中毒巴馬小香豬模型。