尼古丁通過α7亞型煙堿型乙酰膽堿受體影響牙周膜干細(xì)胞成骨分化實(shí)驗(yàn)研究

劉 芬，朱 斌，翟 敏，葛 鑫，周志斐

(1.西安交通大學(xué)附屬西北婦女兒童醫(yī)院口腔科，陜西 西安 710061；2.西藏軍區(qū)總醫(yī)院口腔科，西藏 拉薩 850000；3.西安市人民醫(yī)院 西安市第四醫(yī)院口腔科，陜西 西安 710004)

牙周炎是一種導(dǎo)致牙周組織破壞的慢性疾病。若缺乏有效治療，將最終引起牙齒脫落[1]。牙周膜干細(xì)胞(Periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是一種在牙周膜組織中分離出的間充質(zhì)干細(xì)胞亞群，在牙周組織再生中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2]。吸煙是牙周炎的重要高危因素[3]，其可能機(jī)制為：在尼古丁作用下牙周膜細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素(IL)-8等炎性因子，破壞牙周組織的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[4]。α7亞型煙堿型乙酰膽堿受體(α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7 nAChR)是尼古丁的重要受體[5]。前期研究[6]已經(jīng)表明該受體在大鼠和人的牙周組織中存在表達(dá)。因此，α7 nAChR所介導(dǎo)的信號(hào)通路可能是吸煙相關(guān)性牙周炎骨破壞的重要機(jī)制之一。研究[7-8]表明，在人牙槽骨成纖維細(xì)胞中尼古丁還能夠上調(diào)Wnt信號(hào)通路，且PDLSCs中Wnt信號(hào)通路的激活能夠抑制細(xì)胞的成骨分化。由此推測(cè)尼古丁通過表達(dá)于PDLSCs中的α7 nAChR影響下游Wnt通路，從而調(diào)節(jié)PDLSCs的成骨分化，本研究即對(duì)此進(jìn)行觀察，希望能為吸煙相關(guān)性牙周炎的機(jī)制探索提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 自8例患者(12～23歲)獲取14顆因正畸需要而拔除的健康前磨牙和第三磨牙。PDLSCs的分離和培養(yǎng)按照前期研究開展[9]。牙齒用無菌磷酸鹽緩沖液沖洗后自根中1/3刮取牙周膜組織。將牙周膜組織塊接種于6孔板，放置于37 ℃含有95%空氣和5% CO2的孵箱中培養(yǎng)。極限稀釋法挑選能夠形成單細(xì)胞克隆的細(xì)胞集落體外擴(kuò)大培養(yǎng)PDLSCs。第2～4代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究獲本院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 免疫表型分析 按照前期文獻(xiàn)[10]描述的方法對(duì)PDLSCs進(jìn)行干細(xì)胞表面標(biāo)志物分析。取第3代5×105個(gè)PDLSCs孵育抗體1 h。藻紅蛋白發(fā)光的多克隆抗體有抗人CD146(批號(hào)：102419，Biolegend)、CD34(批號(hào)：119328,Biolegend)，CD31(批號(hào)：MA3100,eBioscience)。熒光素異硫酸發(fā)光的多克隆抗體有抗人stro-1(批號(hào)：340101,Biolegend)、CD105(批號(hào)：12-1057-42,eBioscience)、CD90(批號(hào)：45-0909-41,eBioscience)、CD44(批號(hào)：157107,Abcam)和CD14(批號(hào)：17-0141-81,eBioscience)?？贵w孵育在4 ℃環(huán)境下避光進(jìn)行。完成后磷酸鹽緩沖液清洗，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 PDLSCs成骨/成脂誘導(dǎo)分化 按照前期文獻(xiàn)[11]實(shí)驗(yàn)步驟開展PDLSCs成骨/成脂分化誘導(dǎo)。6孔板每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞。成骨誘導(dǎo)液中含100 nmol/L地塞米松(批號(hào)：D4902,Sigma)、50 μg/ml維生素C(批號(hào)：50-81-7,Sigma)和5 mmol/L β-甘油磷酸鈉(批號(hào)：G9422-10G,Sigma)。成脂誘導(dǎo)液中含有0.5 mmol/L甲基異丁基黃嘌呤(批號(hào)：I7018-100mg,Sigma)、0.5 mmol/L氫化可的松(批號(hào)：H0888-1G,Sigma)和60 mmol/L吲哚美辛(批號(hào)：I7378,Sigma)。定向誘導(dǎo)21 d后，用油紅O染液(批號(hào)：O0625-25G，Sigma)或2%茜素紅染液(批號(hào)：A5533-25G，Sigma)對(duì)誘導(dǎo)的細(xì)胞分別進(jìn)行染色。

1.4 細(xì)胞增殖檢測(cè)(WST-1法) 利用WST-1細(xì)胞毒性分析試劑盒檢測(cè)尼古丁(批號(hào)：N3876,Sigma)對(duì)PDLSCs的毒性作用。96孔板每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞，每孔含培養(yǎng)液100 μl。24 h后不同濃度尼古丁作用于細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，以不加尼古丁干預(yù)的細(xì)胞為對(duì)照組。連續(xù)7 d在固定時(shí)間每孔加入10 μl WST-1試劑，避光孵育4 h。在450 nm波長(zhǎng)下讀取每孔吸光度值。

1.5 RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 利用TRIzol試劑(批號(hào)：15596028,Invitrogen)提取PDLSCs總RNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將所得RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系3 μl。按照熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒說明配置PCR反應(yīng)體系。本研究所用基因包括ALP、OCN、Runx2、BSP、β-actin，其中β-actin為內(nèi)參。各基因引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

1.6 蛋白提取和Western blot檢測(cè) 蛋白裂解液提取PDLSCs總蛋白。定量試劑(批號(hào)：P0009,Beyotime)在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度進(jìn)行蛋白定量。Western blot檢測(cè)上樣體系為每泳道40 μg蛋白。Western blot檢測(cè)所用一抗包括抗人ALP一抗(批號(hào)：ab154100,Abcam)、抗人OCN一抗(批號(hào)：ab93876,Abcam)、抗人DKK1一抗(批號(hào)：sc-374574,Santa Cruz)、抗人BSP一抗(批號(hào)：sc-73634,Santa Cruz)、抗人Runx2一抗(批號(hào)：sc-390351,Santa Cruz)、抗人p-GSK-3β一抗(批號(hào)：sc-81496,Santa Cruz)、抗人α7 nAChR一抗(批號(hào)：sc-1447,Santa Cruz)、抗人β-catenin一抗(批號(hào)：D-10A8,Cell Signaling)、抗人GSK-3β一抗(批號(hào)：3D10,Cell Signaling)以及抗人活化β-catenin一抗(批號(hào)：05-665,Millipore)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用雙尾非配對(duì)t檢驗(yàn)比較兩組間數(shù)據(jù)差異。對(duì)于三組及以上數(shù)據(jù)差異，使用單因素方差分析比較，之后用Turkey檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PDLSCs分離與鑒定 PDLSCs能夠形成單細(xì)胞克隆(圖1A)。鏡下可見PDLSCs貼壁生長(zhǎng)(圖1B)。體外定向誘導(dǎo)3周后，細(xì)胞出現(xiàn)成骨及成脂分化(圖1C、D)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，PDLSCs間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44、CD90、CD105、CD146和Stro-1表達(dá)陽性，造血細(xì)胞標(biāo)志物CD34、多核細(xì)胞標(biāo)志物CD14及血小板內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31表達(dá)陰性(圖1E)。

A：極限稀釋法挑選單細(xì)胞克隆集落(甲苯胺藍(lán)染色)；B：PDLSCs貼壁生長(zhǎng)；C：成脂誘導(dǎo)21 d后油紅O染色；D：成骨誘導(dǎo)21 d后茜素紅染色；E：流式細(xì)胞儀檢測(cè)PDLSCs表面分子標(biāo)志物表達(dá)情況

2.2 尼古丁影響PDLSCs形態(tài)并抑制其增殖 對(duì)照組PDLSCs細(xì)胞核清晰(圖2A)。10-3mol/L尼古丁作用24 h后，細(xì)胞內(nèi)可見空泡樣改變(圖2B)。尼古丁濃度為10-4mol/L時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)顆粒狀物質(zhì)增多(圖2C)。當(dāng)尼古丁濃度為10-5、10-6、10-7mol/L時(shí)，細(xì)胞形態(tài)改變不顯著(圖2D-F)。細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果提示10-3mol/L尼古丁作用后，PDLSCs增殖能力顯著下調(diào)(P<0.05)，10-7～10-4mol/L尼古丁作用后PDLSCs增殖能力同樣出現(xiàn)減退(P<0.05)，見圖2G。

A：對(duì)照組PDLSCs形態(tài)；B：10-3 mol/L尼古丁作用后PDLSCs可見空泡狀變性；C-F：10-7～10-4 mol/L尼古丁作用下可見胞漿內(nèi)顆粒狀物質(zhì)增加；G：PDLSCs增殖情況比較，與對(duì)照組相比，*P<0.05，#P<0.01，△P<0.001

2.3 尼古丁通過激活α7 nAChR抑制PDLSCs成骨分化能力 在尼古丁(10-4mol/L)作用下，α7 nAChR表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，而α7 nAChR特異性拮抗劑α-BTX(10-8mol/L)則能部分逆轉(zhuǎn)α7 nAChR表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)(均P<0.05)，見圖3A、B。尼古丁濃度為10-4mol/L時(shí)，PDLSCs形成礦化結(jié)節(jié)的能力顯著下降，而此作用能夠被α-BTX部分逆轉(zhuǎn)(均P<0.05)，見圖3C、D。尼古丁作用14 d后qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，成骨相關(guān)基因ALP、OCN、BSP、Runx2表達(dá)顯著下降，加入α-BTX后尼古丁的抑制作用減弱(均P<0.05)，見圖3E。ALP、OCN、BSP、Runx2蛋白表達(dá)變化呈現(xiàn)類似趨勢(shì)(圖3F)。

2.4 尼古丁通過Wnt/β-catenin通路激活α7 nAChR抑制PDLSCs成骨分化 Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，活化型β-catenin蛋白表達(dá)在尼古丁作用下上調(diào)，在α-BTX協(xié)同作用下表達(dá)減弱；Wnt通路抑制蛋白DKK1和GSK-3β在尼古丁作用后表達(dá)下調(diào)，加入α-BTX后尼古丁作用均減弱；磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)與GSK-3β變化趨勢(shì)相似(均P<0.05)，見圖4。而在DKK1(10 ng/ml)作用下，尼古丁對(duì)PDLSCs成骨分化能力的抑制作用得到逆轉(zhuǎn)，成骨分化相關(guān)基因ALP、OCN、BSP、Runx2及其蛋白表達(dá)變化呈現(xiàn)類似趨勢(shì)(均P<0.05)。

A：qRT-PCR檢測(cè)PDLSCs α7 nAChR基因表達(dá)情況；B：Western blot檢測(cè)α7 nAChR蛋白表達(dá)情況；C、D：茜素紅染色檢測(cè)PDLSCs在尼古丁和(或)α-BTX作用下形成礦化結(jié)節(jié)的能力；E：qRT-PCR檢測(cè)成骨分化相關(guān)基因變化(橫坐標(biāo)由左向右依次為對(duì)照組、尼古丁、尼古丁+α-BTX、α-BTX)；F：Western blot檢測(cè)成骨分化相關(guān)蛋白變化。在A、D、E圖中，組間比較*P<0.05，#P<0.01，△P<0.001

圖4 Western blot檢測(cè)Wnt通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討 論

吸煙可以影響牙周炎的發(fā)生與發(fā)展，表現(xiàn)為更加嚴(yán)重的牙槽骨吸收、牙周附著喪失和更深的牙周袋存留[12-13]。前期研究[5]已經(jīng)證實(shí)煙草中的尼古丁能夠損傷牙周成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致牙周治療預(yù)后不良。然而，現(xiàn)有研究多著眼于尼古丁的破壞作用，而對(duì)尼古丁抑制牙周組織再生關(guān)注較少。在本研究中，我們證實(shí)不同濃度尼古丁均可抑制PDLSCs成骨分化，其機(jī)制可能為尼古丁激活α7 nAChR后上調(diào)p-GSK-3β表達(dá)水平，調(diào)控Wnt信號(hào)通路。

PDLSCs具有一般間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[2]已經(jīng)證實(shí)PDLSCs能夠分化形成成牙骨質(zhì)樣細(xì)胞及牙骨質(zhì)/牙周膜樣組織。類似結(jié)論在小型豬動(dòng)物模型中也得到印證[14]。也有研究[15]表明，自小型豬獲得的PDLSCs能夠自體移植形成牙根-牙周膜復(fù)合結(jié)構(gòu)，獲得類似天然牙的組織學(xué)形態(tài)。PDLSCs由于具有牙周組織再生潛能，是用于牙齒再生領(lǐng)域的理想種子細(xì)胞[16]。本研究同前期研究結(jié)果均表明吸煙者牙周再生療效較差的可能原因，即煙草中的主要毒性物質(zhì)尼古丁破壞了PDLSCs的再生潛能。這一發(fā)現(xiàn)為將來的臨床治療提供了新的目標(biāo)靶點(diǎn)。

α7 nAChR在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和炎性反應(yīng)過程中扮演了重要角色[17]。在其特異性激動(dòng)劑尼古丁作用下，可促進(jìn)機(jī)體分泌乙酰膽堿，從而介導(dǎo)炎性反應(yīng)[18]。此外，尼古丁還可與免疫細(xì)胞中的α7 nAChR直接結(jié)合，調(diào)控促炎因子如腫瘤壞死因子-α的表達(dá)，進(jìn)而影響核因子-κB信號(hào)通路[19]。前期研究[5]提示α7 nAChR同樣表達(dá)于人牙周膜細(xì)胞，尼古丁通過激活該受體能夠上調(diào)促炎因子IL-1β的表達(dá)。還有研究[20]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)尼古丁能夠?qū)е聦?shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠牙槽骨喪失。在此基礎(chǔ)上，研究[5]發(fā)現(xiàn)在大鼠牙周組織中存在α7 nAChR的表達(dá)，在尼古丁作用下該受體表達(dá)將上調(diào)。這些結(jié)果均提示，α7 nAChR在牙周炎發(fā)生與發(fā)展過程中可能發(fā)揮了破壞效應(yīng)。本研究進(jìn)一步證實(shí)，尼古丁同α7 nAChR結(jié)合后，PDLSCs成骨分化相關(guān)基因ALP、OCN、BSP和Runx2及其蛋白的表達(dá)均受到影響，提示PDLSCs中α7 nAChR在尼古丁對(duì)細(xì)胞成骨分化的負(fù)性調(diào)控過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

如前所述，α7 nAChR在炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮了重要作用[17]。在PDLSCs中，尼古丁正是通過該受體使得炎性因子表達(dá)上調(diào)，從而發(fā)揮相應(yīng)破壞作用[5]。本研究結(jié)果還提示，在α7 nAChR同尼古丁結(jié)合后，受體下游Wnt通路發(fā)生激活，PDLSCs的成骨分化能力出現(xiàn)下調(diào)，而這一趨勢(shì)可以被Wnt通路抑制劑DKK1部分逆轉(zhuǎn)，表明α7 nAChR可能通過調(diào)節(jié)DKK1和下游GSK-3β的表達(dá)直接調(diào)控Wnt信號(hào)通路。然而，在后續(xù)研究中，我們?nèi)孕枧懦仔砸蜃釉谶@一過程中可能發(fā)揮的間接作用。

綜上所述，α7 nAChR介導(dǎo)了尼古丁對(duì)PDLSCs成骨分化的負(fù)性調(diào)控。尼古丁作用下Wnt通路的激活參與了這一過程。這一發(fā)現(xiàn)同前期已經(jīng)證實(shí)的Wnt通路能夠抑制PDLSCs成骨分化結(jié)論一致。在后續(xù)研究中，我們將更多關(guān)注α7 nAChR調(diào)控Wnt通路的機(jī)制。此外，非經(jīng)典Wnt通路是否在這一調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮作用也需加以證實(shí)。