牛奶中抗生素殘留檢測試劑盒的優(yōu)化

陳芊汝，朱昱興，寇玲赟，李昀，陶文靖，王瑩

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266109；2.北京美正生物科技有限公司，北京102200)

牛奶是一種古老的天然飲料，營養(yǎng)全面易吸收，具有極高的營養(yǎng)價值。然而，由于奶農(nóng)在奶牛飼養(yǎng)過程中濫用抗生素或?qū)⒖股刈鳛榉栏瘎┲苯犹砑拥脚Ｄ讨?，?dǎo)致牛奶抗生素殘留是目前世界奶業(yè)存在的一個普遍問題[1-3]。長期食用抗生素殘留超標(biāo)的牛奶會提高人體內(nèi)細(xì)菌的耐藥性，破壞人體腸道菌群穩(wěn)態(tài)，引發(fā)相關(guān)疾病，同時降低抗生素藥物的治療效果，危害身體健康[4]。因此對牛奶中抗生素殘留的快速檢測是乳業(yè)監(jiān)管過程中亟需解決的技術(shù)問題。

利用抗生素抑制芽孢桿菌萌發(fā)產(chǎn)酸，在試劑盒中通過指示劑顏色的變化判斷牛奶中是否有抗生素殘留，是目前快速檢測中常用的方法。但該類試劑盒市場長期被國外壟斷，價格昂貴，檢測成本較高。研究團(tuán)隊(duì)前期從山東即墨溫泉中篩選出一株嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus)，本文將以其作為指示菌研制牛奶抗生素殘留快速檢測試劑盒，通過添加固體介質(zhì)和表面活性劑優(yōu)化其液體發(fā)酵方法，提高芽孢產(chǎn)率及產(chǎn)量，降低試劑盒生產(chǎn)成本[5-6]。通過向試劑盒培養(yǎng)基中分別添加不同種類的芽孢激活劑[7-8]，優(yōu)化培養(yǎng)溫度、加樣量，進(jìn)一步縮短試劑盒的響應(yīng)時間，從而提高試劑盒的檢測效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗜熱脂肪地芽孢桿菌(實(shí)驗(yàn)室前期從山東即墨溫泉中篩選得到)，無抗奶(內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司)，營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)，牛肉膏(北京市奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，MnCl2(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，溴甲酚紫、甲氧芐氨嘧啶、次黃嘌呤(上海源葉科技有限公司)，瓊脂粉、Tris、溶菌酶(北京索萊寶科技有限公司)，甘氨酸(河北華陽生物科技有限公司)，胰蛋白胨(賽默飛世爾科技公司)，K2HPO4(天津市鼎盛新化工有限公司)，葡萄糖、阿莫西林、氨芐西林、青霉素G、頭孢氨芐、頭孢噻呋、四環(huán)素、金霉素、土霉素、強(qiáng)力霉素、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺噁唑、磺胺噻唑、鏈霉素、慶大霉素、新霉素、卡那霉素、紅霉素、泰樂菌素(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

SHA-B水浴恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司)， pH計(jì)(上海奧豪斯儀器有限公司)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)， TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī)(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

發(fā)酵培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯18 g/L，MnCl20.125 g/L，牛肉膏1.8 g/L。檢測培養(yǎng)基1：瓊脂粉33 g/L，葡萄糖1 g/L，溴甲酚紫10 g/L，用1 mol/L Tris調(diào)pH至8.2。檢測培養(yǎng)基2：甘氨酸與次黃嘌呤質(zhì)量比為1∶2(總量為0.5 g/L)，甲氧芐氨嘧啶4 mg/mL，溶菌酶15 μg/mL，葡萄糖10 g/L，胰蛋白胨5 g/L，K2HPO41 g/L，瓊脂粉10 g/L，溴甲酚紫10 g/L，用1 mol/L Tris調(diào)pH至8.2。

1.3.2 基礎(chǔ)發(fā)酵方法

取一環(huán)活化后的菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基，置于55 ℃，120 r/min水浴搖床培養(yǎng)12 h，進(jìn)行種子液活化。按照10%的接種量，將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于55 ℃，120 r/min水浴搖床培養(yǎng)8 h。

1.3.3 芽孢產(chǎn)率及產(chǎn)量的計(jì)算

將一滴菌懸液用酒精燈固定于載玻片中央，70 ℃條件下滴加質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為7.6%的孔雀石綠，染色10 min后用清水緩慢洗凈。待其干燥后用沙黃復(fù)染5 min，用清水洗凈、烘干，置于100倍鏡下觀察。

取發(fā)酵完畢后的液體發(fā)酵液離心(5 000 r/min，4 ℃，10 min)，棄去上清液。用蒸餾水復(fù)溶，再次離心(5 000 r/min，4 ℃，10 min)。重復(fù)3次后，所得沉淀的質(zhì)量，即為液體發(fā)酵的芽孢產(chǎn)量。

1.3.4 芽孢的制備

將活化后菌種轉(zhuǎn)接至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，嗜熱脂肪地芽孢桿菌置于65 ℃培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水將平板上的菌苔洗下，離心(5 000 r/min，10 min)，棄上清液，按菌體質(zhì)量的5倍復(fù)溶，置于100 ℃保溫30 min，制成芽孢懸液。

1.3.5 試劑盒的制作與檢測

滅菌后的檢測培養(yǎng)基與40 μL/mL芽孢懸液(2.0 × 103CFU/mL)混勻，分裝于300 μL的微孔板中(110 μL/孔)，用膜封板封口，常溫放置20 min，待其凝固后試劑盒制作完成。檢測時取100 μL的奶樣加入上述微孔板中，置于65 ℃下培養(yǎng)。試劑盒本來是紫色的，若樣品中沒有抗生素，在合適溫度下培養(yǎng)芽孢就會萌發(fā)，產(chǎn)酸變成黃色，若檢測樣品中含有抗生素，則芽孢萌發(fā)被抑制，試劑盒顏色不發(fā)生變化，如圖1所示。

圖1 試劑盒培養(yǎng)基的顏色變化Fig. 1 The color change of the detecting culture medium

1.3.6 固體介質(zhì)和表面活性劑對芽孢產(chǎn)率及產(chǎn)量的影響

選擇新鮮干凈的玉米芯，洗凈烘干后，打成碎屑備用；無菌紗布剪成1 cm×1 cm的小塊備用；無菌脫脂棉撕碎備用；瓊脂粉末，備用。在1.3.2基礎(chǔ)發(fā)酵方法的基礎(chǔ)上，一組向發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加2 g/L的上述固體介質(zhì)，另一組分別添加7.5 g/L下述表面活性劑：聚乙二醇(Polyethylene glycol-6000，PEG-6000)、吐溫-80、十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)、十六烷基三乙基溴化銨(Hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)，每組設(shè)置3個重復(fù)，以研究不同固體介質(zhì)和表面活性劑的添加對液體發(fā)酵芽孢產(chǎn)率及產(chǎn)量的影響。

1.3.7 芽孢激活劑和激活條件對響應(yīng)時間的影響

向檢測培養(yǎng)基中分別添加不同種類的糖類、氨基酸類、核苷類芽孢激活劑，每種激活劑添加量為1 g/L。參照1.3.5的方法，進(jìn)行最適芽孢激活劑的選擇。隨后在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行最適檢測條件的探索，分別向試劑盒中添加40～120 μL無抗奶樣，置于55～75 ℃下觀察試劑盒響應(yīng)時間的變化。每組進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，研究不同芽孢激活劑和激活條件對試劑盒響應(yīng)時間的影響。

1.3.8 國內(nèi)外試劑盒效果對比

選擇本試劑盒、國產(chǎn)試劑盒(北京美正生物科技SC007試劑盒)、進(jìn)口試劑盒(荷蘭DSM公司Delvotest?BR試劑盒、西班牙ZEU-INMUNOTEC公司Eclipse 50試劑盒)分別在其規(guī)定培養(yǎng)條件下進(jìn)行不同抗生素藥物檢測限和檢測時間的比較。本試劑盒的培養(yǎng)溫度選擇65 ℃，加樣量為100 μL。每種檢測試劑盒設(shè)置3組平行和1個陰性對照，以陰性對照變黃作為檢測結(jié)束指標(biāo)。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(M ± SD)表示，采用GraphPad Prism 9.0.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分析方法為單因素方差分析和鄧肯多重比較，顯著性水平選擇0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同表面活性劑對液體發(fā)酵芽孢產(chǎn)率及產(chǎn)量的影響

由圖2可知，不同表面活性劑對液體發(fā)酵芽孢產(chǎn)率具有不同影響，對芽孢產(chǎn)量無影響。其中添加PEG-6000時，對芽孢的生成具有促進(jìn)作用，芽孢產(chǎn)率最高(60%)，與空白相比芽孢產(chǎn)率提高了一倍(P<0.05)。而當(dāng)添加吐溫-80、SDS和CTAB時，所用試劑濃度偏高，可能會造成菌體的部分死亡，從而導(dǎo)致芽孢生成量降低，進(jìn)而體現(xiàn)為對芽孢的生成具有抑制作用[9]。

圖2 不同表面活性劑對芽孢產(chǎn)率及產(chǎn)量的影響Fig. 2 Effect of different surfactants on spore yield rate and spore output

2.2 不同固體介質(zhì)對液體發(fā)酵芽孢產(chǎn)率及產(chǎn)量的影響

由圖3可知，不同固體介質(zhì)添加對液體發(fā)酵芽孢產(chǎn)率及產(chǎn)量具有不同影響。與空白相比，四種固體介質(zhì)均具有提高芽孢產(chǎn)率的作用(P<0.05)。其中添加脫脂棉組的芽孢產(chǎn)率和產(chǎn)量為四種介質(zhì)中最高，分別為69.67%和2.03 g/L。添加瓊脂的芽孢產(chǎn)率與脫脂棉介質(zhì)無顯著性差異(P>0.05)，但芽孢產(chǎn)量顯著低于添加脫脂棉(P<0.05)。添加玉米芯與紗布介質(zhì)與空白組的芽孢產(chǎn)量無顯著性差異(P>0.05)。綜上所述，當(dāng)固體介質(zhì)為脫脂棉時，芽孢產(chǎn)率和產(chǎn)量都處于較高水平。

圖3 不同固體介質(zhì)對芽孢產(chǎn)率及產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effect of different solid media on spore yield rate and spore output

2.3 不同糖類激活劑對試劑盒響應(yīng)時間的影響

由圖4可知，不同糖類激活劑對試劑盒響應(yīng)時間具有顯著性影響。與空白組相比，葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖均可縮短試劑盒的響應(yīng)時間(P<0.05)。其中添加葡萄糖激活劑試劑盒響應(yīng)時間最短，為200 min。添加果糖和乳糖試劑盒響應(yīng)時間無顯著性差異(P>0.05)，分別為208 min和213 min?？瞻捉M和蔗糖組的響應(yīng)時間最長且二者無顯著性差異(P>0.05)。綜上所述，葡萄糖為最適糖類激活劑。

圖4 不同糖類激活劑對試劑盒響應(yīng)時間的影響Fig. 4 Effect of different carbohydrate activator on the response time of the kit

2.4 不同氨基酸激活劑對響應(yīng)時間的影響

由圖5可知，不同氨基酸類激活劑對試劑盒響應(yīng)時間具有顯著性影響。與空白組相比，甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的添加均可縮短試劑盒的響應(yīng)時間(P<0.05)。其中添加甘氨酸激活劑試劑盒響應(yīng)時間最短，為181 min。添加丙氨酸和天冬氨酸試劑盒響應(yīng)時間無顯著性差異(P>0.05)，分別為208 min和213 min。添加谷氨酸的試劑盒響應(yīng)時間最長，為221 min。綜上所述，添加甘氨酸試劑盒的響應(yīng)時間最短，因此甘氨酸為最適氨基酸類激活劑。

圖5 不同氨基酸激活劑對試劑盒響應(yīng)時間的影響Fig. 5 Effect of different amino acid activator on the response time of the kit

2.5 不同核苷類激活劑對響應(yīng)時間的影響

由圖6可知，不同核苷類激活劑對試劑盒響應(yīng)時間具有顯著性影響。與空白相比，次黃嘌呤、鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶的添加均可縮短試劑盒的響應(yīng)時間(P<0.05)。其中添加次黃嘌呤激活劑試劑盒響應(yīng)時間最短，為178 min。添加胞嘧啶的試劑盒響應(yīng)時間為190 min。添加鳥嘌呤和胸腺嘧啶試劑盒響應(yīng)時間無顯著性差異(P>0.05)，分別為196 min和193 min。添加腺嘌呤的試劑盒響應(yīng)時間最長為200 min。綜上所述，添加次黃嘌呤試劑盒的響應(yīng)時間最短，因此次黃嘌呤為最適核苷類激活劑。

圖6 不同核苷類激活劑對試劑盒響應(yīng)時間的影響Fig. 6 Effect of different nucleoside activator on the response time of the kit

2.6 甘氨酸與次黃嘌呤結(jié)合對響應(yīng)時間的影響

由上述試驗(yàn)可得，添加最適糖類激活劑葡萄糖的響應(yīng)時間為200 min，最適氨基酸激活劑甘氨酸響應(yīng)時間為181 min，最適核苷類激活劑次黃嘌呤響應(yīng)時間為178 min。研究表明，多種營養(yǎng)素結(jié)合可能會產(chǎn)生協(xié)同作用[10]。由于三類激活劑中，氨基酸和核苷類激活劑效果相對明顯，因此選擇將甘氨酸與次黃嘌呤搭配使用，研究添加不同比例甘氨酸和次黃嘌呤對試劑盒響應(yīng)時間的影響。由圖7可知，當(dāng)甘氨酸與次黃嘌呤的添加比例為1∶2時，試劑盒響應(yīng)時間可縮短至155 min，低于二者單獨(dú)使用。因此甘氨酸與次黃嘌呤結(jié)合使用具有協(xié)同作用，可縮短芽孢萌發(fā)時間，提高試劑盒響應(yīng)速度。

圖7 不同甘氨酸與次黃嘌呤添加比例對試劑盒響應(yīng)時間的影響Fig. 7 Effect of different glycine to hypoxanthine weight ratio on the response time of the kit

2.7 不同檢測溫度對試劑盒響應(yīng)時間的影響

由圖8可知，不同的檢測溫度下試劑盒對無抗奶的響應(yīng)時間不同。當(dāng)檢測溫度在65 ℃時，響應(yīng)時間最短，為155 min。當(dāng)檢測溫度低于65 ℃時，響應(yīng)時間隨著檢測溫度的升高而縮短。當(dāng)檢測溫度高于65 ℃時，響應(yīng)時間上升。70 ℃與75 ℃溫度下，響應(yīng)時間無顯著性差異(P>0.05)。檢測溫度過高或過低，達(dá)不到芽孢最適萌發(fā)溫度，都會阻礙芽孢的萌發(fā)。

圖8 不同檢測溫度對試劑盒響應(yīng)時間的影響Fig. 8 Effect of different test temperature on the response time of the kit

2.8 不同加樣量對試劑盒響應(yīng)時間的影響

由圖9可知，隨著加樣量的增加，響應(yīng)時間減少。當(dāng)加樣量為40 μL時，試劑盒的響應(yīng)時間最長，可能是由于牛奶中包含一定芽孢萌發(fā)所需要的營養(yǎng)，牛奶過少，芽孢所攝取的營養(yǎng)過少，導(dǎo)致響應(yīng)時間延遲。當(dāng)加樣量為80 μL時，響應(yīng)時間為150 min。當(dāng)加樣量大于80 μL時，響應(yīng)時間并未繼續(xù)縮短，甚至產(chǎn)生滲奶現(xiàn)象。因此最適加樣量為80 μL。

圖9 不同加樣量對試劑盒響應(yīng)時間的影響Fig. 9 Effect of different loading volume on the response time of the kit

2.9 與市售國內(nèi)外試劑盒效果對比

如表1和圖10所示，三種市售牛奶抗生素殘留檢測試劑盒的響應(yīng)時間均在165 min左右，而本研究優(yōu)化的試劑盒檢測時間可以縮短到150 min。國產(chǎn)檢測試劑盒對磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、林可霉素、替米考星、螺旋霉素5種抗生素藥物無敏感性；對阿莫西林、鏈霉素、卡那霉素、紅霉素的檢測限過高，超過我國國家標(biāo)準(zhǔn)。荷蘭Delvotest?BR試劑盒對磺胺噁唑、磺胺間甲氧嘧啶無敏感性；對青霉素，四環(huán)素、金霉素、土霉素、強(qiáng)力霉素、磺胺二甲嘧啶、鏈霉素、卡那霉素、螺旋霉素檢測限過高，不符合我國國家標(biāo)準(zhǔn)。西班牙Eclipse 50試劑盒對金霉素、強(qiáng)力霉素、磺胺間甲氧嘧啶、新霉素、替米考星無敏感性；對磺胺二甲嘧啶、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、紅霉素、螺旋霉素檢測限過高，不符合我國國家標(biāo)準(zhǔn)。而本試劑盒除了對磺胺二甲嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶沒有敏感性，對其余21種國標(biāo)要求的抗生素均具有敏感性，且檢測限均符合我國國家標(biāo)準(zhǔn)。后續(xù)仍需要對磺胺類抗生素敏感性的問題進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖10 與國內(nèi)外市售牛奶抗生素檢測試劑盒檢測時間對比Fig. 10 Comparison of the response time withdomestic and foreign commercial milk antibiotic test kits注：不同字母表示不同組間具有顯著性差異(P<0.05)。

表1 與國內(nèi)外市售牛奶抗生素檢測試劑盒的抗生素檢測限對比Table 1 Comparison of the detection limit of domestic and foreign commercial milk antibiotic test kits

3 討論

本研究通過添加表面活性劑、固體介質(zhì)提高液體發(fā)酵制備芽孢的產(chǎn)率和產(chǎn)量，結(jié)果表明，PEG-6000和脫脂棉可提高芽孢產(chǎn)率及產(chǎn)量。PEG-6000可增加嗜熱脂肪地芽孢桿菌液體芽孢產(chǎn)率，可能是由于PEG可促芽孢桿菌生物膜的形成[5]。生物膜的形成可能會導(dǎo)致發(fā)酵液中細(xì)胞密度過高，細(xì)菌代謝產(chǎn)物高度積累，引起細(xì)胞滲透壓過高，使細(xì)菌處于不利環(huán)境中，可能因此誘發(fā)了芽孢的產(chǎn)生[11]。添加脫脂棉等固體介質(zhì)可增加液體發(fā)酵芽孢產(chǎn)量，這與王天云等[4]的研究結(jié)果相似。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，當(dāng)接菌量為10%、添加7.5 g/L PEG-6000、3 g/L脫脂棉、pH為8、培養(yǎng)溫度為55 ℃的培養(yǎng)條件下，發(fā)酵8 h，芽孢產(chǎn)率可達(dá)79%，芽孢產(chǎn)量達(dá)2.5 g/L。該方法可大幅降低商業(yè)化生產(chǎn)牛奶抗生素殘留檢測試劑盒的生產(chǎn)成本。

通過對比不同糖類、氨基酸類、核苷類芽孢激活劑對試劑盒響應(yīng)時間的影響，發(fā)現(xiàn)最適糖類芽孢激活劑為葡萄糖，最適氨基酸芽孢激活劑為甘氨酸，最適核苷類芽孢激活劑為次黃嘌呤，將甘氨酸與次黃嘌呤協(xié)同使用，效果更佳。陳國華等[12]研究表明，誘導(dǎo)蘇云金桿菌萌發(fā)的必需氨基酸為纈氨酸與丙氨酸。李素等[13]研究發(fā)現(xiàn)，僅有葡萄糖可誘導(dǎo)凝結(jié)芽孢桿菌的萌發(fā)?？梢姴煌N所需誘導(dǎo)劑不同，這可能與位于芽孢內(nèi)膜上的營養(yǎng)素受體有關(guān)，不同菌種芽孢內(nèi)膜上的營養(yǎng)素受體和敏感度不同，所能夠結(jié)合的營養(yǎng)素也不同。

另外，試驗(yàn)確定了牛奶抗生素殘留檢測試劑盒的最佳檢測溫度為65 ℃，最適樣品加樣量為80 μL。在與市售國內(nèi)外牛奶抗生素殘留檢測試劑盒對比后發(fā)現(xiàn)，本檢測試劑盒具有靈敏度高、檢測時間短的優(yōu)勢，且制造成本低，具有良好的市場前景和商業(yè)價值。