臭氧水對小鼠急性毒性和蓄積毒性試驗

王群，尹春慶，劉藝丹，王利華，王光

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.榮成市崖頭畜牧獸醫(yī)站，山東榮成 264300)

臭氧作為一種高效廣譜類的抗菌劑，其抑菌作用機理是氧化破壞微生物細胞中的重要組成部分，如細胞壁、細胞膜、線粒體與細胞核等[1]。含有臭氧的水溶液叫做臭氧水，在水中臭氧的半衰期為20 min[2]。臭氧水具有較高的殺菌性能，但是臭氧穩(wěn)定性差、易分解為氧氣，所以使用臭氧水殺菌時應(yīng)盡量使用流動臭氧水，能解決臭氧半衰期短、易揮發(fā)的問題，從而提高臭氧的利用率[3]。臭氧在水中能形成羥自由基，仍具有較強的氧化性[4]。肖彩雯等[5]研究表明，用4 mg/L的臭氧水對串珠菌作用1 min，殺菌率為99.86 %，對煙曲菌作用5 min，殺菌率為99.57 %。與臭氧氣體相比，臭氧水應(yīng)用于養(yǎng)殖場更為便捷，不僅可用于環(huán)境消毒，也可對畜禽飲水進行消毒。如果用于飲用水消毒，臭氧會殘留在水中被畜禽攝入體內(nèi)。為了評價高濃度的臭氧水在畜牧生產(chǎn)上的安全性，本試驗以昆明小白鼠為實驗動物，采用最大給藥法經(jīng)口灌胃進行臭氧水急性毒性試驗，采用劑量遞增法進行臭氧水的蓄積毒性試驗，以確定臭氧水的半數(shù)致死量(Median Lethal Dose，LD50)和蓄積系數(shù)K。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與實驗動物

臭氧水由青島歐帝歐環(huán)?？萍及l(fā)展有限公司生產(chǎn)并提供機器現(xiàn)場制得，經(jīng)在線式溶解臭氧濃度檢測儀(CL7685，淄博愛迪爾測控技術(shù)有限公司)分析，臭氧濃度為≥20 mg/kg。實驗動物為無特定病原體(Specific pathogen Free，SPF)級昆明種小白鼠，購于青島市即墨區(qū)實驗動物和動物實驗中心，生產(chǎn)許可號為scxk(魯)20040001。體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，試驗期內(nèi)自由采食、自由飲水(蒸餾水)，采用自然光照，室溫26～30 ℃。鼠糧購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，為專用全價日糧。

1.2 試驗方法

臭氧水的急性毒性試驗采用最大給藥法。取小鼠20只(雌雄各半)為試驗組，灌注臭氧水前小鼠禁食約12 h，不禁水。試驗組取濃度為≥20 mg/kg的臭氧水按20 g/kg體質(zhì)量限量，一次灌胃，灌胃后禁食約2 h后再正常喂食；另取10只小鼠(雌、雄各半)用純凈水替代臭氧水做對照組。觀察時間為14 d，觀察記錄小鼠的行為活動、精神狀態(tài)、采食飲水以及中毒和死亡情況。

在半數(shù)致死量的測定結(jié)果基礎(chǔ)上，選用體質(zhì)量為18～22 g昆明種小鼠30只，雌、雄各半。其中20只小鼠采用劑量遞增法進行臭氧水的蓄積毒性試驗，按體質(zhì)量計算染毒劑量。第1～4 天小鼠染毒劑量為0.1 LD50，按20 g/kg體質(zhì)量一次灌胃給藥，以后每4 d遞增1.5倍劑量，直至20 d，染毒方案見表1；另取10只小鼠(雌、雄各半)每天按20 g/kg體質(zhì)量灌注純凈水以確定灌注對小鼠的影響。連續(xù)染毒20 d后，若動物死亡未達半數(shù)，染毒累積劑量已達一次LD50的5.3倍，即蓄積系數(shù)大于5.0，試驗即可結(jié)束；若試驗期間動物發(fā)生半數(shù)死亡，則可按表1查得相應(yīng)的染毒累積劑量，并計算累積系數(shù)，按累積系數(shù)的評價標準評價蓄積毒性。

表1 劑量遞增法染毒方案

1.3 檢測指標

在急性毒性試驗中，觀察小鼠中毒癥狀及出現(xiàn)時間，根據(jù)小鼠死亡情況計算半數(shù)致死量LD50。在蓄積毒性試驗中，確定蓄積系數(shù)K。每4 d對所有小鼠進行稱重，統(tǒng)計增重和采食量，試驗結(jié)束后即第21天對小鼠進行屠宰實驗，對心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟進行稱重，并計算相應(yīng)的器官指數(shù)(器官指數(shù)為實驗動物某器官質(zhì)量與其體質(zhì)量之比)。

取小鼠胃組織相同的部位2 cm，用生理鹽水清洗后放入10 mL/L甲醛溶液中進行固定。將已固定好的胃組織經(jīng)修整、水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等步驟后，用蘇木精-伊紅(HE)進行染色，制成胃組織切片。采用光學(xué)顯微鏡(ae-2000，Nikon，日本)觀察切片。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

應(yīng)用Excel 2007，對數(shù)據(jù)進行整理與分析，小鼠的體質(zhì)量、器官指數(shù)采用SAS 9.4軟件中的MIXED過程進行方差分析，分析臭氧水、性別兩個主效應(yīng)及二者的互作效應(yīng)對小鼠生產(chǎn)性能和器官指數(shù)的影響，計算最小二乘均數(shù)及標準誤，檢驗誤差為5%水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 臭氧水的半數(shù)致死量

在試驗進行的14 d內(nèi)，試驗組的小鼠未出現(xiàn)中毒癥狀，觀察期間無小鼠死亡，試驗結(jié)果見表2。由此可判定臭氧水對小鼠一次經(jīng)口LD50為20 g/kg體質(zhì)量，根據(jù)GB15193.3—2014急性毒性劑量分級表，屬實際無毒物質(zhì)。

表2 臭氧水對小鼠的急性毒性試驗

2.2 臭氧水的蓄積系數(shù)

試驗觀察期間小鼠連續(xù)染毒已達到20 d，此時染毒的總劑量已累計達到5倍的LD50以上，小鼠無中毒癥狀和死亡現(xiàn)象，表明臭氧水的蓄積毒性不明顯，因此中止試驗。根據(jù)蓄積系數(shù)分級，判定臭氧水對小鼠蓄積系數(shù)K>5，為弱蓄積性。

2.3 臭氧水灌注對小鼠生長性能的影響

試驗組與對照組小鼠的體質(zhì)量無顯著差異(P>0.05)，故臭氧水灌注處理對小鼠的體質(zhì)量沒有顯著影響(P>0.05)。性別對小鼠體質(zhì)量影響顯著(P<0.05)。第1天時，雄鼠與雌鼠的體質(zhì)量差異不顯著，從第5天開始，雄鼠的體質(zhì)量均顯著高于雌鼠(P<0.05)。

表3 各處理組不同時期小鼠體質(zhì)量的變化

由圖1可以看出，雄鼠的采食高于雌鼠，與對照組相比，試驗組小鼠的采食量有降低的趨勢。

圖1 試驗期內(nèi)各組小鼠的平均日采食量Fig. 1 Average daily feed intake of mice in control and ozone water group in the experimental period

2.4 臭氧水灌注對小鼠器官指數(shù)的影響

小鼠的內(nèi)臟器官指數(shù)見表4。試驗組小鼠的心臟、肝臟、肺臟和腎臟均未見異常，各器官指數(shù)均表現(xiàn)為對照組與試驗組差異不顯著(P>0.05)。性別對小鼠的體質(zhì)量、脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)的影響顯著(P<0.05)，雄鼠的體質(zhì)量顯著高于雌鼠(P<0.05)，脾臟指數(shù)顯著低于雌鼠(P<0.05)，腎臟指數(shù)顯著高于雌鼠(P<0.05)。灌注臭氧水與性別間的互作效應(yīng)不顯著(P>0.05)。

表4 各組小鼠內(nèi)臟器官指數(shù)

2.5 臭氧水灌注對小鼠組織學(xué)檢查的影響

對照組和試驗組的小鼠胃組織切片鏡檢結(jié)果分別見圖2和圖3。檢查結(jié)果表明，試驗組小鼠的胃的黏膜完整，未見有組織學(xué)損傷。

圖2 對照組小鼠胃組織切片(400倍)Fig. 2 Gastric tissue sections of mice in control (400 times)

圖3 試驗組小鼠胃組織切片(400倍)Fig. 3 Gastric tissue sections of micein ozone water group (400 times)

3 討論

3.1 臭氧水半數(shù)致死量和蓄積系數(shù)

臭氧已廣泛用于飲用水的消毒，臭氧水具有強氧化性和抑菌殺菌能力[6]。趙永強等[7]發(fā)現(xiàn)經(jīng)4.5 mg/L濃度的臭氧水處理30 min后的羅非魚片對SD大鼠經(jīng)口最大耐受劑量(MTD)>15 g/kg，毒性分級為無毒。張敏等[8]對含16 mg/L的臭氧消毒水進行毒性試驗，結(jié)果表明16 mg/L臭氧消毒劑為實際無毒、弱蓄積性物質(zhì)，對小鼠骨髓PCE亦無誘變作用，對動物皮膚、眼睛和陰道黏膜均無刺激性，使用安全。本試驗制得的臭氧水經(jīng)在線分析系統(tǒng)分析在20 mg/L以上，對小鼠的急性毒性試驗和蓄積毒性試驗均未發(fā)現(xiàn)小白鼠有中毒癥狀，可以進一步證實臭氧水為實際無毒物質(zhì)，具有弱蓄積性。

3.2 臭氧水對小鼠生長性能的影響

小鼠存在藏料行為，采食量雖然不能真實反映小鼠食入的飼料量，但與小鼠的生長呈正相關(guān)。小鼠的生長性能可以間接反映小鼠的生理狀況，理想的生長性能在一定程度上可以說明身體的機能良好。鄭云燕等[9]研究結(jié)果顯示，10.35～10.95 mg/L的臭氧水對大鼠急性經(jīng)口毒性屬實際無毒類，大鼠亞急性毒性試驗各組動物生長發(fā)育良好，體質(zhì)量增加正常。袁安生等[10]證明，通過臭氧處理飲用水和飼料等的試驗組比沒有處理的對照組的雛雞存活率、飼料利用率以及出欄體質(zhì)量都有顯著的提高。沈林園等[11]研究發(fā)現(xiàn)通過臭氧水處理飲用水后飼喂的雞，發(fā)病現(xiàn)象明顯減少，藥物投入減少，死淘率降低，提高了經(jīng)濟效益。本試驗通過小鼠的體質(zhì)量和采食量也可以證明灌注臭氧水對小鼠無不良影響。但若想用臭氧水作為畜禽的飲用水以此替代抗生素的作用還需要在畜禽生產(chǎn)上進行試驗加以驗證。

3.3 臭氧水對小鼠器官指數(shù)的影響

內(nèi)臟器官指數(shù)可以初步作為評定內(nèi)臟器官是否受到損傷的指標。當內(nèi)臟器官受到損傷會發(fā)生炎性反應(yīng)、壞死或出現(xiàn)水腫，最終表現(xiàn)在重量發(fā)生變化。免疫抑制劑可使脾臟重量減輕，一般免疫藥理學(xué)試驗常以脾臟的增重或減重作為衡量其免疫功能強弱的指標[12]。腎是機體重要的解毒器官，腎功能將直接影響機體解毒機能，岳麗紅等[13]的試驗數(shù)據(jù)為青年組昆明小鼠(體質(zhì)量為31.17 g)的腎臟指數(shù)為15.28，而衰老組的腎臟指數(shù)為16.64。由此可以推斷，本試驗中臭氧水灌注組的小鼠的腎臟較純凈水灌注組更為健康。張永東等[14]從酶學(xué)水平研究了臭氧對肉雞的肺毒性，結(jié)果顯示各臭氧處理組對肺臟均無明顯損傷。本試驗結(jié)果表明純凈水灌注組小鼠的內(nèi)臟器官指數(shù)與臭氧水灌注組之間沒有顯著差異，說明臭氧水灌注對小鼠無不良影響。李玉冰等[15]試驗發(fā)現(xiàn)，臭氧處理30 min、60 min、120 min，在第 30 天和第 60 天采樣小鼠的臟器系數(shù)與對照組比較無顯著性差異。這與本試驗研究結(jié)果相一致。

3.4 臭氧水對小鼠組織學(xué)檢查的影響

在本試驗中，未見臭氧水對小鼠的胃造成損傷。這從組織學(xué)上進一步證實臭氧水的低毒性。而且臭氧作為一個強大的氧化劑，會立即與胃中大量的離子和生物分子即抗氧化劑、蛋白質(zhì)、碳水化合物以及多不飽和脂肪酸結(jié)合白蛋白反應(yīng)，從而降低臭氧的含量，同時也會減少臭氧的毒性。

4 結(jié)論

臭氧水對小鼠經(jīng)口LD50為20 g/kg體質(zhì)量，根據(jù)急性毒性分級，屬實際無毒物質(zhì)；臭氧水對小鼠蓄積系數(shù)K>5，為弱蓄積性；與純凈水灌注組的小鼠相比，臭氧水灌注對小鼠無任何不良影響。