鹽脅迫下AM真菌對西瓜幼苗葉片防御酶和內(nèi)源激素的影響

徐萌麗，楊俊華，謝宏鑫，李敏

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)菌根生物技術(shù)研究所，山東青島266109；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山東青島266109；3. 聊城市農(nóng)業(yè)農(nóng)村發(fā)展服務(wù)中心，山東聊城252000)

鹽脅迫會使細(xì)胞外Na+濃度升高，水勢降低，從而抑制植物根細(xì)胞對水分的吸收，造成生理干旱[1]。植物會通過氧化調(diào)節(jié)、滲透調(diào)節(jié)等方式來適應(yīng)鹽脅迫帶來的危害，當(dāng)植物體處于鹽脅迫下，細(xì)胞質(zhì)中的滲透勢會比外界環(huán)境高，為了避免水分的流失，植物體會積累一些可溶性的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，降低細(xì)胞的滲透勢，維持細(xì)胞對水分的吸收[2]。植物體在鹽脅迫條件下會產(chǎn)生許多活性氧，從而對膜系統(tǒng)造成氧化損傷，但植物體內(nèi)存在活性氧清除系統(tǒng)，其中抗氧化酶是活性氧清除系統(tǒng)中比較重要的組分[3]。植物在逆境條件下會通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的多種內(nèi)源激素水平來適應(yīng)環(huán)境的變化。研究表明，生長素、赤霉素、脫落酸等內(nèi)源激素與植物耐鹽性息息相關(guān)[4-6]。因此在鹽脅迫下防御性酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以及內(nèi)源激素含量的變化與調(diào)控是植物緩解抑制的關(guān)鍵。

叢枝菌根(arbuscular mycorrhiza，AM)真菌能輔助植物應(yīng)對土壤鹽漬化。AM真菌能夠促進(jìn)玉米(ZeamaysL.)、棉花(GossypiumhirsutumL.)、番茄(Solanumlycopersicum)、滇重樓(ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis)部分激素的合成以促進(jìn)植物生長發(fā)育[7-9]。AM真菌增加植物葉片內(nèi)可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞膜內(nèi)外的滲透勢，減少鹽脅迫中的滲透脅迫對植物的影響[10]；同時AM真菌還通過提高防御性酶的活性來緩解鹽脅迫對植物的影響[11-12]。AM真菌能緩解多種植物如番茄、豇豆(Vignaunguiculata)、葡萄(Vitisvinifera)、大豆(Glycinemax)、水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum)和萵苣(Asparaguslettuce)等的鹽脅迫[10-15]。

本研究通過對鹽脅迫下AM真菌對西瓜幼苗防御酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和內(nèi)源激素的影響進(jìn)行分析，為進(jìn)一步揭示AM真菌提高西瓜耐鹽脅迫的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試西瓜品種為‘京欣4號’(北京京研益農(nóng)公司)。

花盆：為塑料花盆(9.7 cm×6.6 cm×9.0 cm)，用0.4%甲醛進(jìn)行浸泡消毒。

栽培基質(zhì)：河沙(青島卓創(chuàng)實驗室服務(wù)有限公司)，過10目口徑篩后用流水反復(fù)沖洗20次，自然風(fēng)干1 d，高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)121 ℃滅菌2 h備用。

供試AM真菌菌劑：AM真菌菌劑為由三葉草擴(kuò)繁的變形球囊霉(Glomusversiforme)，由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)菌根生物技術(shù)研究所提供，每1 mL接種菌劑中約50個孢子。

1.2 試驗材料的培養(yǎng)及處理

試驗在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)科技樓人工氣候室(8: 00至22: 00光照，光照強度400 μmol·m-2·s-1，溫度25 ℃；其余時間黑暗，溫度16 ℃，全天濕度為50%)進(jìn)行盆栽。

西瓜種子洗凈后置于70%乙醇溶液浸泡滅菌5 min，蒸餾水沖洗4次后，30 ℃蒸餾水浸泡8 h，放到鋪濾紙的培養(yǎng)皿中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)催芽。西瓜種子露白后播種于裝有400 g栽培基質(zhì)的花盆內(nèi)。

接種AM真菌處理的花盆，每盆接種50 mL AM真菌菌劑，未接菌的處理則加等量的滅菌菌劑和菌劑濾液，以保持營養(yǎng)物質(zhì)和其他微生物區(qū)系的一致，并與基質(zhì)混勻[16]。每盆播2～3個露白西瓜種子，出苗7 d后每盆保留1株，播種出苗后每3 d澆灌一次1/2 的Hoagland營養(yǎng)液，每盆150 mL。35 d后進(jìn)行試驗處理，試驗設(shè)4個處理：對照(未鹽脅迫且不接種AM真菌，C)、只進(jìn)行鹽脅迫(S)、只接種AM真菌(A)、鹽脅迫且接種AM真菌(AS)，每個處理12次重復(fù)，完全隨機(jī)排列。

鹽脅迫處理，用以1/2的Hoagland營養(yǎng)液為溶劑配制成的100 mmol·L-1氯化鈉溶液每3 d處理一次，未鹽脅迫的處理澆灌等量的1/2的Hoagland營養(yǎng)液。共處理8次，處理結(jié)束后3 d取樣測定。

1.3 指標(biāo)測定與方法

各處理隨機(jī)選取5株，選西瓜幼苗第4～5片葉，參考王學(xué)奎[17]的方法，采用氮藍(lán)四唑法測定葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性，采用紫外吸收法測定過氧化氫酶(CAT)活性，采用酸性茚三酮比色法測定脯氨酸含量。

采用三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀(LC/MSD XT，安捷倫，USA)測定西瓜幼苗葉片內(nèi)源激素吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)、玉米素核苷(ZR)和脫落酸(ABA)的含量[18-19]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5處理，采用Microsoft Excel 2019制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下AM真菌對西瓜幼苗葉片防御酶活性的影響

由圖1可知，非鹽脅迫條件下，接種AM真菌的處理西瓜幼苗葉片SOD和CAT活性與對照(C)差異不顯著，酶活性水平均較低。無論是否接種AM真菌，鹽脅迫下西瓜幼苗葉片SOD和CAT活性均顯著提高。只進(jìn)行鹽脅迫(S)的西瓜幼苗葉片SOD和CAT活性顯著高于對照，分別比對照增加了15.7%和13.8%；而鹽脅迫下接種AM真菌(AS)的幼苗葉片SOD顯著高于未接種處理(S)，比未接種處理增加了17.3%。表明在鹽脅迫下，AM真菌能提高西瓜幼苗防御酶活性，從而提高西瓜幼苗對鹽脅迫的抗性。

圖1 鹽脅迫下AM真菌對西瓜幼苗葉片防御酶SOD(A)和CAT(B)活性的影響Fig. 1 Effect of AM fungi on defense enzyme activity of SOD(A) and CAT(B) in watermelon seedling leaves under salt stress注：圖中柱上不同小寫字母表示不同處理在P<0.05水平上差異顯著，下同。

2.2 鹽脅迫下AM真菌對西瓜幼苗葉片脯氨酸含量的影響

由圖2可知，非鹽脅迫條件下，接種AM真菌的西瓜幼苗葉片脯氨酸含量與對照差異不顯著。鹽脅迫條件下，無論是否接種AM真菌，西瓜幼苗葉片的脯氨酸含量均顯著高于未脅迫處理。只進(jìn)行鹽脅迫處理的西瓜幼苗葉片脯氨酸含量比對照增加了100.0%，而鹽脅迫下接種AM真菌的葉片脯氨酸含量分別比C、AM和S處理增加 180.0%、133.3%和44.2%，差異顯著。表明AM真菌能顯著提高鹽脅迫下西瓜幼苗葉片滲透物質(zhì)含量。

圖2 鹽脅迫下AM真菌對西瓜幼苗葉片脯氨酸含量的影響Fig. 2 Effect of AM fungi on proline content in watermelon seedling leaves under salt stress

2.3 鹽脅迫下AM真菌對西瓜幼苗葉片內(nèi)源激素含量的影響

由圖3可知，非鹽脅迫條件下，接種AM真菌處理西瓜幼苗葉片GA、IAA和ZR含量顯著高于對照，而ABA含量顯著低于對照。鹽脅迫條件下，無論是否接種AM真菌，幼苗葉片GA和IAA含量均顯著低于未脅迫處理，而ABA含量均顯著高于未脅迫處理。鹽脅迫下接種AM真菌的幼苗葉片GA和IAA含量顯著高于只進(jìn)行鹽脅迫處理，分別比S處理增加22.9%和21.9%，并且，AS處理的GA/ABA、IAA/ABA的比值高于S處理；AS和S處理的ABA和ZR含量差異不顯著。

2.4 AM真菌對鹽脅迫下西瓜葉片測定生理指標(biāo)的雙因子方差分析

本試驗通過對AM真菌和鹽脅迫進(jìn)行雙因素方差分析可知(表1)，接種AM真菌能極顯著提高西瓜幼苗葉片SOD和CAT活性以及脯氨酸含量，顯著提高ABA含量。鹽脅迫對CAT活性和ABA、GA、IAA含量影響極顯著，對SOD活性和ZR含量影響顯著。而AM真菌和鹽脅迫處理二者交互作用對脯氨酸和GA含量影響極顯著，對SOD活性和ABA含量影響顯著。

A.吲哚乙酸含量；B.玉米素核苷含量；C.赤霉素含量；D.脫落酸含量A.Indole acetic acid content；B.Zeatin nucleoside content；C.Gibberellin content；D.Abscisic acid content圖3 鹽脅迫下對AM真菌西瓜幼苗葉片內(nèi)源激素含量的影響Fig. 3 Effects of AM fungi on endogenous hormone content in watermelon seedlings leaves under salt stress

表1 AM真菌和鹽脅迫對西瓜葉片抗氧化酶活性、脯氨酸和激素含量影響的方差分析(F值)Table 1 Two-factor variance analysis of the effects of AM fungi and salt stress on antioxidant enzyme activity,proline and hormone contents in watermelon seedling leaves (F Value)

3 討論

鹽脅迫導(dǎo)致植物體內(nèi)的代謝紊亂，使得植物的氧化還原系統(tǒng)受到破壞，會使植物細(xì)胞內(nèi)的活性氧物質(zhì)大量積累并引起脂質(zhì)過氧化，影響植物的光合作用，為了應(yīng)對鹽脅迫，植物會產(chǎn)生抗氧化酶清除脅迫條件下積累的活性氧[20-22]。SOD和CAT就是其中兩個較為關(guān)鍵的抗氧化酶。在本研究中，接種AM真菌可以增強西瓜幼苗葉片在鹽脅迫下SOD和CAT的活性，這與Tigka等[15]研究的在鹽脅迫下接種AM真菌對萵苣抗氧化酶影響的結(jié)果一致。分析認(rèn)為AM真菌可以通過加強抗氧化酶活性來啟動對活性氧自由基的防御反應(yīng)，從而保持鹽脅迫下菊苣[15]、鳳梨[22]、水稻[23]、生菜[24]等植物抗氧化還原系統(tǒng)的活性，增加穩(wěn)固氧化還原穩(wěn)態(tài)[22]。同時SOD和CAT也可作為鹽脅迫條件下植物保持葉片膨壓的溶質(zhì)[20]。

脯氨酸作為一種小分子滲透保護(hù)物質(zhì)，在植物抵御各種逆境脅迫中發(fā)揮重要的作用。其可以作為滲透調(diào)節(jié)劑、活性氧清除劑、氧化還原平衡劑及蛋白質(zhì)和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定劑等[25-27]。本研究表明，鹽脅迫下接種AM真菌，西瓜葉片的脯氨酸含量顯著高于未接種處理，這表明AM真菌在西瓜幼苗抵御鹽脅迫過程中起了積極作用，這與在鹽漬條件下接種AM真菌雌桑樹生物量積累以及脯氨酸濃度增加的報道一致[27]。

植物在逆境環(huán)境下會通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的多種內(nèi)源激素水平來適應(yīng)環(huán)境的變化，鹽脅迫會使植物體內(nèi)激素含量發(fā)生變化[6, 28-30]。本試驗中，在鹽脅迫條件下西瓜幼苗中ABA的含量顯著增高，這可能與ABA作為信號分子，調(diào)控其他激素的響應(yīng)有關(guān)。ABA作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，脅迫條件下植物會大量合成ABA，從而使第二信使Ca2+濃度增加，來調(diào)控其他激素以及脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成以緩解鹽脅迫的影響[4, 28-29]。鹽脅迫條件下，接種AM真菌處理的西瓜葉片IAA、GA和ZR含量比未接種的顯著增加，這支持了賀忠群等[30]研究的鹽脅迫下接種AM真菌能顯著增加植物的IAA、GA和ZR含量的觀點。這可能是因為在鹽脅迫條件下，植物通過增加IAA和GA的含量促進(jìn)植株細(xì)胞分裂和生長來應(yīng)對逆境[5]。

鹽脅迫引起了西瓜抗氧化酶活性的升高，但長時間的鹽脅迫使西瓜的抗氧化系統(tǒng)受到破壞，活性氧產(chǎn)生系統(tǒng)與活性氧清除系統(tǒng)的動態(tài)平衡被打破，而接種AM真菌可以促進(jìn)西瓜抗氧化酶活性的提高，緩解西瓜的氧化脅迫。同時，接種AM真菌調(diào)節(jié)了西瓜幼苗內(nèi)源激素的水平，從而促進(jìn)西瓜幼苗在鹽脅迫下的生長。