關(guān)于采用計時酵母菌解決面團發(fā)酵問題的研究

史珩 嚴無忌 何佳茜 李政熙 梅一丁

（北京第四中學，北京 100009）

面包是一種將面粉加水和其他輔助原料等調(diào)勻、發(fā)酵后烤制而成的食品。近年來，因其品種、口味日益豐富，面包作為主食或茶點越來越流行，也有越來越多的人在家自制面包。疫情的蔓延和持續(xù)進一步激發(fā)了人們居家烘焙的熱情。國外調(diào)查表明，英國在2020 年5 月前短短12 周里，人們在家庭烘焙中的投入增長了49%，很多烘焙原料出現(xiàn)了供不應(yīng)求的現(xiàn)象[1]。在中國，面包店數(shù)量快速增長，與此同時，人們自己烘焙面包也成為時尚選擇。

然而，面包制作工序較為復雜，最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是面團的醒發(fā)，即面團發(fā)酵。面團的發(fā)酵是一個復雜的生化反應(yīng)過程，不僅要控制發(fā)酵時的濕度、溫度，更要掌控發(fā)酵的時間，而家庭烘焙者因為不夠?qū)I(yè)、缺乏經(jīng)驗，不容易精確控制發(fā)酵時間，或者忘記時間而沒有及時讓面團停止發(fā)酵，從而發(fā)酵過度，這些都會對面包的保鮮期、口感、柔軟度和形狀等產(chǎn)生很大影響。而具備規(guī)模的連鎖面包房聘請的專業(yè)面包師，多使用冷凍面團制作面包。冷凍面團采取極速冷凍的方式使酵母菌休眠，以暫停發(fā)酵。但是該過程會破壞面筋的組織結(jié)構(gòu)。此外，冷凍面團運送到面包房，需要解凍后進行二次發(fā)酵，在解凍的過程中，酵母菌會恢復活力并發(fā)酵，面包師無法準確估量其發(fā)酵程度，從而導致解凍后二次發(fā)酵控制難度增加，極易發(fā)酵過度。

本研究小組利用基因編輯技術(shù)研發(fā)出一種新型的計時酵母菌，通過基因控制酵母菌的休眠和喚醒，將其應(yīng)用至面團發(fā)酵過程，可大大提高面團發(fā)酵的成功率，若最終投入商用，將對面包行業(yè)的發(fā)展帶來一定的影響。

一、面團發(fā)酵

（一）面團發(fā)酵原理簡介

面團發(fā)酵是一個厭氧過程。其原理是：Saccharomyces cerevisiae酵母、野生酵母和乳酸菌[lactic acid bacteria（LAB）]這三種微生物，將面粉中的淀粉、多糖等運用淀粉酶使其分解為單糖后，再通過呼吸作用，將單糖轉(zhuǎn)化為二氧化碳、酒精、乳酸等物質(zhì)[2]。

（二）面團發(fā)酵過度的原因分析及研究思路

影響面團發(fā)酵的因素很多，例如溫度、濕度、面團含糖量、含鹽量等，但用來控制發(fā)酵程度的途徑主要為時間。

面團經(jīng)過一定時間的適度發(fā)酵，其產(chǎn)生的二氧化碳可以支持面筋蛋白，使面包具有一定的結(jié)構(gòu)而不塌陷，適度的乳酸也使得面包具有了獨特的風味。但是當發(fā)酵時間過長，面團過度發(fā)酵產(chǎn)生的過量二氧化碳，會破壞面筋結(jié)構(gòu)，導致面包塌陷，過量的酒精及乳酸也會影響面包的口感和風味。

基于此，研究小組針對發(fā)酵時間的控制提出思路：研發(fā)一種計時酵母菌，在一定時間后酵母菌自動死亡，從而發(fā)酵過程終止。

二、基因編輯技術(shù)

（一）基因編輯技術(shù)原理簡介

基因編輯（gene editing），又稱基因組編輯（genome editing）或基因組工程（genome engineering），是一種新興的、能比較精確地對生物體基因組特定目標基因進行修飾的基因工程技術(shù)。

早期的基因工程技術(shù)只能將外源或內(nèi)源遺傳物質(zhì)隨機插入宿主基因組，基因編輯則能定點編輯想要編輯的基因。

基因編輯依賴于經(jīng)基因工程改造的核酸酶來對目的基因進行編輯和定向改造，該核酸酶也稱“分子剪刀”，其DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以識別、結(jié)合靶DNA 的特定位點，對DNA 進行切割、修飾等操作。

基因編輯以其能夠高效率地進行定點基因組編輯，在基因研究、基因治療和遺傳改良等方面展示出了巨大的潛力。[3]

（二）對酵母進行基因編輯

在基因編輯出現(xiàn)100 多年后，人們發(fā)現(xiàn)了理想的可以基因編輯的對象——Saccharomyces cerevisiae，它不僅具備容易操作且安全的優(yōu)點，還是運用在基因編輯中的首個酵母。該酵母具有高效率的同源重組機制，也是第一個具有完整基因序列的真核生物。目前，酵母已經(jīng)成為一個用于生產(chǎn)抗生素或疫苗等眾多產(chǎn)品的平臺，被譽為“21 世紀生物的實驗對象”。

三、計時酵母菌基因設(shè)計

（一）初步設(shè)計

研究小組沒有對酵母菌自身進行編輯，而是在體外將目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒（圖1 左上），將其導入大腸桿菌寄主細胞（圖1 右上）后組成轉(zhuǎn)化細胞（圖1 中下），導入酵母菌體內(nèi)。

最初的設(shè)想是設(shè)計一個以toggle switch（撥動開關(guān)）為原理的通路。如圖2，Toggle switch 由兩個互相抑制的啟動子蛋白組成——lac 蛋白（P lac）和lambda 蛋白（Pλ）。啟動子的構(gòu)建方式是把原核生物啟動子添加到真核生物啟動子TATA 序列的下游。相關(guān)研究表明這種方法可以構(gòu)建高效的真核啟動子[3]。

在酵母菌被激活后，cI 蛋白抑制蛋白和毒素蛋白的表達。在開關(guān)外，一個半乳糖啟動子控制另一個lacI（lac inducer，lac 蛋白的誘導子）基因的表達。在系統(tǒng)加入半乳糖被后，lacI 得以表達，誘導撥動開關(guān)轉(zhuǎn)到另一種狀態(tài)。在這種狀態(tài)下，毒素蛋白開始表達和積累。

經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，可以通過調(diào)整撥動開關(guān)中的啟動子強度，生產(chǎn)具有不同發(fā)酵時間的計時酵母菌。

（二）初步設(shè)計的不足與改進

首先，初步設(shè)計沒有充分考慮基因工程帶來的食品安全問題。雖然上述通路設(shè)計過程產(chǎn)生的毒素對人體無害，但是公眾仍會本能地對毒素產(chǎn)生排斥反應(yīng)。

其次，該設(shè)計需要連續(xù)的lacI 蛋白積累，如果用半乳糖啟動子來實現(xiàn)這個功能，半乳糖的量將很難控制。半乳糖太少，則半乳糖很快會被耗盡；太多則會影響面包的口感和風味。

為改進實驗設(shè)計，研究小組采用營養(yǎng)缺陷型酵母菌代替毒素蛋白部分，以達到相同目的，并且在通路里加入整合酶，使lacI 可以在半乳糖的單次刺激后持續(xù)積累。整合酶是來自病毒的酶，可以使病毒的DNA 整合到其寄主的特定識別位點。如果把噬菌體和細菌的結(jié)合位點放在DNA 序列的兩端，整合酶會識別這些位點，并翻轉(zhuǎn)二者中間的序列[6]。

改進后的設(shè)計如下：

1.最初狀態(tài)

實驗開始時，撥動開關(guān)處于“關(guān)”的狀態(tài)，營養(yǎng)素的互補基因得以表達，使酵母獲得營養(yǎng)，可以正常工作。

2.通路的起始與激活

在加入半乳糖（烘焙原料之一）后，半乳糖會激活pGAL 啟動子，起始整合酶的表達，如圖3。整合酶的表達使啟動子與lacI 基因排成一條直線，翻轉(zhuǎn)lacI 上游的啟動子序列，lacI 開始表達和積累，如圖4。

lacI 撥動開關(guān)打開，抑制撥動開關(guān)的另一部分——CI 序列（如圖5）的表達，導致CI 濃度下降。

該設(shè)計通路，可以讓撥動開關(guān)的兩個產(chǎn)物的濃度維持在一個相對穩(wěn)定的水平，在半乳糖被移除的情況下其功能也不受影響。

3.發(fā)酵終止

當lacI 過度表達時，與之互補的CI 基因的表達停止，CI 濃度大幅下降，下游基因營養(yǎng)物（亮氨酸）的表達也隨之終止，濃度大幅下降，酵母因為缺少必需營養(yǎng)素而進入休眠狀態(tài)，發(fā)酵暫停（如果不需要二次發(fā)酵，也可以就此停止發(fā)酵）。

（三）計時酵母菌的時間控制研究

不同種類面包所需發(fā)酵時間不同，因此需要不同強度的啟動子。為此，基于前輩研究的基因表達生化反應(yīng)速率公式[7][8][9][10][11]，研究小組推出了如下新的建模公式：

公式（1）和公式（2）中，μ 是抑制蛋白1 號的濃度；v 是抑制蛋白2 號的濃度；α1 是抑制蛋白1 號的有效合成率，α2 是抑制蛋白2 號的有效合成率；γ 是對啟動子1 號的抑制的協(xié)同性，β 是對啟動子2 號的抑制的協(xié)同性。

建模后，研究小組先用一至兩對啟動子進行測試，根據(jù)實驗測得的有效合成率和協(xié)同性，對參數(shù)進行賦值，并擬合出關(guān)于啟動子強度與發(fā)酵時間關(guān)系的圖像，以便對模型進行調(diào)整，如圖6。其中，假設(shè)的參數(shù)為α1=4；α2=4；β=2；γ=2：。

在經(jīng)調(diào)整找到最佳公式（模型）后，可以不必每一次都做實驗，而是通過計算，直接找出針對特定發(fā)酵時間的合適的啟動子強度，從而生產(chǎn)出不同控制時間的計時酵母菌。

四、結(jié)語

（一）計時酵母菌的應(yīng)用前景

計時酵母菌目前的主要目標客戶是家庭烘焙者和冷凍面團生產(chǎn)商。

針對計時酵母菌的原理、特征和優(yōu)勢，研究小組已經(jīng)在幾所學校做了公眾宣講，并在社交媒體上對此進行了廣泛宣傳，收集了公眾對于這個研究成果的看法。很多人對該項目表示期待，計時酵母菌的應(yīng)用將對他們很有幫助。但是，仍有不少受訪者對基因編輯產(chǎn)品抱有排斥與戒備的心理，這主要是因為他們對基因編輯沒有充分的了解，而近年來關(guān)于轉(zhuǎn)基因食品安全問題的爭論未能有效消除人們的顧慮，甚至由于缺乏公共說理，加劇了人們對基因技術(shù)及應(yīng)用態(tài)度的撕裂，部分人仍是“談基因色變”。業(yè)內(nèi)人士則持相對理性的態(tài)度，其中，中國農(nóng)業(yè)大學梁建芬教授認為“研究并推廣基因編輯的計時酵母菌有創(chuàng)意和可實施性，不過公眾對于基因編輯產(chǎn)品，尤其是與食物相關(guān)的，有一定抵觸心理，這是基因研究工作者需要關(guān)注的”。面包坊從業(yè)者表示看好產(chǎn)品的前景，目前最重要的是產(chǎn)品的成熟度和穩(wěn)定性。

研究小組認為，隨著基因技術(shù)進一步發(fā)展，基因編輯及分子生物學相關(guān)知識的普及化，并且在基因產(chǎn)品經(jīng)受了一定時間的檢驗后，人們對計時酵母菌運用于面包生產(chǎn)的抵觸心理也會逐漸消失。

下一步，研究小組還將通過多次實驗，以確保通路設(shè)計的可靠性。在實驗成功后，會將計時酵母菌參與生產(chǎn)的面包提交政府相關(guān)部門審核，在政府批準后，再通過市場調(diào)研和可行性研究評估，進一步考慮商用，投入生產(chǎn)。

（二）未來展望

研究小組現(xiàn)有的設(shè)計主要針對一次發(fā)酵的面包，對于需要二次發(fā)酵的情況，如何讓酵母在走出休眠狀態(tài)之后重啟計時系統(tǒng)，仍需進一步研究和探索。

此外，在應(yīng)用階段，研究小組計劃尋找降低生產(chǎn)成本的方案，盡可能讓價格接受度更高，更有利于商業(yè)推廣。