野外繁育蟬花菌株的篩選及分子標記分析

譚悠久，龍文君， 朱冰舟， 董建飛， 唐 瑤，李春如，江 可，孫長勝

(1.浙江泛亞生物醫(yī)藥股份有限公司，浙江 平湖 314200；2.浙江泛亞生命科學研究院，浙江 平湖 314200)

【研究意義】蟬花，民間又稱蟲花、蟬菌、土蟲草、螺花、蟬蛻花、蟬蛹草、蟬茸、知了花、嗓啞花[1]。蟬花是一種傳統(tǒng)中藥材，最早記載于1600多年的《雷公炮炙論》。隋唐的《藥性論》記載：“蟬花味甘寒，無毒。主小兒天吊，驚癇瘈，夜啼心悸”?！侗静菥V目》記載：“蟬花可治療驚癇，夜啼心悸”。蟬花有較高的藥用價值[2-3]，具有改善腎功能[4-5]、抗腫瘤[6]、免疫調節(jié)[7-8]、調節(jié)脂類代謝[9]、降血糖[10]、抗氧化[11]、抗衰老[12]、抗疲勞[13]、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛[14]、改善機體營養(yǎng)狀況[15]等功效。其主要化學成分包括：氨基酸、多糖、生物堿、麥角甾醇、腺苷、蟲草酸等[16-17]。蟬花由于具有很高的食用安全性而引起研究人員的注意，有望開發(fā)成為新資源食品和新的飼料添加劑[18-19]?！厩叭搜芯窟M展】陳祝安對蟬花的人工培養(yǎng)做了大量研究工作，分離的蟬花菌株在一些自然基物或組合培養(yǎng)基上發(fā)酵可長出子實體，從而開創(chuàng)了蟬花人工培養(yǎng)途徑[20]。在蟲草類真菌人工馴化栽培過程中，菌種的退化現(xiàn)象比較嚴重，退化菌株在DNA水平上已經(jīng)產(chǎn)生明顯的遺傳變異[21]。蟬花人工培養(yǎng)過程中，也遇到菌種退化問題，彭凡通過活體柞蠶蛹和大蠟螟昆蟲侵染繁育的方式來恢復蟬花菌種生產(chǎn)性狀，但是蠶蛹和大蠟螟非天然寄主，復壯效果并不理想[22]。菌種復壯的活體昆蟲往往需要天然寄主才更為有效，蟬花的天然寄主包括竹蟬、蟪蛄、小鳴蟬和山蟬，這些寄主均不能人工養(yǎng)殖。因此，蟬花的繁育復壯需要經(jīng)野外投放來實現(xiàn)?！颈狙芯壳腥朦c】野外繁育的蟬花，除了生產(chǎn)性狀的評價，還需要分子方法來進行鑒別。【擬解決的關鍵問題】本研究通過在毛竹林進行野外繁育復壯獲得蟬花菌株，進行子實體培養(yǎng)評價、SCAR和ISSR分子標記分析。本研究結果旨在獲得適合工廠化培養(yǎng)的高產(chǎn)、穩(wěn)定蟬花菌株。

1 材料與方法

1.1 菌株

繁育出發(fā)蟬花菌株A17-7-1，由浙江泛亞生命科學研究院提供；蟬花繁育獲得菌株由A17-7-1培養(yǎng)物2014年4月投放于浙江安吉的野外繁育毛竹林，2014年7月從野外繁育基地采集分離獲得，共獲得7個菌株，菌株編號分別為14AJ10、14AJ11、14AJ12、14AJ13、14AJ14、14AJ15、14AJ16。

1.2 菌株子實體培養(yǎng)篩選

按照每個罐頭瓶裝40 g小麥，水70 mL，用透氣膜封口，121 ℃滅菌40 min，自然冷卻后接種5 mL蟬花菌株搖瓶種子液,每組重復5瓶，置22～23 ℃培養(yǎng)室光照培養(yǎng)25 d后采收子實體，于60 ℃烘干后稱重統(tǒng)計。

1.3 SCAR分子標記

將獲得子實體產(chǎn)量明顯高于A17-7-1的菌株提取基因組DNA進行ISSR分子標記分析。

SCAR分子標記引物：S11-2-F3 GTAGACCCGTGTTGTATGACAAACT；S11-2-R3 GTAGACCCGTAAGGAGACGGAGGAT，為菌株A17-7-1特異性DNA片段引物，由上海生工生物工程公司合成。其擴增體系見表1。

PCR擴增程序：先95 ℃ 5 min；然后依次95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2分30 s，共循環(huán)35次；然后72 ℃ 10 min，最后降溫至4 ℃保存。凝膠電泳：PCR產(chǎn)物使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，時間40 min。拍照記錄。

表1 擴增體系

1.4 ISSR分子標記

將繁育出發(fā)菌株及獲得的繁育子實體產(chǎn)量增加明顯菌株菌絲，加液氮研磨，以CTAB+酚氯仿法提取菌株的總DNA；對待檢菌株DNA分別采用下列引物進行PCR擴增，引物由上海生工生物工程公司合成。

所采用的PCR擴增反應體系如下：以P5、P12、P13、M8、M10、M11為引物的反應擴增體系總體積為15 μL。DNA樣本：20～50 ng，dNTP：3 nmol，引物：3 pmol，Taq酶：1 U，酶反應緩沖液：1.5 μL，加雙蒸水至15 μL。以P18、P19為引物的反應擴增體系總體積為20 μL。DNA樣本：20～50 ng，dNTP：4 nmol，引物：4 pmol，Taq酶：1 U，酶反應緩沖液：2 μL，加雙蒸水至20 μL(表2)。

以P5、P19和M11為引物的PCR擴增反應條件如下：先94 ℃ 5 min；而后依次94 ℃ 20秒，48 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，共循環(huán)35次；然后72 ℃延伸5 min，最后降溫至4 ℃；以P12和M8為引物的PCR擴增反應條件如下：先94 ℃ 5 min；而后依次94 ℃ 20 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，共循環(huán)35次；然后72 ℃延伸5 min，最后降溫至4 ℃；以P13和M10為引物的PCR擴增反應條件如下：先94 ℃ 5 min；而后依次94 ℃ 20 s，54 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，共循環(huán)35次；以P18為引物的PCR擴增反應條件如下：先94 ℃ 5 min；而后依次94 ℃ 20 s，53.5 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，共循環(huán)35次。

表2 ISSR擴增引物

2 結果與分析

2.1 蟬花子實體培養(yǎng)篩選

將獲得的7個蟬花菌株及A17-7-1菌株進行子實體培養(yǎng)篩選，結果顯示菌株之間子實體產(chǎn)量差異明顯，其中菌株14AJ10和14AJ13實體長、密生、粗壯，產(chǎn)量分別為每瓶6.65和6.37 g。14AJ10菌株子實體產(chǎn)量高于繁育出發(fā)菌株17-7-1 5.75 g每瓶的產(chǎn)量，差異顯著；14AJ13菌株子實體產(chǎn)量略高于繁育出發(fā)菌株17-7-1，但差異不顯著；14AJ11、14AJ15菌株子實體短、密生、細?。?4AJ12子實體短、密生、較粗；14AJ14、14AJ16菌株子實體短、稀疏、細小。14AJ11、14AJ12、14AJ14、14AJ15、14AJ16等5個菌株子實體產(chǎn)量顯著遠低于A17-7-1菌株。結果見表3和圖1。

表3 繁育蟬花菌株的篩選

2.2 SCAR分子標記

由圖2顯示，通過對繁育獲得7個菌株SCAR 標記分析，14AJ10和14AJ13菌株擴增出A17-7-1具有特異條帶，分子量約2200 bp，表明14AJ10和14AJ13菌株是由A17-7-1繁育獲得。14AJ11、14AJ12、14AJ14、14AJ15、14AJ16等5個菌株未能擴增出條帶，表明這5個菌株不含特異性片段，為竹林中本來就存在的菌株。

2.3 ISSR分子標記

依據(jù)子實體篩選培養(yǎng)結果和SCAR分析結果，選擇子實體產(chǎn)量提高的菌株14AJ0和14AJ13與A17-7-1菌株進行ISSR分析。利用6個ISSR引物對A17-7-1蟬花菌株基因組DNA進行擴增，共計擴增出31個條帶，擴增出的條帶大小在100～2000 bp之間。P18引物擴增出8個條帶，M10引物擴增出7個條帶，P13擴增出2個條帶，M11擴增出5條條帶，P19擴增出5個條帶，P5 擴增出4個條帶。6個引物對14AJ10菌株DNA進行擴增，結果擴增出的所有條帶均與A17-7-1菌株的條帶完全一致，表明菌株14AJ10較好的保持了A17-7-1的遺傳特性。6個引物對14AJ13菌株DNA進行擴增，M10引物擴增條帶相比于A17-7-1，在1500、1200 bp處各有一個條帶缺失，其余引物擴增的條帶與A17-7-1菌株一致，表明14AJ13菌株部分遺傳特性發(fā)生了改變(圖3)。

3 討 論

A17-7-1菌株是經(jīng)過多年選育獲得可用于生產(chǎn)的蟬花菌株，但由于傳代較多，子實體生產(chǎn)生產(chǎn)性能有一定的下降。通過野外繁育復壯，獲得7個菌株。7個菌株經(jīng)子實體培養(yǎng)比較，有的菌株子實體產(chǎn)量較高，也有的菌株子實體產(chǎn)量非常低。其中14AJ10和13AJ13菌株子實體產(chǎn)量高于A17-7-1菌株，很可能是經(jīng)野外繁育而來。但由于獲得的7個菌株是從野外采集分離純化而得，很有可能部分菌株是本來就分布于竹林的菌株，需要進行分子鑒別。SCAR 分子標記是重復性好、可靠性高的分子標記技術，不同菌株的 DNA 差異可通過單一條帶的出現(xiàn)與否加以判斷，是一種非常方便、快捷，可用于快速檢測大量個體的方法[23]。因此將7個菌株與A17-7-1進行SCAR 標記分析，可快速有效的判定是否來源于A17-7-1的野外繁育復壯。經(jīng)SCAR標記分析，14AJ10和14AJ13菌株擴增出A17-7-1特有的條帶，表明14AJ10和14AJ13菌株是經(jīng)野外繁育而來，占獲得菌株的28.57%。盡管繁育獲得的菌株不多，但菌株經(jīng)過侵染蟲體，子實體生產(chǎn)性能有了一定的恢復，證明了野外繁育蟬花具有有一定的效果。其余菌株未能擴增出A17-7-1特有的條帶，應該是竹林原先就存在的菌株蟬花。

ISSR是一種操作簡單、高效的檢測手段，常用于真菌遺傳多態(tài)性分析和種內菌株親緣關系的區(qū)分[24]。將子實體生產(chǎn)能力提高，且經(jīng)SCAR標記確認的14AJ10、14AJ13菌株與菌株A17-7-1進行ISSR分析，發(fā)現(xiàn)14AJ10菌株擴增出的條帶與A17-7-1產(chǎn)生的條帶完全一致，表明14AJ10菌株不僅子實體產(chǎn)量上升，且遺傳性狀相對穩(wěn)定。14AJ13菌株子實體產(chǎn)量增加不明顯，但經(jīng)ISSR分析發(fā)現(xiàn)，與A17-7-1相比較，14AJ13菌株的M10引物擴增條帶有部分缺失，表明14AJ13菌株遺傳性狀有了明顯的變化。通過蟬花野外繁育菌株的篩選和分子鑒別，初步建立了蟬花野外繁育復壯菌株的子實體培養(yǎng)篩選、菌株分子鑒別體系，也獲得子實體產(chǎn)量提高的菌株，繁育復壯獲得的菌株有望應用于生產(chǎn)中。