不同地方品種雞ALV感染情況調(diào)查及其凈化

蔡丙嚴(yán)，田其真，戴建華，穆曉惠，白佑博

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

0 引言

禽白血病(Avain leukosis，AL)是由禽白血病病毒(avain leuckosis virus，ALV)和禽肉瘤病病毒引起的禽類(lèi)多種腫瘤型疾病的統(tǒng)稱[1]。禽白血病分布范圍廣，是一種全球性的傳染病，病毒既可以垂直傳播也可以水平傳播[2]。雞群一旦感染，會(huì)造成內(nèi)臟器官的腫瘤、免疫抑制、生長(zhǎng)與生產(chǎn)性能下降，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失[3]。隨著近年來(lái)對(duì)外源性禽白血病J亞群的深入研究[4]，發(fā)現(xiàn)其危害較大，能引起病雞發(fā)生血管瘤和急慢性腫瘤，給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。不同類(lèi)型、不同品系原種雞場(chǎng)核心群的外源性禽白血病的凈化，是預(yù)防禽白血病最基本也是最重要的一環(huán)[5]。中小規(guī)模自繁自養(yǎng)的雞群，尤其是一些地方品種的雞群，對(duì)禽白血病的凈化工作不到位，致使雞群的感染率在30%以上[6]。因此，有必要對(duì)一些有價(jià)值的地方品種雞群盡快啟動(dòng)AL凈化程序[7]。目前，種雞場(chǎng)開(kāi)展的AL凈化方法主要是檢測(cè)、淘汰與做好生物安全措施。臨床實(shí)踐中，常采用p27抗原免疫膠體金試紙條、ELISA試劑盒及PCR等檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。蘆花雞、蘇禽綠殼雞和新楊黑雞為我國(guó)土生或自主培育的蛋肉兼用品種。為了解這3個(gè)地方品種雞中ALV的自然感染狀態(tài)，項(xiàng)目組分兩批次采集泄殖腔棉拭子與血清樣品，采用免疫膠體金試紙和ELISA 2種方法進(jìn)行ALV的檢測(cè)，并通過(guò)PCR方法檢測(cè)了雞群中ALV-J亞群感染情況，同時(shí)，對(duì)檢測(cè)出的陽(yáng)性雞只及時(shí)進(jìn)行淘汰。研究結(jié)果為我國(guó)地方品種雞ALV的防控提供了重要的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步做好ALV的凈化工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑及引物設(shè)計(jì)

ALV p27抗原檢測(cè)試紙條(揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研發(fā)產(chǎn)品)；DNA Marker、dNTP等試劑(購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司)；DNA提取試劑盒(購(gòu)自AXYGEN公司)；禽白血病病毒抗原檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自愛(ài)德士(IDEXX)生物科技有限公司)。參考文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)鑒定ALV-J的RT-PCR引物H5/H7序列為：H5 5′-GGATGAGGTGACTAAGAAAC-3′/H7 5′-CGACCAAAGGTAACACACG-3′，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min；95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；擴(kuò)增ALV-J的pol至gp85基因片段，預(yù)計(jì)大小545bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.2 檢測(cè)方法

對(duì)蘆花、蘇禽綠殼、新楊黑3個(gè)地方品種雞，于15周齡、25周齡分2批次采集泄殖腔棉拭子于裝有含雙抗PBS的指形管中，采集后24 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室凍融，檢測(cè)前將樣品液氮中反復(fù)凍融2次，恢復(fù)至室溫，沉淀雜質(zhì)，按p27抗原試紙條說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)；無(wú)菌翅靜脈采血2 mL，分離血清，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)；無(wú)菌采集陽(yáng)性雞的抗凝血樣品2 mL，4℃冰箱保存不超過(guò)12 h，按照試劑盒說(shuō)明提取基因組，擴(kuò)增ALV-J的pol至gp85基因片段。

1.3 雞群凈化

根據(jù)每次檢測(cè)結(jié)果，淘汰p27抗原陽(yáng)性雞只；嚴(yán)格執(zhí)行生物安全措施，雞舍及其周?chē)?1：500的比例稀釋的二氯異氰尿酸鈉消毒不少于2次/d[9]；雞舍飼養(yǎng)管理實(shí)行定員責(zé)任制，及時(shí)清理雞糞并做無(wú)害化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 p27抗原試紙條檢測(cè)結(jié)果

在15周齡，分別采集蘆花、蘇禽綠殼、新楊黑雞3個(gè)地方品種雞泄殖腔棉拭子樣品各700份，總計(jì)2 100份。檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性數(shù)共計(jì)644份，總陽(yáng)性率為30.67%，其中蘆花、蘇禽綠殼、新楊黑3個(gè)地方品種雞的陽(yáng)性率分別為32.42%、24.57%、35.00%。在25周齡，分別采集蘆花、蘇禽綠殼、新楊黑雞3個(gè)地方品種雞泄殖腔棉拭子樣品各500份，總計(jì)1 500份。檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性數(shù)共計(jì)159份，總陽(yáng)性率為11.20%，其中蘆花、蘇禽綠殼、新楊黑3個(gè)地方品種雞的陽(yáng)性率分別為11.80%、7.20%、14.60%，具體如表1所示。

表1 三個(gè)地方品種雞15、25周齡ALV p27抗原試紙條檢測(cè)陽(yáng)性率

2.2 p27抗原ELISA檢測(cè)結(jié)果

在15周齡和25周齡分2批次對(duì)蘆花、蘇禽綠殼、新楊黑3個(gè)地方品種雞共采集600份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示：15周齡時(shí)，陽(yáng)性數(shù)共計(jì)113份，總陽(yáng)性率為31.38%，其中蘆花、蘇禽綠殼、新楊黑3個(gè)地方品種雞的陽(yáng)性率分別為34.16%、24.16%、35.83%；25周齡時(shí)，陽(yáng)性數(shù)共計(jì)30份，總陽(yáng)性率為12.50%，其中蘆花、蘇禽綠殼、新楊黑3個(gè)地方品種雞的陽(yáng)性率分別為12.50%、8.75%、15.00%，具體如表2所示。

表2 三個(gè)地方品種雞15、25周齡ALV p27抗原ELISA檢測(cè)陽(yáng)性率

2.3 ALV-J亞群抗原PCR檢測(cè)結(jié)果

無(wú)菌采集陽(yáng)性雞的抗凝血樣品2 mL，4℃冰箱保存不超過(guò)12 h，按照試劑盒說(shuō)明提取基因組，擴(kuò)增ALV-J的pol至gp85基因片段。大小約545 bp，如圖1所示。

圖1 ALV-J的pol至gp85基因PCR擴(kuò)增片段

2.4 雞群凈化結(jié)果

綜合ALV p27抗原試紙條和p27抗原ELISA檢測(cè)結(jié)果，雞場(chǎng)對(duì)15周齡檢測(cè)出陽(yáng)性的雞只進(jìn)行了淘汰，并采取了加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、消毒及無(wú)害化處理等凈化控制措施，至25周齡檢測(cè)時(shí)，雞群ALV陽(yáng)性率顯著下降，ALV p27抗原試紙條檢測(cè)總陽(yáng)性率由15周齡的30.67%下降至11.80%，共下降了19.47%，ALV p27抗原ELISA檢測(cè)總陽(yáng)性率由15周齡的31.38%下降至12.50%，共下降了18.88%，2種檢測(cè)方法陽(yáng)性率較為一致，由此看出經(jīng)過(guò)兩次的檢測(cè)淘汰，雞場(chǎng)AL的凈化成效非常顯著，結(jié)果如表1、表2所示。

3 討論

國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012—2020 年)中明確提出，禽白血病是國(guó)家優(yōu)先防治的傳染病。深入研究禽白血病，有效防控和消滅禽白血病，對(duì)促進(jìn)我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展具有重要的意義[10]。AL在我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)中是一種普遍現(xiàn)象，ALV在雞群特別是我國(guó)地方品種的雞群中廣泛存在。崔治中[6]等對(duì)廣東某“三黃雞”種雞場(chǎng)禽白血病的檢測(cè)顯示，3 個(gè)地方品種的祖代雞均感染了禽白血病病毒，且感染比例平均達(dá)33%。姬向波[11]等對(duì)河南省5個(gè)地方品種雞禽白血病病毒檢測(cè)顯示，河南地方品種雞群總體ALV p27抗原陽(yáng)性率為泄殖腔拭子22.62%、血清26.83%、蛋清12.90%；5個(gè)品種雞群的血清ALV p27陽(yáng)性率依次為河南斗雞84.48%、淅川烏骨雞53.78%、固始雞19.81%、三黃雞17.22%、盧氏雞16.67%，但同品種不同場(chǎng)區(qū)間差異較大。本研究結(jié)果顯示，蘆花、蘇禽綠殼、新楊黑雞3個(gè)地方品種雞15周齡首次檢測(cè)時(shí)泄殖腔樣品p27抗原試紙檢測(cè)陽(yáng)性率分別32.42%、24.57%、35.00%；血清樣品ELISA檢測(cè)陽(yáng)性率分別為34.16%、24.16%、35.83%，研究結(jié)果與崔治中等對(duì)“三黃雞”的檢測(cè)比較接近，與姬向波等對(duì)河南5個(gè)地方品種雞的結(jié)果差異較大，可能與不同品種雞、不同檢測(cè)周齡等有關(guān)。

ALV p27抗原快速檢測(cè)試紙條具有操作簡(jiǎn)便、快速出結(jié)果、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，尤其是適合種雞場(chǎng)快速、大規(guī)模禽白血病的檢測(cè)與凈化工作。但實(shí)踐操作中，影響檢測(cè)結(jié)果的主要因素有泄殖腔拭子稀釋液緩沖液的量、反復(fù)凍融次數(shù)、試紙條反應(yīng)的時(shí)間等，因此，應(yīng)想辦法創(chuàng)造好的檢測(cè)條件，以免影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。ALV p27抗原ELISA試劑盒具有檢測(cè)快速、敏感性高、操作簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，但由于其檢測(cè)樣品多為血清，對(duì)樣品采集、實(shí)驗(yàn)操作、設(shè)備等都有較高的要求，適合用于種雞場(chǎng)核心雞群的復(fù)檢工作。本研究同時(shí)運(yùn)用2種ALV檢測(cè)方法，分2個(gè)時(shí)期對(duì)蘆花、蘇禽綠殼、新楊黑3個(gè)地方品種雞的泄殖腔拭子和血清樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，2種檢測(cè)方法符合率達(dá)到98.70%。因此，建議種雞場(chǎng)首次對(duì)雞群大面積調(diào)查ALV感染情況時(shí)采用p27抗原快速檢測(cè)試紙條，對(duì)于核心種雞群進(jìn)行ALV復(fù)檢時(shí)運(yùn)用ALV p27抗原ELISA試劑盒檢測(cè)，以減少相關(guān)工作量。

ALV-J亞群白血病病毒是20世紀(jì)80年代末分離并鑒定出的雞白血病病毒的一個(gè)新的亞群[12]。該群病毒主要引起肉用型雞的骨髓樣細(xì)胞瘤，而蛋用型雞自然感染時(shí)很少引起腫瘤。當(dāng)前我國(guó)雞群 ALV-J的問(wèn)題集中在各地自繁自養(yǎng)的培育型黃羽肉雞及我國(guó)地方品種雞中。唐中文[13]對(duì)安徽省16例疑似感染禽白血病的地方品種雞，通過(guò) PCR擴(kuò)增方法對(duì)患病雞檢測(cè)、ALV-Jgp85基因擴(kuò)增、測(cè)序、分析比較，結(jié)果檢出10份J亞群禽白血病病毒。王培坤等[14]對(duì)疑似患有禽白血病的廣西麻雞進(jìn)行病理剖檢、接種DF-1細(xì)胞進(jìn)行病毒分離以及對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行p27抗原檢測(cè)、細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)分離到病毒的gp85基因進(jìn)行測(cè)序和分析比較。結(jié)果表明，從該病雞同時(shí)分離到了A亞群禽白血病病毒(ALV-A)與J亞群禽白血病病毒(ALV-J)。本研究采集部分p27抗原檢測(cè)陽(yáng)性雞的抗凝血40份，提取基因組，擴(kuò)增ALV-J的pol至gp85基因片段進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果有32份樣品擴(kuò)增出545 bp目的片段，表明這蘆花、蘇禽綠殼和新楊黑這3個(gè)地方品種雞主要感染的禽白血病病毒類(lèi)型為ALV-J亞群禽白血病病毒。本研究結(jié)果與唐中文、王培坤對(duì)地方品種雞ALV-J亞群禽白血病的檢測(cè)一致，更進(jìn)一步論證了ALV-J亞群禽白血病病毒為當(dāng)前地方品種雞禽白血病的主要感染類(lèi)型。

4 結(jié)語(yǔ)

目前，尚無(wú)有效的疫苗預(yù)防禽白血病，因此，采取嚴(yán)格的生物安全措施，進(jìn)行病原檢測(cè)、淘汰外源性ALV所感染的雞只、凈化種群等方法控制該病是一項(xiàng)緊迫的任務(wù)。對(duì)于自繁自養(yǎng)的地方品種原種雞場(chǎng)核心群白血病的凈化，對(duì)預(yù)防和控制禽白血病顯得至關(guān)重要，做到從源頭消滅傳染源。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)15周齡、25周齡2個(gè)禽白血病病毒排毒高峰期的檢測(cè)、淘汰陽(yáng)性雞、嚴(yán)格執(zhí)行生物安全等措施，蘆花、蘇禽綠殼、新楊黑3個(gè)地方品種雞ALV總陽(yáng)性率下降了18.88%～19.47%，雞場(chǎng)AL的凈化成效非常顯著?？偨Y(jié)本研究成效顯著的原因主要為：這3個(gè)地方品種雞感染的主要是外源性ALV-J亞群禽白血??；本研究采用ALV p27抗原檢測(cè)試紙條與ALV p27抗原ELISA檢測(cè)試劑盒2種檢測(cè)方法的同時(shí)運(yùn)用，可檢測(cè)出所有亞群禽白血病病毒共有的p27抗原[9]，將內(nèi)源性和外源性禽白血病同時(shí)檢測(cè)剔除；同時(shí)執(zhí)行嚴(yán)格的淘汰和生物安全措施降低了禽白血病的外源性感染。研究結(jié)果為地方品種雞禽白血病的檢測(cè)、凈化提供了依據(jù)與參考。