呼吸道感染患兒腸道菌群紊亂與Th17/Treg及其分泌炎性細(xì)胞因子免疫平衡的相關(guān)性研究

康 茹，孟改利，周雪紅

（1.西北婦女兒童醫(yī)院檢驗科，西安 710061；2.民航西安醫(yī)院，西安 710082）

呼吸道感染是由致病微生物入侵呼吸道而引發(fā)的一系列呼吸道癥狀，是兒童常見病之一，引起感染的致病菌種類繁多，患者病情嚴(yán)重程度與微生物毒力密切相關(guān)[1]。研究報道，兒童呼吸道感染與呼吸道解剖特點及發(fā)育不成熟有關(guān)，同時機體免疫功能低下也是引起呼吸道感染的主要原因，認(rèn)為感染過程是病原微生物入侵宿主激活免疫反應(yīng)消滅入侵病原體的過程，病原微生物感染及機體免疫力下降是呼吸道感染致病的主要病因[2-3]。此外LI 等[4]指出，呼吸道感染會引起機體腸道菌群紊亂，腸道菌群在調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)中具有重要作用。MCKAY 指出[5]，腸道菌群失調(diào)是學(xué)齡以下兒童呼吸道感染的致病因素之一。腸道作為機體最大的免疫器官，在合成代謝、免疫防御中發(fā)揮重要作用，參與機體免疫系統(tǒng)建立，與兒童呼吸系統(tǒng)疾病關(guān)系密切[6]。Th17/Treg 失衡及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)異常在免疫應(yīng)答系統(tǒng)及炎癥反應(yīng)中起到重要作用，機體炎性因子異常波動引起Th17/Treg 比例失衡，參與多種自身免疫性疾病及炎性疾病，在腸道免疫平衡中發(fā)揮主導(dǎo)作用[7]?；诖耍狙芯繑M探究分析呼吸道感染患兒腸道菌群紊亂與Th17/Treg 細(xì)胞及其分泌炎性細(xì)胞因子免疫平衡的相關(guān)性，以期為呼吸道感染患兒的臨床防治提供價值參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 前瞻性選取2019年5月～2020年11月西北婦女兒童醫(yī)院收治的呼吸道感染患兒135例作為研究觀察組，排除患有原發(fā)性或繼發(fā)性免疫疾病或功能缺陷者；并發(fā)嚴(yán)重肝腎功能障礙或心腦血管疾?。蝗朐呵?月內(nèi)應(yīng)用腎上腺皮質(zhì)激素、免疫調(diào)節(jié)劑者；患有其他器官器質(zhì)性疾病或先天性心臟病者；呼吸道畸形者；患有哮喘疾病者等。觀察組患兒年齡0～6 歲，平均年齡3.4±0.7 歲，男性63 例，女性72 例，根據(jù)《腸道菌群糞便圖片檢查圖譜》[8]中腸道菌群紊亂判斷標(biāo)準(zhǔn)分為菌群失調(diào)組（n=60，B/E ＜1.01）和非菌群失調(diào)組（n=75，B/E ≥1.01）。另選取同期健康體檢兒童100 例作為對照，年齡0～6 歲，平均年齡3.2±1.0 歲，男性49 例，女性51 例。觀察組與對照組兒童年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)通過，家屬均知情并簽署同意書。

1.2 儀器與試劑 GaspaK 厭氧盒購自北京東方大林科技有限公司；選擇性培養(yǎng)基購自廣州市樂試生物科技有限公司；流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；血清IL-2，IL-6，IL-17，IL-10 檢測試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司；ELISA 酶聯(lián)免疫吸附儀購自美國BIO-RAD 公司；溫育箱購自北京福意聯(lián)醫(yī)療設(shè)備公司。

1.3 方法

1.3.1 腸道菌群檢測： 留取各組兒童新鮮糞便約5g，裝入?yún)捬醮忾]于30min 內(nèi)進(jìn)行送檢；采用連續(xù)稀釋法（10-1～10-10）稀釋糞便樣本，采用滴注法于選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行接種，其中乳酸桿菌、雙歧桿菌應(yīng)用GaspaK 厭氧盒37℃培養(yǎng)48 h，腸球菌、大腸埃希菌直接放置于37℃溫箱培養(yǎng)24h，觀察并計數(shù)，同時計算雙歧桿菌／大腸埃希菌比值（B/E）。

1.3.2 外周血Th17，Treg 細(xì)胞百分比檢測：取空腹靜脈血2ml，采用密度梯度法獲取外周靜脈血單個核細(xì)胞進(jìn)行孵育培養(yǎng)，加入抗人IL-17A PE 和CD4-FITC 檢 測Th17細(xì)胞，加入CD25-PE檢測Treg 細(xì)胞，對照管加入MouseIgG1-PE 作為對照，室溫孵育30min，加入PBS 洗滌重懸，采用流式細(xì)胞儀分別檢測各組外周血Th17，Treg 細(xì)胞百分比。

1.3.3 血清炎性細(xì)胞因子檢測： 取空腹靜脈血5ml，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組血清IL-2，IL-6，IL-17，IL-10 水平。

1.3.4 觀察指標(biāo)：觀察各組腸道菌群數(shù)量，Th17/Treg細(xì)胞免疫平衡及血清炎性細(xì)胞因子水平變化，分析腸道菌群與Th17，Treg 細(xì)胞及血清炎性細(xì)胞因子表達(dá)的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用軟件SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料采用n表示，組間采用χ2檢驗；Pearson 相關(guān)性分析腸道菌群與Th17，Treg細(xì)胞及其分泌炎性細(xì)胞因子的相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腸道菌群數(shù)量比較 見表1。三組兒童腸道各菌群數(shù)量組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）；菌群失調(diào)組乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量及B/E 值較非菌群失調(diào)組和對照組明顯降低，腸球菌、大腸埃希菌數(shù)量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）；非菌群失調(diào)組和對照組各菌群數(shù)量差異 無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）。

表1 各組腸道菌群數(shù)量比較（±s，lg CFU/g）

表1 各組腸道菌群數(shù)量比較（±s，lg CFU/g）

項 目 菌群失調(diào)組① （n=60）非菌群失調(diào)組② （n=75）對照組③（n=100） F P ① vs ③ ① vs ②t P t P 乳酸桿菌 5.73±0.94 7.25±1.43 7.52±1.22 42.449 ＜0.001 8.914 ＜0.05 7.137 ＜0.05雙歧桿菌 8.65±1.35 9.87±1.62 10.21±1.41 21.947 ＜0.001 6.517 ＜0.05 4.805 ＜0.05腸球菌 8.52±1.26 7.14±0.98 6.93±1.15 40.184 ＜0.001 8.625 ＜0.05 7.058 ＜0.05大腸埃希菌 10.01±1.43 9.25±0.88 9.11±0.97 13.849 ＜0.001 5.098 ＜0.05 4.059 ＜0.05 B/E 值 0.86±0.18 1.07±0.27 1.12±0.34 16.395 ＜0.001 5.600 ＜0.05 4.265 ＜0.05

2.2 各組Th17，Treg 細(xì)胞百分比比較 見表2。三組外周血Th17%，Treg%組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與對照組相比，菌群失調(diào)組和非菌群失調(diào)組Th17%明顯升高，Treg%明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；菌群失調(diào)組Th17%，Treg%變化更顯著（P＜0.05）。

表2 各組Th17%，Treg%及Th17/Treg 比值比較（±s）

表2 各組Th17%，Treg%及Th17/Treg 比值比較（±s）

項 目 菌群失調(diào)組① （n=60）非菌群失調(diào)組② （n=75）對照組③ （n=100） F P ① vs ③ ① vs ② ② vs ③t P t P t P Th17細(xì)胞（%） 4.26±1.02 3.04±0. 87 2.36±0.73 92.328 ＜0.001 13.586 ＜0.05 8.225 ＜0.05 5.198 ＜0.05 Treg 細(xì)胞（%） 4.22±0.94 5.61±0.58 6.12±1.03 87.591 ＜0.001 13.134 ＜0.05 9.059 ＜0.05 3.769 ＜0.05

2.3 各組血清炎性細(xì)胞因子水平比較 見表3。三組血清炎性細(xì)胞因子水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與對照組相比，菌群失調(diào)組和非菌群失調(diào)組IL-2，IL-6，IL-17 水平明顯升高，IL-10明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；菌群失調(diào)組IL-2，IL-6，IL-17，IL-10 水平變化更顯著（P＜0.05）。

表3 各組血清炎性細(xì)胞因子水平比較（±s）

表3 各組血清炎性細(xì)胞因子水平比較（±s）

項 目 菌群失調(diào)組① （n=60）非菌群失調(diào)組② （n=75）對照組③ （n=100） F P ① vs ③ ① vs ② ② vs ③t P t P t P IL-2（pg/ml） 169.28±18.49 148.43±17.52 137.27±15.73 66.211 ＜0.001 11.502 ＜0.05 7.064 ＜0.05 4.287 ＜0.05 IL-6（pg/ml） 13.01±1.11 8.12±0.98 6.72±1.03 713.641 ＜0.001 37.196 ＜0.05 27.263 ＜0.05 8.850 ＜0.05 IL-17（U/L） 3.72±0.82 2.86±0.71 2.19±0.65 86.175 ＜0.001 13.093 ＜0.05 6.939 ＜0.05 6.129 ＜0.05 IL-10（pg/ml） 96.24±13.27 103.23±16.58 119.35±19.87 37.989 ＜0.001 8.158 ＜0.05 2.326 ＜0.05 6.083 ＜0.05

2.4 腸道菌群與Th17，Treg 細(xì)胞及血清炎性細(xì)胞因子的相關(guān)性 見表4。Pearson 相關(guān)性分析顯示，呼吸道感染患兒Th17%及IL-2，IL-6，IL-17 水平與乳酸桿菌、雙歧桿菌、B/E 值呈負(fù)相關(guān)，與腸球菌、大腸埃希菌呈正相關(guān)（均P＜0.05）；Treg%及IL-10 水平與乳酸桿菌、雙歧桿菌、B/E 值呈正相關(guān)，與腸球菌、大腸埃希菌呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05）。

表4 相關(guān)性分析

3 討論

呼吸道感染是臨床兒童常見的呼吸系統(tǒng)疾病，以學(xué)齡前兒童最為多見，目前對于其發(fā)病機制尚未完全明確，但研究認(rèn)為，微生物入侵、自身免疫缺陷及外界環(huán)境變化是誘發(fā)呼吸道感染的主要病因[9]。既往對于呼吸道感染免疫機制認(rèn)為與機體體液免疫相關(guān)，然而近年研究發(fā)現(xiàn)，由呼吸道病原微生物感染引起T 淋巴細(xì)胞數(shù)量、比例失衡，導(dǎo)致機體免疫調(diào)節(jié)失衡也是引發(fā)呼吸道感染的病機之一[10]。另研究發(fā)現(xiàn)，呼吸道感染會引發(fā)機體腸道微生物代謝紊亂，影響機體腸道功能屏障，并指出腸道菌群作為人體最大且最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，在維持機體免疫穩(wěn)定、驅(qū)動免疫成熟及抗感染方面發(fā)揮重要生理功能[11]。據(jù)相關(guān)報道，呼吸道微生物組成與宿主的天然免疫激活有關(guān)，呼吸道感染與腸道菌群表現(xiàn)為雙向交互影響，呼吸道感染引起腸道菌群及腸功能改變，而腸道菌群紊亂亦會加重呼吸道疾病[12]。腸道有益菌群中大多數(shù)的專性厭氧性細(xì)菌一方面能夠限制數(shù)量較少的潛在致病菌的過度生長，維持腸道菌群平衡；另一方面正常的腸道菌群可對抗外源性致病菌的入侵、定植，形成腸道菌群的生物拮抗作用，維持正常腸道菌群穩(wěn)定及保護(hù)訴主免于感染[6,11]。并發(fā)現(xiàn)，腸道菌群數(shù)量或空間位置異常會引起機體免疫功能受損，增加易感性[13]。腸道菌群通過調(diào)節(jié)腸道宿主免疫，介導(dǎo)腸道外T 淋巴細(xì)胞群擴(kuò)、分化，影響機體全身免疫應(yīng)答[10]。腸道菌群平衡與否是腸道免疫系統(tǒng)的刺激因子，其一旦失衡使致病菌數(shù)量增加通過攻擊腸道優(yōu)勢菌群引起腸道屏障功能損傷，誘發(fā)宿主炎性反應(yīng)，引起免疫功能異常[13]。目前研究已證實，腸道菌群及其代謝產(chǎn)物與人體免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟關(guān)系密切，介導(dǎo)參與多種呼吸系統(tǒng)疾病的免疫反應(yīng)過程[14]。因此，積極探究呼吸道感染患者腸道菌群變化及與免疫炎癥失衡的關(guān)系，對臨床診治具有積極意義。

據(jù)報道，腸道菌群在免疫系統(tǒng)及抑制病原菌等方面影響宿主腸道功能，正常生理條件下，腸道內(nèi)乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益菌可形成生物屏障保護(hù)腸道正常生理功能，一旦發(fā)生菌群紊亂則會引起有益菌轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏【?，造成腸道黏膜屏障及腸功能障礙[15]。乳酸桿菌、雙歧桿菌通過爭奪營養(yǎng)代謝合成酸性產(chǎn)物，不僅能夠降低腸道pH 值，還能殺滅或抑制大腸埃希菌等條件致病菌，維持腸道菌群平衡，其中雙歧桿菌通過作用于機體免疫系統(tǒng)，能夠刺激誘發(fā)腸道免疫功能[7]。研究顯示，呼吸道合胞病毒感染導(dǎo)致小鼠腸道微生物群顯著性多樣改變，表現(xiàn)為乳酸桿菌屬豐度降低，擬桿菌門數(shù)量增加，腸道炎癥相關(guān)指標(biāo)水平升高[16]。予以抗生素誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)小鼠擬桿菌門數(shù)量減少，炎性因子IL-6，IL-8，TNF-α 等水平及腸屏障相關(guān)基因Occludin，ZO-1 表達(dá)降低，表明菌群失調(diào)會引起免疫失調(diào)[17]。還發(fā)現(xiàn)較健康體檢兒童相比，反復(fù)呼吸道感染患兒乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量降低，腸球菌、大腸埃希菌數(shù)量升高[18]。本研究檢測發(fā)現(xiàn)菌群失調(diào)組患兒新鮮糞便中各菌群數(shù)量及B/E 值明顯異常波動，差異于非菌群失調(diào)組和對照組，與文獻(xiàn)[18]報道結(jié)果相一致；而非菌群失調(diào)組較對照組變化不顯著，提示腸道菌群異常變化與呼吸道感染的發(fā)生及病情進(jìn)展密切相關(guān)，腸道菌群失衡可能是引發(fā)患兒呼吸道感染的危險因素。

研究認(rèn)為，腸道菌群對免疫系統(tǒng)的作用體現(xiàn)在驅(qū)動黏膜免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟、誘導(dǎo)維持黏膜免疫應(yīng)答穩(wěn)態(tài)及維持增強腸道黏膜屏障[19]。T 細(xì)胞是重要的細(xì)胞免疫效應(yīng)細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，宿主免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟中腸道正常菌群定植起著關(guān)鍵作用，其通過調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）維持機體免疫平衡及耐受，保持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[20]。腸道菌群紊亂是免疫-炎癥反應(yīng)系統(tǒng)改變的重要因素[21]。Treg 細(xì)胞是抑制炎性反應(yīng)的T 細(xì)胞亞群，腸道菌群失衡時Treg 細(xì)胞數(shù)量下降，調(diào)節(jié)抗炎性細(xì)胞因子IL-10，TGF-β減少；而Th17 通過調(diào)節(jié)IL-2，IL-6 和IL-17 等促炎性細(xì)胞因子分泌，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，兩者共同參與調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答[22]；并顯示腸道菌群能夠間接調(diào)控CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞影響機體免疫反應(yīng)，加劇炎性反應(yīng)[20]。以上種種提示腸道菌群與機體免疫存在某種聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)，呼吸道感染患兒外周血Th17%和Treg%較正常對照兒童明顯升高或降低，相對應(yīng)的細(xì)胞分泌炎性因子水平也明顯同趨勢變化，菌群失調(diào)組變化更顯著，說明Th17 /Treg 免疫失衡及炎癥反應(yīng)參與了兒童呼吸道感染的發(fā)病進(jìn)展。Pearson 相關(guān)性分析顯示，呼吸道感染患兒外周血Th17%，Treg%及相應(yīng)細(xì)胞分泌炎性因子與各菌群數(shù)量及B/E 值顯著相關(guān)，由此推斷腸道菌群紊亂引起機體Th17 /Treg 免疫失衡，通過調(diào)控炎癥反應(yīng)，促進(jìn)兒童呼吸道感染的發(fā)生。然而本研究病例樣本有限，還需進(jìn)一步繼續(xù)擴(kuò)大樣本量行多中心探究分析以期進(jìn)行驗證，為臨床提供更準(zhǔn)確可靠的參考價值。

近年，在對腸道菌群與呼吸系統(tǒng)疾病的研究中得出，腸道菌群構(gòu)成平衡與否是腸道免疫系統(tǒng)的刺激因子，是人體重要的免疫屏障[7]。腸道菌群對免疫系統(tǒng)的作用體現(xiàn)在：一是腸道菌群與免疫系統(tǒng)間的“交互對話”機制，二是兩者之間的作用存在“窗口期”，認(rèn)為腸道黏膜上菌群定植在嬰幼兒免疫系統(tǒng)的發(fā)育中具有“工具性”作用[7,11,14]。迄今，腸道菌群與呼吸系統(tǒng)疾病間的交互作用研究受到廣泛關(guān)注，基于腸道菌群調(diào)節(jié)劑的輔助治療反復(fù)呼吸道感染及免疫功能中的作用也逐漸得到證實[23-24]，提示通過外界優(yōu)化或干擾腸道菌群可作為防治兒童呼吸道系統(tǒng)疾病的有效措施。故可將探究呼吸道感染兒童腸道菌群生物學(xué)特征、腸道菌群變化與呼吸系統(tǒng)疾病間的關(guān)系及微生物制劑在呼吸道保護(hù)中的作用等作為進(jìn)一步研究的目標(biāo)方向，以期為兒童呼吸系統(tǒng)疾病的防治提供更多治療途徑。

綜上所述，呼吸道感染患兒腸道菌群紊亂表現(xiàn)為腸道有益菌數(shù)量減少，致病菌數(shù)量增多；腸道菌群紊亂可能通過誘導(dǎo)機體Th17 /Treg 免疫失衡，調(diào)控炎性介質(zhì)分泌，進(jìn)而參與兒童呼吸道感染的發(fā)生發(fā)展。