慢阻肺急性加重患者外周血單核細(xì)胞CD64，TLR2及TLR4水平表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系研究

鄒 雯，王婷婷，王一江 （南京醫(yī)科大學(xué)附屬江蘇盛澤醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇蘇州 215200）

慢阻肺急性加重（acute exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease, AECOPD）患者氣喘、咳嗽咳痰等癥狀加重，AECOPD 會(huì)增加患者醫(yī)療開(kāi)銷，加重患者疾病負(fù)擔(dān)[1]。目前，氣道炎癥及細(xì)菌感染被認(rèn)為是慢阻肺（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）的主要致病機(jī)制。簇分化抗原64（cluster of differentiation antigen ,CD64）是激活單核細(xì)胞及粒細(xì)胞，引起炎癥的重要分子物質(zhì)，當(dāng)發(fā)生細(xì)菌感染時(shí)，外周血單核細(xì)胞表面CD64 表達(dá)將異常上升，史萌萌等[2]研究發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)外周血CD64 表達(dá)水平在預(yù)測(cè)AECOPD 患者不良預(yù)后中具有一定的價(jià)值。此外，機(jī)體免疫功能下降也與COPD 發(fā)病相關(guān)，Toll 樣受體（toll-like receptors,TLR）是天然免疫中新發(fā)現(xiàn)的一類模式識(shí)別受體家族，單核細(xì)胞主要表達(dá)Toll 樣受體2（To ll-like receptor 2, TLR2）與Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4, TLR4），TLR 可作為病原相關(guān)分子模式識(shí)別受體（pattern-recognition receptors, PRR）與配體直接結(jié)合，參與機(jī)體非特異性免疫[3,4]。謝圓媛等[5]研究發(fā)現(xiàn)，不吸煙的COPD 穩(wěn)定期患者外周血TLR2 及TLR4 水平明顯高于AECOPD 患者及吸煙患者，且外周血TLR2 及TLR4 水平與患者血清炎癥因子水平間有較高的相關(guān)性，提示其可能參與COPD 發(fā)生及發(fā)展。以上研究表明，外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平可能與COPD 及AECOPD 的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)，但相關(guān)研究較少，故本研究擬通過(guò)檢測(cè)AECOPD 患者外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平，分析其在預(yù)測(cè)AECOPD 患者預(yù)后中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 將南京醫(yī)科大學(xué)附屬江蘇盛澤醫(yī)院2017.06～2020.06 期間收治的96 例慢阻肺急性加重（AECOPD）患者納為研究對(duì)象，同時(shí)將30 例穩(wěn)定期COPD 患者納為穩(wěn)定組，30 例健康志愿者納為對(duì)照組。①納入標(biāo)準(zhǔn)：COPD 患者均符合《慢阻肺診斷、治療與預(yù)防全球倡議（GOLD）》中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，AECOPD 患者具有呼吸困難、慢性咳嗽咳痰癥狀，持續(xù)性氣流受限，短期內(nèi)咳嗽、喘息、咳痰等癥狀加重，需改變治療方案；穩(wěn)定期患者病情穩(wěn)定持續(xù)時(shí)間超過(guò)1 個(gè)月患者；健康志愿者為健康體檢合格，無(wú)COPD 病史、慢性咳嗽、喘息、咳痰者。②排除標(biāo)準(zhǔn)：排除參與研究前15 天內(nèi)使用糖皮質(zhì)激素者；并發(fā)惡性腫瘤者；并發(fā)其他部位感染者。③病例資料：對(duì)照組男性19 例，女性11 例，年齡55～85 歲，平均年齡72.45±13.33 歲；AECOPD 組男性63 例，女性33 例，年齡56～87 歲，平均年齡71.15±12.03 歲，COPD 組男性19 例，女性11 例，年齡55～87 歲，平均年齡73.15±12.69 歲。三組年齡及性別比例無(wú)顯著性差異（P>0.05），本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，參與者均知情且簽署同意書(shū)。

1.2 儀器與試劑 美國(guó)BD 公司FACS Calibur 流式細(xì)胞儀，IL-6 采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，PCT 采用發(fā)光免疫法檢測(cè)，試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Beckman 公司，白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）由美國(guó)Beckman 公司全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)，CD64-PE 單抗（Clone:10.1，Cat No12-0649-73）、鼠IgG1-PE（Clone:P3.6.2.8.1，Cat No12-4714-82）均購(gòu)自美國(guó)eBioscience 公司，肺功能檢測(cè)儀為麥邦MSA99。

1.3 方法 ①外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）提?。翰杉谎芯空呖崭轨o脈血5ml，EDTA 抗凝，采用Ficoll Paque 分離液提取患者外周血PBMC。②流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD64 表達(dá)水平：分別于兩支試管內(nèi)加入CD64-PE（測(cè)定）與鼠IgG1-PE（對(duì)照），分別加入全血50μl，避光環(huán)境中靜置15min，滴加溶血素50μl，棄上清液，300×g 離心5min，棄上清液，加入等滲鹽水洗滌后，使用流式細(xì)胞器檢測(cè)CD64 表達(dá)水平，單核細(xì)胞表面的CD64 表達(dá)采用相對(duì)熒光強(qiáng)度（RFI）表示，RFI=目的細(xì)胞CD64 平均熒光強(qiáng)度/目的細(xì)胞陰性對(duì)照熒光強(qiáng)度。③ 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PBMC TLR2 及TLR4 的表達(dá)：經(jīng)Cellquestpro 統(tǒng)計(jì)軟件獲取分析，共收獲10 000個(gè)細(xì)胞，以APC-CD14/SCC 散點(diǎn)圖設(shè)單核細(xì)胞門(mén)R1，以FSC/SCC 散點(diǎn)圖設(shè)淋巴門(mén)R2，細(xì)胞碎片根據(jù)SSC 特征排除，單核細(xì)胞中TLR2 及TLR4 表達(dá)以直方圖表示，以平均熒光強(qiáng)度（MFI）表示單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞中TLR2 及TLR4 表達(dá)強(qiáng)度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較使用單AVNA 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)有意義者，兩兩比較采用q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用[n(%)]表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，用二元Logistic 回歸計(jì)算聯(lián)合檢測(cè)AECOPD 再次復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)值，繪制受試者特征工作曲線（receiver operating characteristic curve,ROC）評(píng)價(jià)單個(gè)或多個(gè)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)AECOPD 再次復(fù)發(fā)的性能，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平比較 見(jiàn)表1。AECOPD 組及COPD 組外周血CD64 水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且AECOPD 組CD64 水平高于COPD 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.466,P<0.05），AECOPD 組及COPD組外周血TLR2 及TLR4 水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且AECOPD 組外周血TLR2 及TLR4 水平高于COPD 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.249, 2.037, 均P<0.05）。

表1 三組外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平比較(±s)

表1 三組外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平比較(±s)

項(xiàng) 目 對(duì)照組（n=30） COPD 組（n=30） AECOPD 組（n=96） F P CD64（MFI） 26.74±5.14 32.69±6.43 39.69±7.79 51.774 0.000 TLR2 140.0 3±28.74 169.79±29.07 181.15±22.44 26.957 0.000 TLR4 153.65±35.14 186.25±34.15 200.58±33.47 21.488 0.000

2.2 AECOPD 及COPD 組患者臨床指標(biāo)比較 見(jiàn)表2。AECOPD 組患者FEV1/FVC 水平低于COPD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.523,P<0.05），血清PCT，IL-6 及WBC 水平高于COPD 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.443, 8.019, 3.690, 均P<0.05），兩組年齡、性別比例、吸煙史及FEV1%pred 水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表2 AECOPD 及COPD 組患者臨床指標(biāo)比較

2.3 不同預(yù)后AECOPD 患者外周血CD64，TLR2及TLR4 水平比較 見(jiàn)表3。隨訪6 個(gè)月，96 例AECOPD 患者中共20 例患者因再次急性復(fù)發(fā)入院，再次復(fù)發(fā)者首次入院時(shí)外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平均高于無(wú)復(fù)發(fā)者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表3 不同預(yù)后AECOPD 患者外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平比較（MFI）

2.4 AECOPD患者外周血CD64，TLR2 及TLR4水平與其他臨床指標(biāo)間的相關(guān)性分析 見(jiàn)表4。AECOPD 患者外周血CD64 與其吸煙史、PCT，IL-6水平呈正相關(guān)，與FEV1/FVC 呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.31, 0.33, 0.16, -0.45, 均P<0.05），TLR2 與其FEV1/FVC 呈負(fù)相關(guān)，與PCT 水平呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r= -0.35, 0.34,P<0.05），TLR4 與其他臨床指標(biāo)無(wú)相關(guān)性（P>0.05）。

表4 AECOPD 患者外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平與其他臨床指標(biāo)間的相關(guān)性分析

2.5 外周血CD64，TLR2，TLR4 在預(yù)測(cè)AECOPD預(yù)后中的價(jià)值 見(jiàn)表5，圖1。繪制ROC 曲線發(fā)現(xiàn)，血清CD64，TLR2 及TLR4 在預(yù)測(cè)AECOPD 患者再次急性復(fù)發(fā)中均具有良好的應(yīng)用效能，各指標(biāo)單獨(dú)應(yīng)用時(shí)以TLR2 應(yīng)用效能最高，其AUC=0.805，95%CI(0.679～0.931)，三指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用的預(yù)測(cè)效能最高，AUC=0.833，95%CI(0.703～0.964)。

表5 外周血CD64，TLR2，TLR4 在預(yù)測(cè)AECOPD 預(yù)后中的價(jià)值

圖1 外周血CD64，TLR2 及TLR4 在預(yù)測(cè) AECOPD 預(yù)后中的價(jià)值

3 討論

COPD 是一種以持續(xù)性氣流受限為主要特征的慢性呼吸性疾病，其患病率高，是目前重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，COPD 病因復(fù)雜，病情多變，當(dāng)疾病急性發(fā)作時(shí)，死亡率也較高。準(zhǔn)確評(píng)估患者病情嚴(yán)重程度，預(yù)測(cè)其預(yù)后，在疾病的治療中具有重要的意義。篩選適當(dāng)?shù)难笜?biāo)，用于臨床AECOPD病情及預(yù)后評(píng)估，是目前研究的熱點(diǎn)。胡小燕等[6]研究發(fā)現(xiàn)，血清降鈣素原（procalcitonin, PCT）以及B 型腦利鈉肽（B type brain natriuretic peptide, BNP）在診斷AECOPD 并發(fā)心力衰竭中具有良好效能，提示血生化指標(biāo)在AECOPD 中的應(yīng)用價(jià)值較高。本研究以CD64，TLR2 以及TLR4 作為研究指標(biāo)，旨在探討以上指標(biāo)在AECOPD中的應(yīng)用價(jià)值。

CD64 是IgG Fc 段受體Ⅰ，中性粒細(xì)胞活化的標(biāo)志物，是一種高親和性受體，主要于單核細(xì)胞與巨噬細(xì)胞表面表達(dá)。CD64 是連接機(jī)體體液免疫及細(xì)胞免疫的橋梁，參與細(xì)胞吞噬、清除免疫復(fù)合體、刺激炎性介質(zhì)釋放等多種生理病理過(guò)程[7-8]。單核細(xì)胞是巨噬細(xì)胞的前體，本院研究發(fā)現(xiàn)，AECOPD患者外周血單核細(xì)胞上CD64 表達(dá)水平明顯高于COPD 患者及健康志愿者，且與患者肺功能指標(biāo)FEV1/FVC，炎癥指標(biāo)CRP，PCT 間存在相關(guān)性，說(shuō)明外周血CD64 水平升高在反映AECOPD 患者機(jī)體肺功能及炎癥反應(yīng)強(qiáng)度中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。羅成等[9]研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥肺損傷者外周血CD64指數(shù)明顯高于單一的膿毒癥患者，且CD64 水平與炎性指標(biāo)CRP 間呈正相關(guān)，與本文研究結(jié)論相似。有研究表示，IL-6 及CRP 等炎性因子可與單核細(xì)胞上的CD64 相互結(jié)合，誘導(dǎo)黏附的單核細(xì)胞釋放CCL2，CCL3 等趨化因子，減少單核細(xì)胞相應(yīng)趨化因子受體的表達(dá)，進(jìn)而減少單核細(xì)胞對(duì)趨化因子的誘導(dǎo)移行，導(dǎo)致單核細(xì)胞大量定居在氣管內(nèi)，募集更多的循環(huán)炎癥細(xì)胞，加重患者病情[10]。以上研究均證實(shí)，CD64 在提示COPD 病情嚴(yán)重程度中具有一定的價(jià)值，且本文通過(guò)繪制ROC 曲線發(fā)現(xiàn)，CD64 在預(yù)測(cè)AECOPD 預(yù)后中的AUC=0.756，進(jìn)一步說(shuō)明CD64 在預(yù)測(cè)AECOPD 患者預(yù)后中的價(jià)值。

除炎癥的影響外，COPD 的發(fā)生及發(fā)展與患者機(jī)體免疫力之間也存在密切聯(lián)系，故篩選合適的免疫性指標(biāo)，用于COPD 病情的評(píng)估，也具有一定的研究意義。其中，Toll 樣受體（TLR）屬于天然免疫系統(tǒng)，屬于模式識(shí)別受體家族，是天然免疫與適應(yīng)性免疫之間的橋梁。感染是引起COPD 及AECOPD 的重要原因，作為宿主防御體系的重要成員，TLR 的表達(dá)分布及功能可能與COPD 間存在密切的關(guān)系[11]。

TLR2 可通過(guò)激活機(jī)體免疫細(xì)胞，促進(jìn)炎癥介質(zhì)及趨化因子的釋放[12]。TLR4 是脂多糖（LPS）受體復(fù)合物中的重要組成部分，TLR4 調(diào)節(jié)LPS 促使免疫細(xì)胞與非免疫細(xì)胞釋放致炎性細(xì)胞因子及化學(xué)因子導(dǎo)致內(nèi)毒素性休克過(guò)程。細(xì)菌感染可通過(guò)刺激樹(shù)突狀細(xì)胞通過(guò)TLR4 途徑促使β2 防御素產(chǎn)生增多[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，AECOPD 患者外周血核細(xì)胞中TRL2 及TRL4 水平明顯高于COPD 組及健康志愿者，提示AECOPD患者免疫系統(tǒng)處于活化狀態(tài)，作為機(jī)體一線防御功能的單核細(xì)胞，其在進(jìn)入靶器官前處于一種活化狀態(tài)，能表達(dá)多種模式識(shí)別受體，識(shí)別靶器官抗原[14]。TRL2 及TRL4 高表達(dá)可能促進(jìn)AECOPD 患者外周血單核細(xì)胞活化，TLR 通過(guò)激活患者機(jī)體免疫細(xì)胞，促進(jìn)炎癥介質(zhì)及趨化因子的釋放，募集更多的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)于氣管內(nèi)，加重患者臨床癥狀[15]。

相關(guān)性分析提示，AECOPD 患者外周血單核細(xì)胞TLR2 表達(dá)水平與其FEV1/FVC 呈負(fù)相關(guān)，與PCT 水平呈正相關(guān)，而TLR4 與其他臨床指標(biāo)無(wú)相關(guān)性，這可能與本研究樣本有限相關(guān)。此外，隨訪半年，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，半年內(nèi)AECOPD 再次復(fù)發(fā)者外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平明顯高于未復(fù)發(fā)者，繪制ROC 曲線發(fā)現(xiàn)，外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平在預(yù)測(cè)AECOPD 再次復(fù)發(fā)中具有良好的效能，三者聯(lián)合應(yīng)用則可有效提高各項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)應(yīng)用時(shí)的應(yīng)用效能。外周血單核細(xì)胞CD64，TLR2及TLR4 的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，取材方便，且在反映AECOPD 病情中具有較好的效能，可作為臨床評(píng)估AECOPD 預(yù)后的可靠指標(biāo)，但本研究所納入的樣本量較小，且為單中心研究，患者信息存在時(shí)效性差，在病例選擇上也存在選擇偏倚，后應(yīng)擴(kuò)大研究樣本以控制偏倚。

綜上所述，AECOPD 患者外周血CD64，TLR2及TLR4 水平均較COPD 者明顯升高，且其在預(yù)測(cè)患者半年內(nèi)再次急性復(fù)發(fā)中具有良好的效能，有望作為臨床預(yù)測(cè)AECOPD 患者預(yù)后的參考指標(biāo)。