miR-452-5p 靶向SOX5 調(diào)控信號(hào)通路對乳腺癌細(xì)胞增殖與侵襲的影響

魏 濤，馮連杰，付小娜，趙世杰，劉偉鵬，梁 豪

乳腺癌患者的死亡多由局部腫瘤轉(zhuǎn)移引起［1］，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，侵襲性癌細(xì)胞的增殖程序受基因的調(diào)控［2］。miRNA 是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，可通過與靶基因結(jié)合，調(diào)控蛋白的表達(dá)和細(xì)胞功能。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-452-5p 可抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［3］，miR-485-5p 通過靶向survivin 抑制乳腺癌的進(jìn)展和化學(xué)敏感性［4］。在細(xì)胞中，小RNA 通過與靶基因的3'-未翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合抑制基因表達(dá)，研究顯示，miR-146a-5p 通過調(diào)控SOX5 的表達(dá)影響三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［5］。SOX5 作為癌基因發(fā)揮作用，抑制SOX5 的表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌和前列腺癌的發(fā)展［6，7］。SOX5 被證明是由多個(gè)小RNA 調(diào)控的，但在乳腺癌中，miR-452-5p 是否調(diào)控SOX5 還沒有研究。筆者通過檢測miR-452-5p、SOX5 的表達(dá)，探討miR-452-5p 對乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料人乳腺上皮細(xì)胞株HBL-100、人乳腺癌MCF-7、SKBR-3、BT549 細(xì)胞株（上海細(xì)胞庫）；胎牛血清、RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；Tranwell 小室（美國Millipore 公司）；Matrigel 膠（美國BD 公司）；MTT、DMSO（美國Sigma 公司）；miRcon、miR-con mimic 的構(gòu)建（上海吉?jiǎng)P基因公司）；SOX5、Cyclin D1、CDK4、MMP-2、MMP-9 一抗（美國Abcam 公 司）；Twist、N-cadherin、Vimentin、βactin 抗體（美國CST 公司）；lipofectamine TM2000轉(zhuǎn)染試劑（美國invitrogen 公司）；SOX5 過表達(dá)載體及空載體、SOX5 野生型（WT）或突變型（MUT）熒光素酶報(bào)告載體（廣州復(fù)能基因有限公司）；miR-452-5p、SOX5 引物（上海生工公司）；IgG 二抗（北京博奧森生物科技有限公司）；RIPA 裂解液、BCA 蛋白檢測試劑盒（美國Thermo scientificals 公司）；酶標(biāo)儀購自Bio-Red 公司；電子熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司；Western blot 發(fā)光成像系統(tǒng)（美國UVP公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與分組 HBL-100、MCF-7、SKBR-3、BT549 細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)首先分為空白對照組（NC），陰性對照組（miRcon），miR-452-5p 過表達(dá)組（miR-452-5p mimic）；miR-con 組：將miR-con 轉(zhuǎn)染至SKBR-3 細(xì)胞中；miR-452-5p mimic 組：將miR-452-5p mimic 轉(zhuǎn)染至SKBR-3 細(xì)胞中。后續(xù)實(shí)驗(yàn)分為miR-con 組，miR-452-5p mimic 組，miR-452-5p+pcDNA 組，miR-452-5p+pcDNA-SOX5 組；miR-452-5p +pcDNA 組，將pcDNA空載體轉(zhuǎn)染miR-452-5p mimic 細(xì)胞；miR-452-5p+pcDNA-SOX5 組，將pcDNA-SOX5 載體轉(zhuǎn)染miR-452-5p mimic 細(xì)胞，比較2 組間檢測數(shù)據(jù)的差異。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-452-5p mimic、miR-con 使用lipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后6 h 后更換培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率；pcDNA-SOX5 通過慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 細(xì)胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量PCR 儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40 個(gè)循環(huán)。以U6 和β-actin 分別為miR-452-5p、SOX5 的內(nèi)參基因，采用2-ΔΔct方法計(jì)算miR-452-5p、SOX5 的相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值。引物序列：miR-452-5p：F 5'-GACCCAATACGAGTCGGCAATTCCA ACT-3'，R 5'-GCGAGGTCAAGTCACTAGTGGT-3'；U6：F 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R 5'-AACG CTTCACGAATTTGCGT-3'；SOX5：F 5'-CAGCCAG AGTTAGCACAATAGG-3'，R 5'-CTGTTGTTCCCGT CGGAGTT-3'；β-actin：F 5'-GGAGCGAGATCCCT CCAAAAT-3'，R 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCAT GG-3'。

1.2.4 MTT 法檢測細(xì)胞增殖情況 調(diào)整SKBR-3細(xì)胞濃度至5×104個(gè)/ml，96 孔板每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，分別于24 h，48 h，72 h 檢測細(xì)胞活力；每孔加入MTT 試劑20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心保留下層細(xì)胞，每孔加入100 μl DMSO，錫箔紙包裹震蕩孵育15 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm 波長的吸光度。

1.2.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力 Transwells 小室接種5×104個(gè)SKBR-3 細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 后檢測遷移至小室膜細(xì)胞數(shù)，200 倍光鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野比較穿膜細(xì)胞數(shù)。Matrigel包被小室基底膜，其余步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同，檢測細(xì)胞侵襲能力。實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次。使用相同方法檢測miR-con 組，miR-452-5p mimic 組，miR-452-5p+pcDNA 組，miR-452-5p+pcDNA-SOX5 組SKBR-3 細(xì)胞的遷移侵襲能力。

1.2.6 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測miR-452-5p 對SOX5的影響 構(gòu)建野生型pGL3-SOX5-3’UTR（wt-SOX5 3’UTR）和突變型pGL3-SOX5-3’UTR（mutpGL3-SOX5-3’UTR）表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至miR-con、miR-452-5p mimic SKBR-3 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h 裂解細(xì)胞，雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測雙熒光素酶活性，檢測miR-452-5p 對SOX5 熒光活性的調(diào)控。

1.2.7 采用蛋白印跡（western blot，WB）法檢測蛋白表達(dá)情況 RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞中總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度；SDS 變性蛋白；電泳轉(zhuǎn)膜封閉1，一抗以1∶500 稀釋后4 ℃孵育過夜，二抗孵育1 h，ECL 顯影液顯影，AI600 成像系統(tǒng)觀察目的蛋白條帶，Image J 軟件對目的條帶進(jìn)行灰度值分析，以β-Actin 為內(nèi)參進(jìn)行灰度值比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。2 組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用snk-q 檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-452-5p 和SOX5 在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)RT-qPCR 檢測結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、SKBR-3、BT549 中miR-452-5p 表達(dá)顯著低于正 常乳腺癌細(xì)胞系HBL-100（P＜0.05），且SKBR-3 細(xì)胞中miR-452-5p 表達(dá)水平最低（圖1A）。乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、SKBR-3、BT549 中SOX5 mRNA 及蛋白水平顯著高于HBL-100（P＜0.05），且SKBR-3 細(xì)胞中SOX5 mRNA 及蛋白水平均最高（圖1B～D），選擇乳腺癌細(xì)胞系SKBR-3 進(jìn)行后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。

圖1 miR-452-5p、SOX5 在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

2.2 轉(zhuǎn)染miR-452-5p 抑制乳腺癌SKBR-3 細(xì)胞增殖在SKBR-3 細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染 miR-con、NC和miR-452-5p mimic，RT-qPCR 檢測顯示，與NC、miR-con 組比較，轉(zhuǎn)染miR-452-5p mimic 后，乳腺癌SKBR-3 細(xì)胞miR-452-5p 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）（圖2A）。MTT 檢測顯示，與NC、miR-con組比較，過表達(dá)miR-452-5p 后乳腺癌SKBR-3 細(xì)胞活性顯著降低（P＜0.05）（圖2B）。Western blot 結(jié)果顯示，與NC、miR-con 組比較，過表達(dá)miR-452-5p 后，細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1、CDK4 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）（圖2C、D）。

圖2 轉(zhuǎn)染miR-452-5p 對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

2.3 轉(zhuǎn)染miR-452-5p 抑制乳腺癌SKBR-3 細(xì)胞遷移和侵襲Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，與NC、miR-con 組比較，轉(zhuǎn)染miR-452-5p mimic 組乳腺癌SKBR-3 細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低（P＜0.05）（圖3A、B），提示miR-452-5p 能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。Western blot 結(jié)果顯示，與NC、miR-con 組比較，過表達(dá)miR-452-5p 后，乳腺癌SKBR-3 細(xì)胞中與侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）（圖3C、D）。

圖3 轉(zhuǎn)染miR-452-5p 對抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

2.4 miR-452-5p 靶向SOX5TargetScan 軟件預(yù)測miR-452-5p 與SOX5 3’UTR 存在結(jié)合位點(diǎn)（圖4A），熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-452-5p 與SOX53’UTR 關(guān)系，根據(jù)預(yù)測結(jié)果構(gòu)建SOX5-WT-3’UTR 和SOX5-MUT-3’UTR 質(zhì)粒，分別與miR-452-5p mimic 或miR-452-5p NC 共轉(zhuǎn)染至SKBR-3 細(xì)胞，熒光素酶報(bào)告基因顯示，只有SOX5-WT--3’UTR 與miR-452-5p mimic 共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），其余三組熒光素酶活性無明顯差異，提示miR-452-5p 可與SOX5 特異性結(jié)合（圖4B）。Western blot 結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-452-5p 后SOX5 表達(dá)顯著減少，沉默miR-452-5p后SOX5 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）（圖4C）。

圖4 miR-452-5p 靶向SOX5

2.5 過表達(dá)SOX5 降低miR-452-5p 對乳腺癌SKBR-3 細(xì)胞的抑制作用MTT 檢測顯示，與miR-con 組比較，過表達(dá)miR-452-5p 后，miR-452-5p 組乳腺癌SKBR-3 細(xì)胞增殖活性受到抑制，遷移數(shù)和細(xì)胞侵襲數(shù)顯著減少，SOX5、Cyclin D1、CDK4、MMP-2、MMP-9 蛋白水平均顯著降低（P＜0.05）；過表達(dá)SOX5 后，與miR-452-5p+pcDNA 組比較，miR-452-5p+pcDNA-SOX5 組細(xì)胞活性顯著增加、遷移和侵襲數(shù)顯著增加，SOX5、Cyclin D1、CDK4、MMP-2、MMP-9 蛋白水平顯著增加（P＜0.05）（圖5）。

圖5 過表達(dá)SOX5 部分逆轉(zhuǎn)miR-452-5p 抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

2.6 miR-452-5p 調(diào)控SOX5 影響乳腺癌SKBR-3細(xì)胞中Twist1 信號(hào)通路和EMT 的發(fā)生Western blot 結(jié)果顯示，與miR-con 組比較，過表達(dá)miR-452-5p 后，Twist、N-cadherin、Vimentin 蛋白水平顯著降低，E-cadherin 水平顯著升高（P＜0.05）；過表達(dá)SOX5 后，與miR-452-5p 組比較，miR-452-5p+pcDNA-SOX5 組Twist、N-cadherin、Vimentin 蛋 白水平顯著增加，E-cadherin 水平顯著降低，miR-452-5p+pcDNA 組各蛋白水平與miR-452-5p 組無顯著變化（圖6）。

圖6 miR-452-5p 調(diào)控SOX5 影響乳腺癌細(xì)胞中AKT 信號(hào)通路

3 討論

乳腺癌進(jìn)展緩慢，但仍是引起女性癌癥死亡的主要原因［8］。目前關(guān)于乳腺癌的治療主要有手術(shù)、化療、放療、激素治療和靶向治療。隨著對乳腺癌研究的深入，目前的治療方法極大地改善了患者的預(yù)后，但是耐藥性和腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍然限制了當(dāng)前治療方法的有效性。

miRNA 是一類長約20～25 個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，通過堿基互補(bǔ)配對的方式與靶基因結(jié)合，調(diào)控基因的表達(dá)。有研究報(bào)道，提高miR-452-5p 的表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的惡性侵襲和遷移［9］。該研究結(jié)果顯示，miR-452-5p 在乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，過表達(dá)miR-452-5p 可抑制細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，與上述研究結(jié)果相似，提示miR-452-5p 在乳腺癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌基因作用。

Cyclin D1 調(diào)控細(xì)胞增殖周期的G1-S 過程，其在正常組織中不表達(dá)或者低表達(dá)，在惡性腫瘤組織中高表達(dá)［10］。CDK 也是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的重要蛋白，包括CDK1～7，CDK 蛋白的激活依賴于Cyclin 的結(jié)合［11］。CDK4 是細(xì)胞增殖周期G1-S 過程的重要成分，其在腫瘤和細(xì)胞系中異常高表達(dá)［12］。研究報(bào)道，喉癌細(xì)胞中Cyclin D1、CDK4 表達(dá)水平顯著高于正常喉上皮細(xì)胞，抑制Cyclin D1 或CDK4 表達(dá)后喉癌細(xì)胞的增殖受到抑制［13］。該研究中過表達(dá)miR-452-5p 后，乳腺癌SKBR-3 細(xì)胞Cyclin D1、CDK4蛋白水平顯著降低，提示miR-452-5p 發(fā)揮抑癌基因作用，阻滯細(xì)胞的增殖。

MMPs 活化可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）降解，促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［14］。研究報(bào)道，MMP-2、MMP-9 在人卵巢黏液囊腺上皮癌細(xì)胞高表達(dá)，其表達(dá)水平與細(xì)胞的惡性程度，侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［15］。該研究中過表達(dá)miR-452-5p后，乳腺癌SKBR-3 細(xì)胞MMP-2、MMP-9 蛋白水平顯著降低，提示過表達(dá)miR-452-5p 可抑制細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力，進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-452-5p 的抑癌作用。

TargetScan 軟件預(yù)測miR-452-5p 與SOX5 3’UTR 存在結(jié)合位點(diǎn)，該研究進(jìn)一步采用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證顯示，miR-452-5p 靶向調(diào)控SOX5 的表達(dá)。SOX 家族可編碼包括SOX1～15、17、18、21、30等一系列轉(zhuǎn)錄因子，SOX5 基因位于染色體12p12.1區(qū)域，其在細(xì)胞生長、增殖、分化中發(fā)揮重要作用［16］。近年來發(fā)現(xiàn)，SOX5 作為癌基因在前列腺癌、三陰性乳腺癌等幾種癌癥中高表達(dá)［5，7］。該研究結(jié)果顯示，SOX5 在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著高于正常乳腺癌細(xì)胞，與上述研究結(jié)果一致，提示SOX5 在乳腺癌中發(fā)揮癌基因作用。研究表明，SOX5 可以被小RNA 調(diào)控，在前列腺癌細(xì)胞中，miR-139-5p 的升高導(dǎo)致SOX5 表達(dá)下降［17］。該研究中過表達(dá)miR-452-5p 后，乳腺癌SKBR-3 細(xì)胞SOX5 蛋白水平顯著降低，提示miR-452-5p 可調(diào)控SOX5 的表達(dá)。研究報(bào)道，過表達(dá)SOX5 可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲［18］。該研究中過表達(dá)SOX5 后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的增殖活性顯著增強(qiáng)，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)顯著增加，SOX5、Cyclin D1、CDK4、MMP-2、MMP-9 蛋白水平顯著增加，提示過表達(dá)SOX5，可降低miR-452-5p 對乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制、侵襲和遷移抑制作用。惡性腫瘤的發(fā)展是多因素、多步驟的病理變化，有研究報(bào)道，Twist信號(hào)通路、EMT 過程與多種腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移途徑相關(guān)，調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞中SOX5 的表達(dá)，可以抑制Twist 表達(dá)進(jìn)而抑制EMT 過程［19］。該研究中過表達(dá)miR-452-5p 后，Twist、N-cadherin、Vimentin 蛋白水平顯著降低，E-cadherin 水平顯著升高，EMT進(jìn)程受到抑制。過表達(dá)SOX5 后，Twist、N-cadherin、Vimentin 蛋白水平顯著增加，E-cadherin 水平顯著降低，減弱miR-452-5p 對EMT 的抑制作用，提示可通過調(diào)節(jié)SOX5 表達(dá)調(diào)控EMT 過程。從機(jī)制上講，miR-452-5p 調(diào)控SOX5 的表達(dá)，抑制EMT 過程，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，為miR-452-5p作為乳腺癌的治療靶點(diǎn)提供有力的理論依據(jù)。

綜上所述，該研究初步證實(shí)miR-452-5p 可能通過靶向SOX5 調(diào)控Twist 信號(hào)通路進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，其機(jī)制可能與Twist 通路相關(guān)。