HPLC 法測定銀菊止癢洗液中4 種化學成分的含量＊

謝 巍，楊 妮，肖 萍，盧森華，莫禮艷

銀菊止癢洗液由金銀花、野菊花、千里光、白鮮皮、苦參、蛇床子、地膚子七味中藥組成，是筆者醫(yī)院在多年臨床經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，辨證施治總結(jié)出的有效方劑。具有清熱解毒、燥濕止癢之效，用于小兒濕熱內(nèi)蘊，腠理失和所致濕疹。其中，金銀花宣散風熱，清解血毒；野菊花疏散風熱，清肝明目，解毒；蛇床子燥濕，祛風，殺蟲的功效［1］；金銀花、野菊花、蛇床子主要化學成分有綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素等［2-5］。據(jù)相關(guān)文獻報道，綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素具有較強的抗真菌、細菌、抗炎、抗病毒、抗心肌纖維化等作用［6-12］，提示其可能為銀菊止癢洗液所具功效的活性成分。國內(nèi)外有學者對上述化學成分進行了含量測定［13-18］，對控制銀菊止癢洗液的質(zhì)量有很好的指導意義。然而，中藥制劑的成分復雜多樣，銀菊止癢洗液在處方組成上與其他中藥制劑處方有很大差別，在控制其質(zhì)量標準上不可簡單套用其他研究的檢測條件，通過測定銀菊止癢洗液中四種化學成分的含量，可以更好地控制和評價銀菊止癢洗液的內(nèi)在質(zhì)量。該研究建立了HPLC同時測定銀菊止癢洗液中綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素四種化學成分含量的方法，為建立全面合理的銀菊止癢洗液控制和評價標準奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

U3000 高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher公司），HH-S6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠），Synergy 超純水機（美國Millipore 公司），KQ-500GDV 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），XS-205Du 型電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司），高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

銀菊洗劑來源于柳州市婦幼保健院，由野菊花、金銀花、蛇床子、地膚子、千里光、苦參、白鮮皮組成。對照品綠原酸（批號：110753-201716，純度：99.3%）、咖啡酸（批號：110885-200102，純度：100.0%）、蒙花苷（批號：111528-201308，純度：95.1%）、蛇床子素（批號：110822-201308，純度：100.0%）均為中國食品藥品檢定研究院標準物質(zhì)和標準化管理中心提供。

水為超純水，甲醇、乙腈（美國Fisher 公司，色譜純），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備精密稱取綠原酸9.8 mg、咖啡酸10.5 mg、蒙花苷9.7 mg、蛇床子素10.9 mg，分別置于10 ml 容量瓶中，加甲醇超聲5 min（功率：500 W，頻率：40 kHz）使溶解，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得各自單一對照品溶液。再分別精密量取上述單一對照品溶液各2.0 ml，置同一10 ml 量瓶中，用甲醇定容，搖勻，制成每1 ml 分別含綠原酸0.196 mg、咖啡酸0.210 mg、蒙花苷0.194 mg、蛇床子素0.218 mg 的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備精密量取銀菊止癢洗液20.0 ml 于分液漏斗中，用水飽和正丁醇萃取3 次，每次25 ml，合并萃取液，再用正丁醇飽和的水洗滌兩次，每次25 ml，棄去洗液，正丁醇萃取液水浴蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 ml 量瓶中，加甲醇至刻度，濾過，取續(xù)濾液過0.45 微孔濾膜，即得。

2.3 色譜條件采用CAPCELL PAK C18MGⅡ色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，30%A；10～30 min，30%A→50%A；30～35 min，50%A→70%A；35～40 min，70%A；40～41 min，70%～90%A；41～45 min，90%A；45～46 min，90%A→30%A；46～50 min，30%A），流速為1.0 ml/min，檢測波長為330 nm，柱溫為25 ℃，進樣量為5 μl。采用外標法計算含量，理論塔板數(shù)以綠原酸計算應(yīng)不低于5000，分離度大于1.5。

2.4 線性關(guān)系考察精密吸取“2.1”項單一對照品溶液各5 ml，置于25 ml 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成每1 ml 分別含綠原酸0.196 mg、咖啡酸0.210 mg、蒙花苷0.194 mg、蛇床子素0.218 mg 的母液，從母液中分別精密量取0.5、1、2、3、5 和10 ml，分別置于10 ml 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，分別進樣20 μl，以測得的相應(yīng)信號（峰面積）對被測物質(zhì)的量作圖，得到綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素的回歸方程分別為：

Y=12.285X+0.1825 r=0.999 0

Y=11.566X+0.1853 r=0.999 0

Y=10.864X+0.0183 r=0.999 0

Y=11.937X+0.0174 r=0.999 0

線性范圍分別為1.96～39.2 μg、2.1～42.0 μg、1.94～38.8 μg、2.18～43.6 μg，X 表示樣品濃度，Y 表示該濃度下的峰面積。

2.5 精密度試驗精密量取銀菊止癢洗液20.0 ml于分液漏斗中，按“2.2 供試品溶液制備方法”制備，進樣5 μl，連續(xù)測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素的峰面積的RSD 分別為1.5%、0.05%、0.08%、0.25%；再取同一份銀菊止癢洗液供試品溶液，分別于溶液制備后1、2、3、4、5、6 d 同法進樣，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素峰面積的RSD 分別為0.45%、0.58%、0.69%、0.27%，結(jié)果表明儀器在日內(nèi)和日間精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗取同一份銀菊止癢洗液供試品溶液，分別于溶液制備后0 h、2 h、4 h、12 h、24 h 進樣，測定，記錄各成分峰面積的RSD。結(jié)果綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素峰面積的RSD 分別為0.07%、0.56%、1.16%、2.07%（n=5），表明24 h 內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

圖1 混合對照品（A）和銀菊止癢洗液（B）HPLC 色譜圖

2.7 重復性試驗取同一批銀菊止癢洗液6 份，每份約20.0 ml，精密稱定，按“2.2 供試品制備方法”制備，分別進樣5 μl，記錄峰面積，并計算含量。綠原酸的平均含量為0.9625 mg/ml，RSD 為1.61%；咖啡酸0.5862 mg/ml，RSD 為0.63%；蒙花苷0.7153 mg/ml，RSD 為1.41%；蛇床子素0.5631 mg/ml，RSD 為1.93%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率試驗精密稱定已測定含量（每1 ml中含綠原酸0.9572 mg；1 g 中含咖啡酸0.5560 mg；含蒙花苷0.7064 mg；含蛇床子素0.5436 mg），精密量取銀菊止癢洗液6 份，每份10 ml，另精密稱取對照品綠原酸47.86 mg、咖啡酸27.80 mg、蒙花苷35.32 mg、蛇床子素27.18 mg，置于100 ml 量瓶中，加適量甲醇超聲使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品儲備液。分別在上述6 份藥材中精密加入混合對照品儲備液10 ml，按“2.2 供試品制備方法”制備，分別進樣5 μl，記錄綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素的峰面積，計算含量，并計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 銀菊止癢洗液中4 種化學成分的回收率試驗數(shù)據(jù)（n=6）

2.9 樣品含量測定精密量取6 批不同批號的銀菊止癢洗液，每份約20 ml，按“2.2”項方法制備供試品溶液，分別進樣5 μl 測定，記錄綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素的峰面積，并計算含量，結(jié)果見表2。

表2 銀菊止癢洗液中4 種化學成分的含量測定結(jié)果（mg/ml，n=4）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的選擇該研究優(yōu)選了不同提取條件制備供試品溶液，采用單因素變量法，考察了不同萃取溶劑（乙酸乙酯、正丁醇和乙醚溶液）、萃取用量（20、25、30 ml）、萃取次數(shù)（1、2、3、4 次）、除雜溶劑（乙醚、石油醚，正丁醇飽和水）對銀菊止癢洗液中四個化學成分提取率的影響。結(jié)果表明銀菊止癢洗液用水飽和正丁醇萃取3 次，每次25 ml，合并萃取液，再用正丁醇飽和的水洗滌2 次，每次25 ml，棄去洗液，四種目標成分提取效率明顯，且與其余成分分離明顯，可用于測定四個有效成分含量。

3.2 色譜條件的選擇綠原酸與蛇床子素極性相差較大，以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相梯度洗脫［19］、乙腈-水（65∶35）［20］發(fā)現(xiàn)蒙花苷和蛇床子素色譜峰的保留時間較長，且基線不平整。隨后改用甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫，各成分出峰時間比較適中，且峰分離度較好，因此選擇甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液作流動相，進行梯度洗脫。

3.3 含量測定結(jié)果差異銀菊洗劑由野菊花、金銀花、蛇床子、地膚子、千里光、苦參、白鮮皮組成，分別由不同批號的中藥飲片組成，中藥飲片由于產(chǎn)地、種植等原因，其有效成分含量均有差異，導致不同批次的銀菊止癢洗劑中綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素有所差異。

該實驗建立了HPLC 同時測定銀菊止癢洗液藥材中化學成分綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素含量的方法，并測定了6 批不同批次銀菊止癢洗液藥材中綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素4 種化學成分的含量。建立含量的方法，操作簡便，分離度高，重復性好，結(jié)果準確，可作為銀菊止癢洗液含量測定方法，但是：不同批次銀菊止癢洗液藥材中四個化學成分的含量有一定差異性。提示采用多指標定量方法，能更好地控制銀菊止癢洗液藥材的內(nèi)在指標。