魚類肌肉組織18S rRNA 降解變化與死亡時間的關(guān)聯(lián)性

楊阿敏，李彥彥，葉浩達(dá)，王亞軍，嚴(yán)小軍，陶 震

(1.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波 315211)

自我國實施了海洋伏季休漁制度以來，如何確定市售魚類的死亡時間已成為了執(zhí)法部門面臨的一個難題。雖然魚類死后，魚體組織會發(fā)生形態(tài)、物理特征及化合物水平的變化，但目前尚未建立一些適用于魚類死亡時間推斷的檢測指標(biāo)。因此，尋找穩(wěn)定、靈敏的檢測指標(biāo)是建立死亡時間確定方法的重點(diǎn)之一。

近年來，多項研究表明RNA 在法醫(yī)學(xué)死亡時間推斷中具有應(yīng)用價值。例如，李文燦等[1]利用實時定量PCR(RT-qPCR)方法檢測死后大鼠心肌組織中RNA 分子的含量變化，發(fā)現(xiàn)18s 與microRNA 分子miR-1-2d 的循環(huán)數(shù)閾值(Ct)的差值(ΔCt)與死亡時間存在相關(guān)性。朱怡等[2]采用類似的RT-qPCR 對RNA 分子進(jìn)行定量分析，認(rèn)為腦組織中β-actin mRNA 和18s 的時序性降解與死亡時間存在較好的相關(guān)性。INOUE,et al[3]采用類似的策略，檢測了死后大鼠肝、心、肺組織中28S 核糖體RNA(28s)、18s 的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)降解與時間呈線性關(guān)系，但降解速率存在組織特異性，這可能主要受組織內(nèi)源性核糖核酸酶(RNase)酶活水平的影響[4]。這些研究揭示組織中的RNA 在一定環(huán)境條件下的變化具有一定規(guī)律性，組織內(nèi)的RNase 酶活水平是決定其RNA 降解速率最重要的因素之一。這些發(fā)現(xiàn)成為了采用RNA 的時序性降解進(jìn)行死亡時間推斷的理論基礎(chǔ)[5-7]。受這些研究的啟發(fā)，本研究采用模式物種斑馬魚Danio rerio 為實驗對象，在實驗室內(nèi)模擬魚類在冷藏保存(0～1 ℃)過程中，分析魚類肌肉組織中18s 降解規(guī)律，并建立了基于肌肉組織中18s 特定片長降解產(chǎn)物的豐度作為檢測指標(biāo)，推測冷藏條件下魚類貯存時間的方法原型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗所用斑馬魚來自于實驗室所養(yǎng)殖的斑馬魚，體長4～5 cm。養(yǎng)殖系統(tǒng)水溫維持在(22±1) ℃。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：2×Es TapMasterMix (Dye)、DL 5 000 DNA Marker、DL 1 000 DNA Marker 購自Takara 公司、Regular AGAROSE G-10 購自Biowest 公司、(Ambion) TRIzolReagent 試劑盒購自上海玉博生物科技有限公司、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScriptII Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

主要儀器：BIO-RAD C1 000 Thermal Cycler PCR 擴(kuò)增儀、SIGMA 1-16K 低溫高速離心機(jī)、Thermo NANODROP 1 000 型核酸蛋白測定儀、北京六一DYY-6C 型電泳儀電源。

1.3 實驗設(shè)計及樣品采集

實驗采用斑馬魚作為研究對象進(jìn)行死亡時間估測方法的設(shè)計和初步驗證。預(yù)實驗中所用斑馬魚先經(jīng)麻醉，去除魚皮后取背部兩側(cè)(側(cè)線以上)的肌肉，并迅速轉(zhuǎn)移至0 ℃條件下進(jìn)行處理。取樣時間為1～14 d，每相隔1 d 取樣1 次，各時間組均包含3 個生物學(xué)重復(fù)。所有實驗樣品經(jīng)低溫保存處理結(jié)束后，同時取肌肉組織30 mg，用于總RNA 的提取，并以新鮮斑馬魚肌肉作為對照組(即低溫保存處理0 d 的樣品)。

1.4 總RNA 的提取及凝膠電泳分析

實驗采用TRIzol 法分離上述各時間點(diǎn)肌肉樣品中的總RNA，具體操作參照所用試劑說明書。用NANODROP 1000 型核酸蛋白測定儀測定RNA 樣品濃度，并用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析各樣品所提取的RNA 的降解情況。

1.5 cDNA 合成

取上述各時間點(diǎn)樣品提取的總RNA 各500 ng，根據(jù)HiScriptII Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟，分別去除殘余基因組DNA 后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 引物設(shè)計及特異性和靈敏度分析

實驗利用Primer 3 軟件進(jìn)行引物的設(shè)計，所設(shè)計的引物為了實現(xiàn)2 種目的的PCR 擴(kuò)增分析，所有引物的相關(guān)信息參照表1。其一為了分析18s 分子在死后的降解趨勢，即18s 分子是否存在逐步從長片段到更短片段轉(zhuǎn)化的趨勢。實驗設(shè)計了4 對擴(kuò)增遞減片段長度的引物：1700F/1700R、1600F/1600R、1400F/1400R、1000F/1000R，用于擴(kuò)增18s 多片段長度PCR(18s-ML PCR)反應(yīng)，其所選片段均接近18s 序列中部區(qū)域。其二為了分析動物死后細(xì)胞內(nèi)18s 降解是否存在位點(diǎn)的時序性，即降解是否存在一定的區(qū)域偏好性。實驗基于斑馬魚18s 序列設(shè)計了7 對引物：F1/R1-F7/R7，用于疊瓦氏PCR(Tiling PCR)反應(yīng)；它們可特異性擴(kuò)增相似片段的大小(均約600 bp)，同時所擴(kuò)增片段兩兩相互交叉，共同覆蓋整個18s 基因片段。各引物在18s 基因上的結(jié)合位點(diǎn)如圖1 所示。上述所有引物的PCR 反應(yīng)退火溫度均設(shè)置為60 ℃左右。

表1 所有引物的相關(guān)信息Tab.1 Information about all primers

圖1 18S 疊瓦氏PCR 引物位置示意圖Fig.1 Positions of primers targeting 18S rRNA cDNA

引物的特異性通過以新鮮斑馬魚肌肉組織cDNA 為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)檢測。為了比較各引物間的靈敏度，實驗用引物對18sUS-F/18sDS-R 擴(kuò)增了斑馬魚18s 基因，并根據(jù)載體操作說明將片段克隆至pMD19T 載體(Takara)上，構(gòu)建了18s 模板質(zhì)粒；以梯度濃度稀釋的該質(zhì)粒(102～106拷貝數(shù)·μL-1)為PCR 模板，比較了上述各引物的擴(kuò)增靈敏度。如果靈敏度有差異，則重新設(shè)計引物，使所有本實驗所設(shè)計的引物的靈敏度相近。PCR 反應(yīng)體系為：2×Es TapMasterMix(Dye)25 μL、18sUS-F/18sDS-R 各2 μL、模板質(zhì)粒1 μL、ddH2O 補(bǔ)到50 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；接34 個循環(huán)：94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min；以及72 ℃終延伸2 min。

1.7 疊瓦氏PCR 擴(kuò)增

本研究假設(shè)斑馬魚肌肉組織內(nèi)18s 分子隨著冷藏時間而降解為逐步短片段，而且不同的18s 分子降解是獨(dú)立的，那么擴(kuò)增更短片段的引物更有可能在時間更長的樣品中得到陽性PCR 反應(yīng)結(jié)果。為了驗證上述假設(shè)，實驗首先用4 對18s-ML PCR 引物，對1.4 中準(zhǔn)備的時間點(diǎn)的cDNA 樣品進(jìn)行了擴(kuò)增，分析各段長產(chǎn)物的擴(kuò)增與死亡時間的關(guān)聯(lián)性；如果18s 分子隨時間發(fā)生獨(dú)立地有序降解，那么擴(kuò)增更短片段引物可在經(jīng)歷更長死亡時間的樣品中得到陽性PCR 反應(yīng)。此外，為了分析降解是否存在一定位置上的偏好性，實驗用7 對tiling PCR 引物，對同樣的樣品進(jìn)行了擴(kuò)增，分析各18s 序列區(qū)域的擴(kuò)增魚死亡時間的關(guān)聯(lián)性；如果降解存在位點(diǎn)上的偏好性，那么不同引物對各時間點(diǎn)樣品的PCR 反應(yīng)結(jié)果會存在差異。PCR 反應(yīng)體系和條件同1.5 所述。

2 結(jié)果

2.1 總RNA 隨死后時間變化的電泳分析結(jié)果

如圖2 總RNA 樣品的電泳分析圖譜所示，新鮮的魚類組織呈現(xiàn)較為明顯的3 條亮帶(從上到下分別代表28sRNA、18sRNA、5sRNA 條帶)，說明RNA 的降解程度低。隨著魚類保存時間延長，可見上述特征條帶的，其表現(xiàn)為28s 和18s 條帶的降解。

圖2 各死亡時間點(diǎn)樣品總RNA 的瓊脂糖電泳分析結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoresis of RNA samples

2.2 PCR 引物特異性和靈敏度

通過對引物PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的分析，確認(rèn)所設(shè)計的引物均能特異性對斑馬魚18s 片段進(jìn)行擴(kuò)增。靈敏度的分析表明，各引物在所使用的PCR 反應(yīng)體系和條件下，它們的靈敏度均為103拷貝數(shù)·μL-1的初始模板濃度(圖3)，所以不同引物對用于同一樣品擴(kuò)增的結(jié)果具有橫向的可比較性。

圖3 引物的靈敏度圖Fig.3 Sensitivity of primers

2.3 肌肉組織內(nèi)18s 降解的時序性

4 對擴(kuò)增不同引物的18s-ML PCR 反應(yīng)結(jié)果，顯示所擴(kuò)增產(chǎn)物條帶均隨著死亡時間延長而逐漸變淡，直至無法獲得陽性擴(kuò)增；同時，擴(kuò)增短片段的引物能在死亡更久的樣品中得到陽性擴(kuò)增。各時間點(diǎn)樣品在采用引物1 700F/1 700R、1 600F/1 600R、1 400F/1 400R 擴(kuò)增反應(yīng)中，獲得陽性和陰性臨界點(diǎn)的死亡時間分別為1、5 d 和7 d，而引物1 000F/1 000R 在實驗所采集的樣品中均獲得了陽性擴(kuò)增(圖4)。上述結(jié)果反映了肌肉組織中18s 分子隨死亡時間在發(fā)生降解，而且降解方式可能從長片段逐漸縮短直至完全碎片化的方式發(fā)生。

圖4 各時間點(diǎn)斑馬魚肌肉樣品cDNA 的18s-ML PCR 反應(yīng)結(jié)果Fig.4 18s-ML PCR results of fish muscle cDNA samples

2.4 肌肉組織內(nèi)18s 降解的位點(diǎn)偏好性

在魚類死亡6 d 后的樣品中，使用引物對F7/R7(擴(kuò)增區(qū)域1 452～2 055 bp)進(jìn)行PCR 檢測的結(jié)果均為陰性；而引物對F5/R5(擴(kuò)增區(qū)域901～1 519 bp)的陰性擴(kuò)增結(jié)果則出現(xiàn)在8 d 后的樣品中，而其他靶向離3’端更遠(yuǎn)區(qū)域的引物對在所有樣品中都得到陽性擴(kuò)增結(jié)果。上述疊瓦氏PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果說明，18s 的降解過程可能存在一定的位點(diǎn)時序性，即靠近3’端的區(qū)域要比5’端區(qū)域更快地開始降解。

3 討論

動物死后細(xì)胞內(nèi)RNA 的降解主要由胞核酸酶(RNase)等分子機(jī)制所驅(qū)動的[8-9]，而且組織內(nèi)RNA 降解速率取決于來源組織，如肝臟等富含核酸酶的組織中，多種核酸酶的水平具較高，可以快速地引發(fā)RNA 降解，但降解的規(guī)律性較弱。而肌肉等組織核酸酶含量相對低且成分穩(wěn)定，所以降解過程可能更具規(guī)律性[9]。因此本實驗選取肌肉組織作為研究對象，觀察魚類死亡后冷藏時間與RNA 降解之間關(guān)聯(lián)性。此外，低溫或冰溫保鮮技術(shù)是目前水產(chǎn)品貯存及流通中重要的保鮮方法[10]，所以探尋在此溫度區(qū)間內(nèi)死后動物組織RNA 降解規(guī)律具有潛在的應(yīng)用前景。

真核生物細(xì)胞內(nèi)所有RNA 中含量最高的為核糖體RNA(rRNA)，約占真核生物總RNA 的85%[5]，而18s rRNA 在物種間具有較好的保守性，即基因序列間具有較高的同源性，所以其基因序列常被用于物種間的系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化分析[11-12]。在分子生物學(xué)實驗中，常用rRNA 作指示分子判斷所提取RNA 樣品的完整性[13]。因此，本研究嘗試了以18s 作為靶標(biāo)RNA 分子，通過結(jié)合PCR 檢測多種特定長度以上18s 降解物相對豐度的方式進(jìn)行探究降解度與死亡時間之間的量化關(guān)系。

曾有多項研究報道了單獨(dú)利用18s 或結(jié)合及其他RNA 的降解推斷動物死亡時間的方法[1-2,15]，其核心為通過將RT-qPCR 中18s 以及其他RNA 的Ct 值或ΔCt 值與死后間隔時間進(jìn)行統(tǒng)計回歸分析并建立推斷方程。這些研究多基于小鼠模型展開，可能與魚類存在差異。而本研究的結(jié)果揭示了斑馬魚肌肉細(xì)胞內(nèi)18s 分子降解可能存在一定程度的位點(diǎn)偏好性，所以基于18s Ct 值的方法可能易受引物擴(kuò)增區(qū)域的影響。為了克服上述的方法缺陷，本實驗設(shè)計了基于普通PCR 擴(kuò)增多片段長度18s 區(qū)域的方法，通過PCR 擴(kuò)增結(jié)果與死亡時間的關(guān)系來推斷魚類死后冷藏時間的方法。此方法可確定魚類死亡時間范圍，而且對儀器要求低。然而，該方法區(qū)分死亡時間的分辨率不高，仍需要進(jìn)一步的測試和完善。例如，在18s 基礎(chǔ)上增加基因靶點(diǎn)，選取一些保守性較高且表達(dá)豐度適中的基因為對象，分析降解速率與死亡時間之間的規(guī)律。另外，實驗的結(jié)果也需要在更多的魚類魚種中進(jìn)行驗證，以及根據(jù)需求探索在不同溫度條件下的應(yīng)用性。

綜上，本研究確認(rèn)了在冷藏條件下魚類肌肉組織18s 降解與死亡時間具有相關(guān)性，提出了一種基于PCR 檢測多個特定片長18s 降解物豐度的方法推測魚類死亡時間范圍的方案，但仍需要進(jìn)一步的優(yōu)化；其次，發(fā)現(xiàn)了斑馬魚18s 分子在肌肉組織內(nèi)自然降解存在一定的位點(diǎn)偏好性，具體機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。