金槍魚加工副產(chǎn)物發(fā)酵液對植物的抗菌促生長活性

王一凡，王志高，易 沖，吳 越，張澤坤，王坤美，羅紅宇

(浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316022)

目前，全世界范圍內(nèi)人們對海洋資源的開發(fā)不斷擴(kuò)大，但是在對海產(chǎn)品的捕獲和加工中，大量低商業(yè)價值的原料和水產(chǎn)副產(chǎn)物未能得到充分利用，并且隨著漁業(yè)加工業(yè)的快速發(fā)展，水產(chǎn)加工副產(chǎn)物數(shù)量急劇增加[1]。例如，單在歐盟水產(chǎn)加工中產(chǎn)生的副產(chǎn)物數(shù)量估計為每年500 萬t，其中超過60%的副產(chǎn)物來自各種魚片、煙熏魚的加工，此外魚罐頭工業(yè)、甲殼類和軟體動物生產(chǎn)加工過程中，也有大量的廢棄物產(chǎn)生[2]。在中國，2019 年水產(chǎn)品產(chǎn)量達(dá)為6 450 萬t[3]，但其中只有40%用于加工，利用率低于50%[2]。目前國內(nèi)對這些低值資源的處理有兩大問題，一是資源的浪費(fèi)，蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和油脂等大量營養(yǎng)物質(zhì)的利用不足，二是處理如此多的高污染有機(jī)物會造成嚴(yán)重的環(huán)境和經(jīng)濟(jì)問題。因此，有效提高低值水產(chǎn)資源的利用率以及研發(fā)清潔環(huán)保處理技術(shù)和方法具有重要的意義。

此外，化肥和農(nóng)藥的使用對植物的生長和環(huán)境都有非常大的影響，越來越多的人考慮將生物制劑用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[4]。DAO,et al[5]使用1 個5 L 的帶狀反應(yīng)器對水產(chǎn)廢棄物進(jìn)行了大規(guī)模的生物降解，發(fā)現(xiàn)了土壤短芽孢桿菌Brevibacillus agri、蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus、2 種地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis、副短芽孢桿菌Bacillus parabrevis等5 種潛藏在的水產(chǎn)廢棄物中的降解菌，并將其轉(zhuǎn)化為液體肥料；KIM,et al[6]研究利用土壤短芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、兩種地衣芽孢桿菌和副短芽孢桿菌將魚類廢棄物進(jìn)行發(fā)酵將其轉(zhuǎn)化為肥料；LEWER,et al[7]在刺糖多糖孢Saccharopolysporasp.的發(fā)酵過程中分離出發(fā)酵過程中產(chǎn)生的毒素，利用分離出來的毒素生產(chǎn)出多殺菌素殺蟲劑；JEMIL,et al[8]發(fā)現(xiàn)由斑馬藍(lán)蛋白水解物通過發(fā)酵得到的水解物中獲得抗菌活性與一種蛋白水解細(xì)菌(拮抗內(nèi)生細(xì)菌A21)的抗菌活性一致。目前越來越多生物制劑被應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，本文將生物制劑運(yùn)用到水產(chǎn)加工副產(chǎn)物中，探究發(fā)酵液對植物的抗菌促生長活性，可提高水產(chǎn)加工副產(chǎn)物的利用率，促進(jìn)農(nóng)業(yè)發(fā)展，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代化綠色生產(chǎn)。

生物肥料被譽(yù)為環(huán)保、低成本的產(chǎn)品，可以有效解決糧食生產(chǎn)過程中的不安全問題[9]。由于EM 菌(包含光合菌、酵母菌、乳酸菌等有益菌類)在種植、畜牧等行業(yè)中的應(yīng)用非常廣泛。本實(shí)驗(yàn)課題組前期從低值水產(chǎn)品中分離的菌株(發(fā)酵菌株)和EM 菌同樣有發(fā)酵作用，為了探究EM 菌和發(fā)酵菌株代謝產(chǎn)生的活性物質(zhì)的抗菌特性，利用瓊脂擴(kuò)散法評價發(fā)酵液的抗菌活性，利用盆栽實(shí)驗(yàn)初步評價發(fā)酵液的抗病害能力，并考察了發(fā)酵液抗菌活性的穩(wěn)定性，為發(fā)酵菌活性代謝產(chǎn)物的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，進(jìn)一步開發(fā)生物肥料奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料

市售有機(jī)液肥家庭濃縮營養(yǎng)液(樣品A)、水產(chǎn)加工副產(chǎn)物(主要是金槍魚Thunnus albacores，含少量棘頭梅童魚Collichthys lucidus等加工副產(chǎn)物，包含魚頭、魚骨、內(nèi)臟等)，由岱山縣綠康源海洋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)提供，將副產(chǎn)物粉碎至1 cm×1 cm 以內(nèi)，裝入聚乙烯包裝袋于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

發(fā)酵菌株：施氏假單胞菌Pseudomonas stutzeri、類芽孢桿菌Paenibacillussp、黑曲霉Aspergillus niger、季也蒙假絲酵母Candida guilliemondii、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis separated，本課題組從低值漁獲物和加工副產(chǎn)物中分離并進(jìn)行了鑒定；EM 菌岱山綠康源海洋生物科技有限公司提供；抗菌活性測試菌株：枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis(批號：CMCC 10002)、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus(批號：CMCC 26003)、大腸桿菌Escherichia coli(批號：CGMCC 1.1100)、綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa(批號：CMCC 10104)、傷寒沙門氏菌Salmonella typhus(批號：CGMCC 21483)、八疊球菌Sarcinasp.(批號：CMCC 1.258)購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)。瓜鏈格孢菌Alternaria cucumerina、齊整小核菌Sclerotium rolfsii、擬盤多毛孢Pestalotiopsissp.和核盤菌Sclerotinia sclerotiorum從腐敗水果蔬菜中分離鑒定。

1.1.3 化學(xué)試劑

NaOH；HCl；pH 8.0 緩沖液；茚三酮均為分析純國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。多菌靈購自舟山華潤萬家。

1.1.4 植物種子

甘藍(lán)型油菜種子購自舟山定海潔姬種子店。

1.1.5 設(shè)備

手提壓力蒸汽滅菌器(DSX-280KB24)，上海申安醫(yī)療器械廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52AA)，上海亞龍生化儀器廠；孵化器(DHP-9052)，一恒科學(xué)儀器有限公司；分光光度計(721G)，上海儀電分析儀器有限公司；水浴鍋(HHSII-1)，上海波迅工業(yè)有限公司；發(fā)酵罐(BioFlo-CelliGen115)，NBS 公司。

1.2 方法

1.2.1 ABFI 和ABFII 的制備

參照SONG Ru,et al[10]方法，ABFI 的制備選用活化后的EM 菌來發(fā)酵水產(chǎn)副產(chǎn)物制得。ABFII 的制備選用經(jīng)篩選過后的發(fā)酵菌株(施氏假單胞菌、類芽孢桿菌、黑曲霉、季也蒙念珠菌、枯草芽孢桿菌)對水產(chǎn)副產(chǎn)物進(jìn)行發(fā)酵制得。

1.2.2 抑菌活性測定

參照魏東東等[11]方法，采用瓊脂擴(kuò)散法對發(fā)酵液(ABFI,ABFII)和樣品A 進(jìn)行抗菌活性的研究。吸取100 μL 的被測真菌孢子懸浮液(106CFU·mL-1)接種在瓊脂平板上。吸取50 μL 不同濃度的ABFI、ABFII 和樣品A 溶液加入直徑為6 mm 孔中。將真菌培養(yǎng)皿在30 ℃下培養(yǎng)48 h；細(xì)菌培養(yǎng)皿在37 ℃下培養(yǎng)24 h，游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。高濃度(HC)為樣品A、ABFI 和ABFII 初始濃度，低濃度(LC)是初始濃度的一半，通過稀釋一倍體積制得。

1.2.3 發(fā)酵液的穩(wěn)定性

本實(shí)驗(yàn)考察了發(fā)酵液抑菌活性對熱和酸堿的穩(wěn)定性。選用具有抑制效果的致病菌，采用瓊脂擴(kuò)散法，對不同pH 和不同溫度熱處理的ABFII 的抗菌活性進(jìn)行了比較。在熱穩(wěn)定性試驗(yàn)中，將ABFII 分別在35、45、55、65、75、85 和95 ℃的水浴中加熱處理15～30 min，然后冷卻到室溫得到熱處理樣品。在pH 敏感性試驗(yàn)中，用HCl (6 mol·L-1)和NaOH (6 mol·L-1)調(diào)整使ABFII 的pH 分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10，測定9 個樣品的抗菌活性。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 組平行。

1.2.4 發(fā)酵液的化學(xué)成分分析

采用茚三酮顯色法[12]對ABFI 和ABFII 中的氨基酸進(jìn)行定量測定，以精氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品為校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)，計算氨基酸濃度。在0.005 4～0.064 0 mg·mL-1范圍內(nèi)，獲得了良好的線性關(guān)系，回歸曲線為y=0.000 3 x-0.007 3(R2=0.992)，y 為570 nm 處吸光度，x 為氨基酸的濃度(mg·mL-1)，R2為相關(guān)系數(shù)。發(fā)酵液中蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)等均由北京Pony 譜尼測試集團(tuán)有限公司測定。

1.2.5 盆栽實(shí)驗(yàn)

為測試ABFII 作為液體肥料的潛在用途，實(shí)驗(yàn)參照范瑛閣等[13]方法，以自來水為空白組，ABFII 為實(shí)驗(yàn)組，商業(yè)殺蟲劑多菌靈為陽性對照組進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)，一周后測量蔬菜最大和最小葉片的長度和直徑。將自來水、ABFII 和1 g·mL-1的多菌靈噴灑100 mL 在斑點(diǎn)植物的葉子上，24 h 后，接種腐敗孢子擬盤多毛孢于葉片上使其受侵染。7 d 后，隨機(jī)采摘3 個組的葉片，放入30 mL 水的錐形瓶中攪拌1 h，從錐形瓶中吸取100 μL 溶液涂在馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板上。平板在30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 d，觀察計數(shù)菌落的數(shù)量來評價各組抑菌效果。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析的顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液抗菌活性評價

抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3 種發(fā)酵液的低濃度組和高濃度組對枯草芽孢桿菌、八疊球菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌均無抑制作用。

圖1、2 分別是ABFI 和ABFII 對瓜鏈格孢菌，齊整小核菌，擬盤多毛孢和核盤菌的抗菌試驗(yàn)。從表1中可以得出樣品A 和ABFI 對試驗(yàn)病原菌的增殖沒有任何抑制作用，而ABFII 能不同程度地抑制瓜鏈格孢菌和擬盤多毛孢的增殖，其抑菌圈直徑在9～15 mm 之間。

表1 樣品A、ABFI、ABFII 的抗真菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 A sample,ABFI,and ABFIII antifungal spectrum

圖1 ABFI 抗真菌試驗(yàn)(1-LC，2-HC)Fig.1 ABFI antifungal test (1-LC，2-HC)

圖2 ABFII 抗真菌試驗(yàn)(1-LC，2-HC)Fig.2 ABFII antifungal test (1-LC，2-HC)

本實(shí)驗(yàn)說明ABFII 在低高濃度時對所測瓜鏈格孢菌和擬盤多毛孢有明顯的抑制作用，濃度越高，抑制效果越明顯，同濃度下ABFII 對擬盤多毛孢的抑制更好。而ABFI 只有在高濃度時對瓜鏈格孢菌有抑制作用。擬盤多毛孢和瓜鏈格孢菌會讓植物得葉斑病，使葉肉組織枯死。SONG Ru[14-15]證實(shí)了半鰭鳳尾魚胃蛋白酶水解得到的產(chǎn)物具有很高的抗大腸桿菌的活性。RAJANBABU,et al[16]也報道了魚類分泌不同種類的天然肽，這些肽參與宿主的防御機(jī)制，用來防御由各種微生物引起的疾病，對革蘭氏陽性和陰性菌，真菌和病毒都有一定的抑制活性。PAN,et al[17]已經(jīng)證明了從魚中提取的抗菌肽-1 對二倍體真菌(白色念球菌Candida albicans)的抗菌作用。許多文獻(xiàn)[14-18]證明海產(chǎn)品提取物有抗菌活性這和我們研究ABFII 對擬盤多毛孢和瓜鏈格孢菌的抑制結(jié)果非常相似。然而，樣品A 和ABFI 對病原菌的增殖并沒有表現(xiàn)出顯著的抑制作用，但樣品A 的化學(xué)組成和ABFII 類似，所以目前樣品A 是被用作肥料而不是抗菌劑[19]。EM 菌中的放線菌和乳酸菌可以分解粗纖維等大分子物質(zhì)，光合細(xì)菌可以利用太陽光并且可以吸附重金屬。所以常被應(yīng)用在畜牧業(yè)[20-21]和污水處理[22]等方面。故ABFI 缺乏顯著的抗菌活性可能是由于水產(chǎn)副產(chǎn)物中能夠被EM菌發(fā)酵利用的部分較少，沒有得到大量有抑制活性的物質(zhì)，也可能EM 菌發(fā)酵過程產(chǎn)生的物質(zhì)能夠中和或變性其生物活性。

在3 種發(fā)酵方式中，只有ABFII 在低高濃度都對所測瓜鏈格孢菌和擬盤多毛孢有明顯的抑制作用，而ABFI 只有在高濃度時對瓜鏈格孢菌有抑制作用，從表4 數(shù)據(jù)中猜測可能是由于ABFI 中蛋白質(zhì)含量較低，所以猜測抑菌成分與蛋白質(zhì)有關(guān)，因此選擇抑菌效果較好的ABFII 測定其熱穩(wěn)定性和pH 敏感性并進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。

2.2 ABFII 的穩(wěn)定性

為了確定發(fā)酵液ABFII 抑菌活性的穩(wěn)定性，本文考察了不同溫度和pH 對其抑菌活性的影響。

2.2.1 ABFII 的pH 敏感性

室溫下測定了ABFII 在不同pH 下的抑菌穩(wěn)定性。從表2 可以看出在pH 為3 和4 時ABFII 對擬盤多毛孢的抑制作用最強(qiáng)，抑制圈直徑為20 mm，在pH 為2、5 和6 時，也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制效果，抑菌圈直徑為10～12 mm。ABFII 對瓜鏈格孢菌的抑制效果隨pH 的增大呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，在pH 為3 時，抑制效果最強(qiáng)，抑制圈直徑為14 mm，pH 為6 時，抑制效果最弱，抑制圈直徑為9 mm。以不同pH 的蒸餾水作為空白組，發(fā)現(xiàn)不同pH 的蒸餾水對擬盤多毛孢和瓜鏈格孢菌的增殖沒有任何抑制作用?？梢姡珹BFII的抑菌活性受pH 的影響，在pH 為4 時，對擬盤多毛孢和瓜鏈格孢菌的抑制作用最強(qiáng)。而在中性和堿性環(huán)境下，ABFII 對擬盤多毛孢和瓜鏈格孢菌沒有抗真菌活性。

表2 不同pH 下ABFII 的穩(wěn)定性研究Tab.2 Stability of ABFII at different pH values

2.2.2 ABFII 在pH 6.12 時熱穩(wěn)定性

從表3 可以看出，當(dāng)溫度小于65 ℃時，加熱發(fā)酵液15 或30 min，對擬盤多毛孢和瓜鏈格孢菌的抑菌圈直徑范圍分別為10～15 mm 和9～13 mm，說明ABFII 在溫度低于65 ℃時對擬盤多毛孢和瓜鏈格孢菌的抗真菌活性沒有影響。而當(dāng)溫度高于75 ℃以后，加熱發(fā)酵液15 或30 min，它就失去了抗真菌能力。

表3 ABFII 對熱的敏感性Tab.3 Sensitivity of ABFII to heat

熱穩(wěn)定性試驗(yàn)和pH 敏感性試驗(yàn)表明：pH 和溫度對水產(chǎn)副產(chǎn)物發(fā)酵液的穩(wěn)定性有重要影響。GOUTEFONGEA,et al[23]證明pH 高于5.8 時對溶液中蛋白質(zhì)在熱變性具有保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)在pH 為6.12的條件下進(jìn)行。CHARPENTIER,et al[24]還表明，在pH 低于5.8 且溫度高于40 ℃時，蛋白質(zhì)在溶液中的變性非常明顯。ABFII 抗菌化合物的顯著熱變性僅在75 ℃以上時可以觀察到，pH 高于5.8 是一個決定因素，其次短暫的加熱時間也可能是一個決定因素。

pH 影響微生物增殖可以作用于以下幾個因素：蛋白質(zhì)殘基(或肽殘基)的電離，蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，作為短鏈蛋白質(zhì)，抗菌肽具有pH 敏感特性等[25]。據(jù)報道，大多數(shù)已知的抗菌肽是陽離子的，它們的作用機(jī)制與它們的陽離子特性和在溶液中與目標(biāo)磷脂膜接觸時適應(yīng)兩親性結(jié)構(gòu)的能力有關(guān)[26]。增加肽的正電荷從而提高其抗菌和溶血活性[27-28]，相反，肽正電荷的減少導(dǎo)致抗菌活性的喪失。MATSUZAKI,et al[28-29]也證實(shí)正電荷的減少會導(dǎo)致靜電相互作用力的減少，然后被疏水相互作用所取代。事實(shí)上，這和我們的發(fā)酵液ABFII 在酸性條件下對擬盤多毛孢和瓜鏈格孢菌具有抗菌活性，在堿性條件下，ABFII 的抗菌活性喪失的結(jié)論一致。從ABFII 的抗菌混合物對溫度和pH 敏感實(shí)驗(yàn)中可以預(yù)測其活性物質(zhì)是肽，對此需要更加深入的研究。

2.3 發(fā)酵液的化學(xué)組成

表4 顯示發(fā)酵液樣品A、ABFI 和ABFII 的化學(xué)成分。結(jié)果表明，ABFII 和樣品A 的化學(xué)成分相近。ABFI 中部分化學(xué)成分含量比ABFII 和樣品A 要少的多。

表4 不同發(fā)酵液的化學(xué)成分Tab.4 Chemical composition of the different fermented liquid

從發(fā)酵液化學(xué)組成實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出利用發(fā)酵菌株發(fā)酵的水產(chǎn)加工副產(chǎn)物的蛋白質(zhì)，游離氨基酸，脂肪和氮磷鉀含量已和市售有機(jī)液肥含量接近，礦物元素鎂鐵的含量甚至超過市售肥料，鈣硫硼錳銅鉬的含量接近市售肥料。不僅提高了水產(chǎn)加工副產(chǎn)物的利用率，減少環(huán)境污染，甚至還可以替代市售肥料，提高經(jīng)濟(jì)效益。EM 菌發(fā)酵的水產(chǎn)加工副產(chǎn)物的脂肪，碳水化合物和氮磷鉀含量和樣品A 的含量接近，其余成分的含量相差較大。樣品A 和ABFII 的化學(xué)成分接近，活性相差巨大，可能是由于ABFII 所用篩選的菌株能夠產(chǎn)具有活性的功能物質(zhì)，和發(fā)酵液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果預(yù)測相同。

2.4 盆栽試驗(yàn)結(jié)果

圖3 是分別用自來水空白組和ABFII 實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)的甘藍(lán)型油菜。從圖3 可以看出，ABFII 培養(yǎng)的油菜葉片比空白組培養(yǎng)的明顯肥大。從圖4 可以看出，與空白組相比，以ABFII 作為肥料的油菜最大葉片的長度比空白組長1 cm，直徑大2 cm；最小葉片的長度和直徑都比空白組葉片大0.5 cm，說明ABFII 能夠促進(jìn)植物生長，具有一定的肥力。這和KIM[6]證明魚的廢棄物用作液體肥料有非常大的潛力的結(jié)果一致。從圖5 可以看出，和用自來水處理的甘藍(lán)型油菜相比，用多菌靈處理的油菜葉片中殘留的擬盤多毛孢數(shù)量很少，抑制率達(dá)到99%，用ABFII 處理后，抑制率達(dá)到95%。

圖3 ABFII 對植物生長的促進(jìn)作用Fig.3 In vitro plant growth promotion effects of ABFII

圖4 ABFII 處理1 周后，A.蔬菜最大葉片的長度和直徑；B.蔬菜最小葉片的長度和直徑Fig.4 After one week treatment with ABFII,A.The lengths and diameters of vegetable the biggest leaves;B.The lengths and diameters of vegetable the smallest leaves

圖5 殘留真菌的微生物檢驗(yàn)Fig.5 Microbiological test of the fungi remaining

盆栽實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)過ABFII 處理的蔬菜葉片較空白組有明顯的促生長作用，在葉片長度和直徑方面都有明顯效果。ABFII 不僅提供了大量有利于土壤中微生物分解的小分子物質(zhì)，還保留原料中植物生長所必需元素，包括必需大量氮磷鉀元素和鎂鈣硼錳等必需微量元素，促進(jìn)植物的生長[30]。同時各組葉片的真菌培養(yǎng)表現(xiàn)出ABFII 中生物活性物質(zhì)可以有效抑制油菜上擬盤多毛孢的增值，接近商業(yè)殺蟲劑的抑制率。這為開發(fā)天然農(nóng)藥提供理論基礎(chǔ)，為園藝發(fā)展帶來巨大的進(jìn)步。

3 結(jié)論

在3 種水產(chǎn)副產(chǎn)物的發(fā)酵液中，只有ABFII 對擬盤多毛孢和瓜鏈格孢菌顯示出抗菌活性。蔬菜盆栽試驗(yàn)也表明，ABFII 不僅具有一定的肥力，促進(jìn)植物的生長，還可被用于開發(fā)成為一種天然生物農(nóng)藥，在園藝中作為化學(xué)農(nóng)藥的替代品。