14 種簾蛤科貝類線粒體基因組特征與系統(tǒng)進化分析

顏成瑞，苗 菁，葉瑩瑩

(國家海洋設施養(yǎng)殖工程技術研究中心，浙江舟山 316022)

簾蛤科Veneridae 隸屬于軟體動物門，雙殼綱，簾蛤目，在世界分布面較廣，且數量大，經濟種類多，目前已知有500 多種，我國常見的有60 余種，常見物種如文蛤Meretrix meretrix (Linnaeus,1758)，菲律賓蛤仔Ruditapes philipinarum，等邊淺蛤Macridiscus Multifarius 等作為我國貝類養(yǎng)殖業(yè)的主要成員，具有較高的經濟價值[1-2]。然而關于簾蛤科貝類系統(tǒng)進化的研究最初基于形態(tài)以及古生物學證據，隨著現代分子技術的逐漸發(fā)展，學界認為簾蛤科貝類的形態(tài)趨同進化對系統(tǒng)關系的研究存在嚴重誤導，現行的簾蛤科貝類的分類系統(tǒng)無法代表真實有效的進化關系。對于簾蛤科貝類在生活習性，形態(tài)上相似等問題，近年來眾多學者通過分子生物學手段，如DNA 分子標記等方法來對簾蛤科貝類進行遺傳多樣性，系統(tǒng)發(fā)育及生物資源保護等方面的研究[3]。如程漢良等[4]以16S rRNA 序列進行分析，對中國沿海21 種簾蛤科貝類進行研究，闡明了簾蛤科分類和系統(tǒng)演化的一系列問題，為簾蛤科分類提供證據；陳軍[5]選取135 種雙殼貝類，其中簾蛤科種類128 種，簾蛤超科5 種，其他雙殼貝類外群2 種，通過2 個線粒體基因序列COI，16S rRNA 和一個核蛋白編碼基因H3 進行分析，對簾蛤科內中國沿海某些類群進行了修訂；田云方[6]通過COI 和Cytb 序列，對我國沿海簾蛤科中的斧文蛤，文蛤，等邊淺蛤群體進行分析，表明了不同海域簾蛤科群體的遺傳差異較大；陳道海等[7]利用COI 序列對沿海10 屬10 種簾蛤科貝類進行分析，證明了COI 序列適用于簾蛤科貝類種群的分子系統(tǒng)發(fā)生學研究。而線粒體基因伴隨著核基因組DNA 共同進化，同時也記錄了豐富的歷史信息。通過對線粒體基因組DNA 的分析比較，可以了解到線粒體DNA 不同基因在進化過程受到選擇壓力的大小。因此線粒體DNA 是研究物種遺傳多樣性與進化的有力工具之一[8]。

鑒于目前尚未有基于線粒體全基因組分析簾蛤科系統(tǒng)發(fā)育的研究，本研究運用線粒體基因組全序列對簾蛤科貝類進行分析，選取NCBI 上所能下載到的簾蛤科5 屬14 種貝類，對其線粒體基因組基本特征，蛋白質編碼基因，基因排序，選擇壓力進行分析，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹，以期為簾蛤科貝類親緣關系，系統(tǒng)發(fā)育，種質資源等研究提供遺傳信息。

1 材料和方法

1.1 數據獲取

從Genbank 數據庫查詢下載14 種簾蛤科貝類線粒體DNA 全序列，這14 個物種分別是文蛤屬Meretrix 的文蛤M.meretrix、斧文蛤M.lamarckii、麗文蛤M.lusoria、皺肋文蛤M.lyrata、中華文蛤M.petechialis；鏡蛤屬Dosinia 的高鏡蛤Dosinia altior、日本鏡蛤D.japonila、射帶鏡蛤D.troschheli；巴非蛤屬Paphia 的和藹巴非蛤Paphia amabilis、真曲巴非蛤P.euglypta、織錦巴非蛤P.textile、波紋巴非蛤P.undulata；石房蛤屬Saxidomus 的紫石房蛤Saxidomu spurpuratus，淺蛤屬Macridiscus 的等邊淺蛤Macridiscus multifarius。

1.2 數據處理

采用BioEdit 軟件對全部序列進行比對編輯，得到14 個物種線粒體基因組全長，并通過DAMBE 軟件統(tǒng)計序列堿基組成含量及比例；同時列出14 個物種13 個蛋白質編碼基因的起始密碼子，終止密碼子和氨基酸數量。同時將14 個物種的蛋白質編碼基因以COI 為首進行排列來研究基因重排；利用MEGA 6[9]軟件基于12 個蛋白質編碼基因串聯后的序列計算不同物種之間的遺傳距離；通過Ka/Ks-calculator 2.0 來計算12 個蛋白質編碼基因的同義替換率和非同義替換率；并基于MEGA 6 中的J.C 參數模型(Jukes-cantor Model)構建鄰接系統(tǒng)進化樹，1 000 次重抽樣檢驗系統(tǒng)樹中節(jié)點的自引導值。

2 結果

2.1 線粒體DNA 序列特征及分析

14 種簾蛤科貝類線粒體DNA 全長在17 229 bp～21 625 bp 之間，其中射帶鏡蛤線粒體基因組長度最短，皺肋文蛤線粒體基因組最長。計算14 種簾蛤科貝類線粒體全基因組A，G，T，C 堿基含量，如表1 所示。A，G，T，C 堿基平均含量依次對應分別為26.58%，23.01%，40.67%，10.09%，14 種簾蛤科貝類均表現出C堿基含量最低，T 堿基含量最高，A 堿基較高于G 堿基含量的分布特征。所有序列A+T 堿基含量略高于G+C 堿基含量，表現出明顯的AT 偏向[10-11]。

表1 14 種簾蛤科貝類線粒體基因組特征Tab.1 Basic characteristics of 14 species mitochondrial genomes of Veneridae

2.2 蛋白質編碼基因特征分析

14 種簾蛤科貝類的12 個蛋白質編碼基因中，有1 個ATP 合成酶亞基ATPase6，3 個細胞色素氧化酶的亞基COI，COII，COIII，Cytb，7 個NADH 脫氫酶亞基ND1-6 和ND4L(14 個物種中文蛤，中華文蛤，真曲巴非蛤，紫石房蛤，無ATP8 基因。采用DAMBE 軟件分析其密碼子組成情況（表2）。13 種基因編碼氨基酸的數量在不同簾蛤科貝類中存在差異。其中同屬的簾蛤科貝類大部分氨基酸數量相同或者具有微小差異，不同屬的物種之間存在的氨基酸數量差異較大，ATG 并不是唯一的起始密碼子[12]。文蛤線粒體基因組的COI、中華文蛤的COI、高鏡蛤ND4L 和Cytb、射帶鏡蛤的COI 和COII，都是以TTG 作為起始密碼子的；而斧文蛤的ND4L，ND5，Cytb、皺肋文蛤的ND1，ND2，ND4，ATP6，Cytb、中華文蛤的ND5，ND6，Cytb、高鏡蛤的ND1，ND4、日本鏡蛤的ND4L，ND5、射帶鏡蛤的ND1，ND4L，ND4，ND5、真曲巴非蛤的ND5，ND6、織錦巴非蛤的COI，Cytb、等邊淺蛤的ND1，ND4，ND5，都是以ATA 作為起始密碼子的；皺肋文蛤的ND3，COII，COIII、斧文蛤的ND6、鏡蛤亞科的ND2，ND3、日本鏡蛤的COI，COII、高鏡蛤的ATP8、巴非蛤亞科的ND1，ND4L、真曲巴非蛤的ND3、COIII、波紋巴非蛤的ND5、和藹巴非蛤的COIII 和Cytb，都是以GTG 作為起始密碼子的；皺肋文蛤的ND5、高鏡蛤的ND6，COI，COII、日本鏡蛤的Cytb、射帶鏡蛤的Cytb、真曲巴非蛤的ND4、織錦巴非蛤和波紋巴非蛤的ND4，ND6，COII，COIII、和藹巴非蛤的ND6、等邊淺蛤的ND2，ND6，COI，都是以ATT 作為起始密碼子的。而真曲巴非蛤的Cytb 是以GTT 作為起始密碼子的。終止密碼子有TAA 和TAG 兩種。

表2 蛋白質編碼基因的氨基酸數量和起始終止密碼子Tab.2 The number of amino acids and the initation and termination codon of the protein-coding gene

2.3 基因重排

比較簾蛤科的14 個物種線粒體基因的排列，發(fā)現其中存在差異，表明了簾蛤科這14 個物種在進化過程中經歷了一定規(guī)模的基因重排。由表3 可以看出，14 個物種在基因排列上共享5′-ND1-ND2-ND4LCOII-3′基因框。文蛤屬內中華文蛤和文蛤，石房蛤屬的紫石房蛤，巴非蛤屬的真曲巴非蛤，與典型的后生動物線粒體基因組來說，缺失ATP8 基因。文蛤屬，鏡蛤屬物種的基因排列順序基本相同，和石房蛤屬的紫石房蛤相比有較小差異，而與巴非蛤屬相比的基因排列順序差異較大。此外，值得注意的是淺蛤屬的等邊淺蛤的基因排列順序與其他簾蛤科物種大不相同。由此也可以看出屬與屬之間親緣關系的遠近，且結論與系統(tǒng)發(fā)育樹所展現的一致。

表3 14 種簾蛤科貝類線粒體基因組的基因重排Tab.3 Gene rearrangement of mitochondrial genomes of 14 Veneridae species

2.4 遺傳距離

基于線粒體基因組全序列運用MEGA 6 軟件算出14 種簾蛤科貝類之間的遺傳距離。結果見表4。物種間的遺傳距離在0.006～0.615 之間。最大的遺傳距離存在于紫石房蛤與和藹巴非蛤之間，為0.615；最小的遺傳距離存在于中華文蛤和文蛤之間，為0.006，說明2 個物種親緣關系較近。此外可以看出相同屬之間的遺傳距離較小，不同屬之間的遺傳距離較大，等邊淺蛤與巴非蛤屬親緣關系較近，紫石房蛤與文蛤屬物種較近，與后面系統(tǒng)發(fā)育樹結果一致。

表4 基于線粒體基因組12 個蛋白質編碼基因的簾蛤科貝類遺傳距離Tab.4 Genetic distance of the 12 protein-coding genes based on mitochondrial genome

2.5 選擇壓力分析

本研究中選取巴非蛤屬的和藹巴非蛤，真曲巴非蛤，織錦巴非蛤，波紋巴非蛤為代表來研究簾蛤科貝類線粒體基因組選擇壓力。估算各物種線粒體基因中12 個蛋白質編碼基因的同義替換率和非同義替換率以及其比值，構建柱狀圖。結果如圖1 所示，12 種蛋白質編碼基因Ka/Ks 均小于1，表明基因受到程度不等負選擇（純化選擇）作用。在受到純化選擇壓力的所有12 個基因中，ND6 的Ka/Ks 值最大，ND5 基因的Ka/Ks 值最小，其余基因的Ka/Ks 值都在0和1 之間。

圖1 4 種簾蛤科貝類蛋白質編碼基因Ka/Ks 值的比較Fig.1 Comparison of Ka/Ks ratios in the mitochondrial protein genes of 4 Veneridae shellfishs

2.6 系統(tǒng)發(fā)育關系

基于14 個簾蛤科貝類的線粒體全長，用貽貝科的3 個物種作為外群，采用NJ 法構建了簾蛤科貝類的系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖2，可見其拓撲結構。簾蛤科貝類分為4 個類群。第一個類群，文蛤亞科的5 個物種與石房蛤屬的紫石房蛤聚為一枝，而文蛤亞科的中華文蛤和文蛤首先聚為一枝，再與麗文蛤聚為一枝，再與斧文蛤聚為一枝，最后與皺肋文蛤聚為一枝，第二類群由鏡蛤屬的3 個物種聚為一枝，日本鏡蛤和射帶鏡蛤先聚成一枝，再與高鏡蛤聚為一枝，第三類群由淺蛤屬的等邊淺蛤自成一枝，與組成第四類群的巴非蛤屬的4 個物種聚成一枝，而巴非蛤屬內的和藹巴非蛤，真曲巴非蛤和織錦巴非蛤，波紋巴非蛤，兩兩聚在一起。

圖2 基于12 個蛋白質編碼基因構建的NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The Neighbor-joining phylogenetic tree based on 12 protein-coding genes

3 討論

研究發(fā)現簾蛤科14 種貝類線粒體基因組A+T 含量高于G+C，分析可能是因為12 個蛋白質編碼基因，其中除了ND6 由L 鏈編碼，其他11 個基因編碼基因，都由H 鏈編碼。而在線粒體基因組在復制過程中，H 鏈先開始復制，伴隨DNA 鏈復制過程的半不連續(xù)所導致的不對稱性，L 鏈在H 鏈復制了2/3 后才開始復制，在處于單鏈狀態(tài)的L 鏈容易發(fā)生堿基突變，從而導致A+T 含量高于G+C 的情況出現[13]。此外在氨基酸密碼子組成和數目上看出親緣關系較近的（同一屬內）差異較小，而親緣關系較遠的差異較大。

關于線粒體基因排序，線粒體基因排列作為目前揭示物種之間系統(tǒng)發(fā)育關系的有力參考之一，被廣泛運用，并且有多種模型被提出來解釋線粒體基因的重排[14]。BOORE,et al[15]研究稱后生動物線粒體基因由于其基因容量的保守性，所以線粒體基因的排列順序成為研究后生動物系統(tǒng)發(fā)育重要手段之一。軟體動物門種類與其他后生動物相比，基因序列容易多變。本研究中簾蛤科14 個物種線粒體基因序列不盡相同，且有基因缺失，即ATP8。ATP8 基因作為ATP 合酶的1 個亞基，參與ATP 合成和細胞的能量產生。文蛤、中華文蛤、紫石房蛤和真曲巴非蛤缺失ATP8，推測原因可能是由于這4 種貝類生活環(huán)境水溫較低，代謝水平較低，從而在進化過程中導致ATP8 的缺失。此外值得關注的是等邊淺蛤基因序列，與其余簾蛤科貝類相比，大為不同?？梢钥吹皆诘冗厹\蛤mtDNA 中，發(fā)生了滑移重排現象，其中包含Cytb-ATP6-ND3-ND5，ND6-COIII，ND1-ND2-ND4L-COII，ATP8-ND4 這4 個基因框，研究也發(fā)現，這種滑移或移位重排可能是由于線粒體基因重組造成的[16]。因此，關于是否由等邊淺蛤生活環(huán)境造成的基因重排和這種基因重排構建的意義和用途，是仍需要我們探索的。

關于基因同義替換率與非同義替換率的比值，基因突變中通常有3 種分子進化策略導致生物進化。即正選擇，中性選擇和負選擇（純化作用），而基因突變分為同義突變和非同義突變，因此，當前，主要通過同義替換率和非同義替換率的比值來反映出相對的分子進化率[17-18]。當前主要認為若Ka/Ks＞1,則基因受到正選擇作用；若Ka/Ks=1，則認為基因受到中性選擇作用。若Ka/Ks＜1，則認為基因受到負選擇作用。本研究中12 種蛋白質編碼基因Ka/Ks 值不同且均小于1，表明基因受到程度不等的純化選擇作用。在受到純化選擇壓力的所有12 個基因中，ND6 的Ka/Ks 值最大，表明其受到的選擇壓力最小，而Cytb 基因Ka/Ks 值最小，表明在進化過程中這2 個基因所受的選擇壓力較大。

而基于線粒體基因組建立的NJ 樹和14 個物種基于12 個蛋白質編碼基因估算出的遺傳距離，得到的結論與莊啟謙先生的《中國動物志.軟體動物門：雙殼綱，簾蛤科》中簾蛤科貝類形態(tài)分類結果基本一致。因此研究表明線粒體基因組作為簾蛤科貝類系統(tǒng)進化的研究手段具有一定可靠性。