碳角屬真菌Xylaria sp.NH1801中除草活性化合物研究

劉 芳，王月瑩，張志剛，吳兆圓，張亞妮，方 偉

（湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢430064）

微生物是自然界的天然產(chǎn)物寶庫(kù)，其代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)種類(lèi)十分豐富，在已商業(yè)化的除草劑產(chǎn)品中，有很多母體結(jié)構(gòu)來(lái)自微生物代謝產(chǎn)物。細(xì)胞松弛素是由聚酮合成酶和氨基酸合成酶共同作用形成的大環(huán)含氮雜環(huán)類(lèi)的化合物，這類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)多樣，現(xiàn)已經(jīng)分離得到數(shù)百個(gè)類(lèi)似化合物，具有多種藥理活性，如抗炎、抗腫瘤、抗病毒和抗菌等［1］。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞松弛素類(lèi)化合物具有植物毒性，可以抑制植物生長(zhǎng)。球毛殼菌素類(lèi)化合物如球毛殼菌素A、C、V、E、F、Fex、K和O等化合物具有抑制小麥胚芽生長(zhǎng)［2］，抑制苜蓿種子發(fā)芽［3］，抑制水芹菜種子［4］和蘿卜種子萌發(fā)［5］作用。另一類(lèi)細(xì)胞松弛素類(lèi)化合物細(xì)胞松弛素E對(duì)蘿卜種子根生長(zhǎng)抑制活性IC50達(dá)1.57 μmol/L，細(xì)胞松弛素Z16對(duì)小麥種子根生長(zhǎng)抑制活性IC50達(dá)17.35 μmol/L，而對(duì)蘿卜種子沒(méi)有影響［6］。在篩選具有除草活性資源時(shí)，得到1株碳角菌屬真菌Xylariasp.NH1801，其發(fā)酵提取物具有顯著抑制植物種子萌發(fā)的作用，對(duì)其進(jìn)行活性成分跟蹤分離，得到1個(gè)細(xì)胞松弛素及其水解產(chǎn)物，并對(duì)2個(gè)化合物抑制稗草［Echinochloa crusgalli（L.）Beauv］和反枝莧（Amaranthus retroflexusL.）種子萌發(fā)作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑Bruker AVANCE（500 MHz）核磁共振儀（TMS為內(nèi)標(biāo)，δ為mol/mL）（德國(guó)Bruker?BioSpin公司）；Waters 2695液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Waters公司）；100~200目柱色譜填料柱層析硅膠（青島海洋化工廠）?；衔?，4-D（阿拉丁試劑有限公司）。試劑石油醚、乙酸乙酯、吐溫-80、葡萄糖均為國(guó)藥集團(tuán)生產(chǎn)。培養(yǎng)所用馬鈴薯和大米均采購(gòu)于市場(chǎng)。

1.1.2 試驗(yàn)材料發(fā)酵菌種從湖北省武漢市郊區(qū)土壤中分離純化獲得，通過(guò)形態(tài)鑒定和ITS序列比對(duì)，該菌種鑒定為Xylariasp.，命名為Xylariasp.NH1801，該菌株已于2020年11月13日送至中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保存，保藏編號(hào)為CCTCC NO：M2020734。稗草和反枝莧種子均采購(gòu)于市場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，自然pH；大米培養(yǎng)基：大米80 g，水100 mL，放入500 mL培養(yǎng)瓶中，121℃滅菌后備用。

1.2.2 種子液的制備將斜面菌種Xylariasp.NH1801接種于茄形瓶中（PDA培養(yǎng)基），28℃恒溫培養(yǎng)7 d，用含0.1%吐溫-80的無(wú)菌水將孢子洗下，配制成濃度為1.0×107個(gè)孢子/mL的菌懸液，備用。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)按3%的接種量將菌懸液接入到大米培養(yǎng)基中（共接種5瓶培養(yǎng)基，大米用量400 g），28℃、靜置培養(yǎng)8 d。

1.2.4 提取分離在發(fā)酵瓶中加入等體積的乙酸乙酯，振蕩提取1 h，取上清液?；厥找宜嵋阴ト軇┑玫揭宜嵋阴ヌ崛∥铩＜尤肷倭考状既芙庖宜嵋阴ヌ崛∥?，上硅膠柱（100~200目，青島海洋化工）。依次用石油醚∶乙酸乙酯（5∶1，3∶1，2∶1，1∶1）洗脫，收集石油醚∶乙酸乙酯2∶1洗脫部分，合并，回收溶劑，用甲醇溶解后，結(jié)晶，得到化合物1（200 mg）。

1.2.5 化合物1的水解將化合物1（50 mg）溶解于K2CO3溶液中，室溫?cái)嚢? h，用等體積乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯，水洗至中性，回收乙酸乙酯，重結(jié)晶，得到化合物2（40 mg）。

1.2.6 種子萌發(fā)抑制試驗(yàn)分別稱(chēng)取化合物1、化合物2和除草劑2，4-D，用甲醇溶解成1 mg/mL。然后依次用甲醇化合物稀釋成200.0、100.0、50.0、25.0、12.5 μg/mL。將各個(gè)濃度的試藥加入12孔板中，每孔200 μL，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照加入相同劑量的純甲醇，揮干甲醇備用。將種子用流水沖洗4 h后，用高錳酸鉀溶液消毒15 min，無(wú)菌水沖洗干凈，晾干，每孔加入4粒種子，然后加入無(wú)菌水200 μL，28℃恒溫培養(yǎng)箱中放置48 h后觀察結(jié)果。用游標(biāo)卡尺測(cè)量每粒種子發(fā)芽后的莖與根的長(zhǎng)度，按以下公式計(jì)算藥物對(duì)種子萌發(fā)的抑制率。

抑制率=（空白長(zhǎng)度-樣品長(zhǎng)度）×100%/空白長(zhǎng)度

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色結(jié)晶，ESI（M+）：524；13C NMR（100 MHz，MeOD）δ 216.71，176.72，171.92，138.18，132.99，132.29，131.04，129.66，127.92，77.91，73.96，64.07，60.99，58.83，56.49，55.98，54.33，51.16，46.00，45.75，42.76，38.85，37.75，22.18，20.38，19.56，19.46，12.36。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［7］數(shù)據(jù)鑒定化合物為19，20-環(huán)氧-細(xì)胞松弛素Q（19，20-epoxy-cytochalasin Q）（圖1）。

化合物2：白色結(jié)晶，ESI（M+）：482；13C NMR（100 MHz，MeOD）δ 216.95，178.49，138.21，132.55，132.43，131.14，129.67，128.05，78.11，73.18，64.65，60.97，59.23，57.38，56.21，55.65，52.29，45.53，44.75，42.98，38.84，37.95，22.35，19.79，19.45，12.62。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)［7］鑒定化合物為21-去乙?；?19，20-環(huán)氧-細(xì)胞松弛素Q（21-deacetyl-19，20-epoxycytochalasin Q）（圖1）。

圖1 化合物1和化合物2的結(jié)構(gòu)式

2.2 化合物抑制稗草種子萌發(fā)效果

化合物抑制稗草種子萌發(fā)的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，化合物1和化合物2均具有顯著抑制稗草種子萌發(fā)的活性，在最高濃度為200 μg/mL時(shí)，根長(zhǎng)抑制率分別為83.3%和80.7%，莖長(zhǎng)抑制率分別為80.4%和79.4%，對(duì)莖長(zhǎng)抑制率與陽(yáng)性對(duì)照除草劑2，4-D（78.8%）相當(dāng)?；衔?和化合物2對(duì)稗草種子根的生長(zhǎng)抑制作用強(qiáng)于對(duì)莖的生長(zhǎng)抑制，在低濃度50 μg/mL時(shí)，化合物1和化合物2對(duì)根長(zhǎng)抑制率分別為65.7%和60.7%，強(qiáng)于對(duì)莖長(zhǎng)的抑制（分別為37.5%和34.5%），但是化合物1和化合物2對(duì)稗草根長(zhǎng)的抑制均弱于除草劑2，4-D。

表1 化合物對(duì)稗草種子萌發(fā)的抑制率 （單位：%）

2.3 化合物抑制反枝莧種子萌發(fā)效果

化合物抑制反枝莧種子萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。化合物1和化合物2均具有明顯抑制反枝莧種子萌發(fā)的活性，在200 μg/mL濃度時(shí)，化合物1和化合物2可以完全抑制種子萌發(fā)，抑制率達(dá)100%，強(qiáng)于對(duì)照藥物除草劑2，4-D（抑制率87.1%）。在低濃度50 μg/mL時(shí)，化合物1和化合物2也具有顯著的抑制活性，對(duì)種子萌發(fā)的抑制率分別為77.2%和75.4%，與對(duì)照藥物活性相當(dāng)（抑制率為79.8%）。但是在更低濃度時(shí)，化合物1和化合物2的活性弱于陽(yáng)性對(duì)照藥物2，4-D。

表2 化合物對(duì)反枝莧種子萌發(fā)的抑制率（單位：%）

3 討論

隨著除草劑的大量長(zhǎng)期應(yīng)用，不僅給環(huán)境帶來(lái)巨大的壓力，同時(shí)由于雜草的不斷生存進(jìn)化，抗性雜草種類(lèi)不斷增多，抗性不斷增強(qiáng)，不斷研發(fā)新型除草劑顯得仍然十分迫切。細(xì)胞松弛素是由微生物代謝產(chǎn)生的一類(lèi)雜環(huán)化合物，其結(jié)構(gòu)變化多樣，這也導(dǎo)致其活性的不同。球毛殼菌素類(lèi)顯示對(duì)蘿卜種子萌發(fā)具有抑制作用，化合物結(jié)構(gòu)中17位和21位對(duì)其活性較為關(guān)鍵［5］，化合物1和化合物2活性結(jié)果表明這一類(lèi)化合物21位的乙?；瘜?duì)活性沒(méi)有顯著影響。球毛殼菌素類(lèi)化合物均沒(méi)有顯示劑量依賴作用，這一點(diǎn)與本試驗(yàn)中2，4-D針對(duì)反枝莧效果類(lèi)似［5］。另一類(lèi)細(xì)胞松弛素類(lèi)化合物細(xì)胞松弛素K和細(xì)胞松弛素E可以顯著抑制蘿卜種子萌發(fā)，并對(duì)根生長(zhǎng)的抑制作用要強(qiáng)于莖，這與本研究中化合物對(duì)稗草的作用類(lèi)似；在較低濃度時(shí)，細(xì)胞松弛素Z16和細(xì)胞松弛素K對(duì)蘿卜種子有較弱的促進(jìn)生長(zhǎng)作用［6］。細(xì)胞松弛素類(lèi)化合物具有廣泛的除草活性，且結(jié)構(gòu)與活性可變性較強(qiáng)，有望成為除草劑的先導(dǎo)化合物或者微生物類(lèi)的生物除草劑。