菜薹尾菜原位還田對(duì)下季土壤微生物功能多樣性的影響

徐大兵，謝媛圓，佀國(guó)涵，袁家富，趙書軍

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部廢棄物肥料化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所，武漢430064）

近年來(lái)，中國(guó)蔬菜種植面積和產(chǎn)量逐年增加，2016年播種面積達(dá)2 232.8萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量7.98億t，其中湖北省總產(chǎn)量達(dá)4 002萬(wàn)t，占全國(guó)蔬菜總產(chǎn)量的5.04%［1］。隨著蔬菜產(chǎn)量的增加，尾菜處理問(wèn)題逐漸凸顯出來(lái)。2016年中國(guó)尾菜量近2.92億t［2］，其中湖北省尾菜量146萬(wàn)t，可資源化利用尾菜117萬(wàn)t，氮磷鉀養(yǎng)分儲(chǔ)量為氮（N）5.20萬(wàn)t、磷（P2O5）2.91萬(wàn)t、鉀（K2O）4.46萬(wàn)t，數(shù)量巨大，因此，如何合理利用尾菜資源是目前湖北省乃至全國(guó)亟待解決的問(wèn)題［3，4］。

與堆肥或簡(jiǎn)易堆漚或沼氣等方式處理尾菜相比，原位還田成本較低［5，6］。蔬菜尾菜具有較低C/N值（平均11.04）和較高的含氮量（平均3.45%），易被微生物分解和礦化［2］。胡國(guó)平等［7］研究發(fā)現(xiàn)尾菜還田可以降低土壤硝態(tài)氮的淋失。相比尾菜堆肥化過(guò)程的研究，原位還田后對(duì)土壤環(huán)境的影響研究相對(duì)較少［8］。因此，在尾菜量逐年劇增的大背景下，人們對(duì)原位還田技術(shù)也會(huì)越來(lái)越關(guān)注，特別是對(duì)下季作物生長(zhǎng)和土壤環(huán)境的影響，需要相關(guān)領(lǐng)域的學(xué)者進(jìn)行深入長(zhǎng)期的觀察研究。因此，本研究以紅菜薹尾菜為原料，研究紅菜薹尾菜原位還田后對(duì)下季四季豆種植土壤活性碳氮和微生物碳源利用能力的影響，以期為紅菜薹尾菜原位還田對(duì)土壤環(huán)境的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)地位于湖北省武漢市蔡甸區(qū)永安鎮(zhèn)高新村（東經(jīng)113°57′16.96″，北緯30°25′23.66″），是以壟崗為主體的丘陵性湖沼平原，屬北亞熱帶季風(fēng)性氣候，年平均氣溫為17.1℃，年降水量為1 302.4 mm，日照為1 639.3 h。

1.2 材料

1.2.1 供試土壤供試土壤類型為潮土，0~20 cm土層基本理化性質(zhì)：pH 6.70，有機(jī)質(zhì)27.6 g/kg，堿解氮134.5 mg/kg，速效磷34.6 mg/kg，速效鉀167.5 mg/kg。

1.2.2 供試作物供試作物為四季豆，品種為架豆。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018年4—6月進(jìn)行，設(shè)置3個(gè)處理，處理1，不還田，常規(guī)施肥，75 kg復(fù)合肥（15-15-15），計(jì)作CK；處理2，菜薹全部還田，計(jì)作FS；處理3，菜薹全部還田+在常規(guī)施肥的基礎(chǔ)上化肥減施30%，計(jì)作FS-30N。各處理具體施肥量見表1，尾菜和70%復(fù)合肥作基肥，30%復(fù)合肥于開花結(jié)果時(shí)穴施追肥。洪山菜薹新鮮資源量50 250 kg/hm2，含水量89.53%，干物質(zhì)量5 261 kg/hm2，氮、磷、鉀養(yǎng)分含量分別為2.81%、0.42%和4.37%。

表1 不同處理施肥量 （單位：kg/hm2）

每個(gè)處理重復(fù)3次，隨機(jī)區(qū)組排列。小區(qū)面積為4 m×10 m=40 m2。菜薹收獲后，采取旋耕的方式還田。在還田旋耕前施750 kg/hm2生石灰消毒殺菌。

1.4 樣品采集與測(cè)定

尾菜還田后分別于10、20、30、45、60 d采集0~20 cm土層新鮮土壤樣品，一部分用于Biology和硝態(tài)氮分析；一部分風(fēng)干后用于活性有機(jī)碳分析。

1.4.1 硝態(tài)氮測(cè)定250 mL三角瓶中加入10.0 g新鮮土壤，加入50 mL 2 mol/L氯化鉀溶液，25℃振蕩30 min，定量濾紙過(guò)濾后濾液備用，取2 mL濾液去離子水定容至50 mL，625 nm和220 nm或275nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定，計(jì)算硝態(tài)氮含量。

1.4.2 土壤活性有機(jī)碳測(cè)定采用重鉻酸鉀外加熱法，稱取風(fēng)干土0.10 g左右，加入10 mL 0.2 mol/L（1/6 K2Cr2O7-1/3 H2SO4，水∶酸=3∶1）混合液，130~140℃烘箱內(nèi)共煮5 min，用標(biāo)準(zhǔn)0.05 mol/L FeSO4滴至磚紅色。

1.4.3 Biology測(cè)定無(wú)菌操作稱取10 g新鮮土置于100 mL滅菌生理鹽水中，150 r/min振蕩機(jī)振蕩15 min。吸取1 mL稀釋液加入9 mL無(wú)菌緩沖液的試管中，配制成10-2的稀釋液，同此法配制成10-3的稀釋液。將10-3的稀釋液倒入滅菌的V型槽中，用8通道加樣器向BIOLOG孔板各孔中分別添加150 μL稀釋后的懸液。每個(gè)土壤樣品3次重復(fù)。25℃恒溫培養(yǎng)，在24、48、72、96、120、144、168 h后使用BIOLOG EMAX讀板儀讀取各孔在590 nm處的吸光度［9］。

1.5 數(shù)據(jù)分析

本研究采用平均顏色變化率（Average well color development，AWCD）在144 h的 數(shù) 據(jù) 計(jì) 算Biolog-ECO生態(tài)板中土壤微生物的群落代謝類型，用31個(gè)孔的AWCD表示微生物代謝的整體活性，土壤微生物群落多樣性指數(shù)包括物種豐富度指數(shù)（H）、均勻度指數(shù)（E）、碳源利用豐富度指數(shù)（S）、Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（D）。計(jì)算公式如下。

S=被利用碳源的總數(shù)

式中，C為每個(gè)孔的吸光值，R為對(duì)照孔的吸光值，n為孔數(shù)，ECO生態(tài)板n為31；Pi為第i孔的相對(duì)吸光值與所有反應(yīng)孔相對(duì)吸光值總和的比值，即Pi=（C-R）/∑（C-R）［10，11］。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007軟件進(jìn)行初步處理，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（Duncan）和相關(guān)性分析（Pearson），采用Origin 2019軟件進(jìn)行主成分分析、熱圖聚類分析，并繪制相關(guān)圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜薹尾菜原位還田對(duì)土壤速效碳、氮含量的影響

從圖1可以看出，不同處理間硝態(tài)氮含量差異均不顯著（P＞0.05）。隨著生育期的推進(jìn)，CK處理硝態(tài)氮含量逐漸下降，60 d后下降了11.91%，而FS和FS-30N處理分別下降了14.02%和12.06%，且這2個(gè)處理土壤硝態(tài)氮含量的下降主要集中在45~60 d。菜薹尾菜原位還田經(jīng)過(guò)60 d后，不同處理土壤硝態(tài)氮含量差異較小，主要集中在27.27~29.17 mg/kg。

圖1 不同處理土壤硝態(tài)氮含量

由圖2可知，與CK相比，F(xiàn)S-30N處理活性有機(jī)碳的含量下降了3.37%~10.37%，就FS處理而言，除了45 d略有增加外，其他時(shí)間則降低了4.06%~35.57%。隨著生育期的推進(jìn)，土壤活性有機(jī)碳的含量相對(duì)趨于穩(wěn)定，變化幅度較小。

圖2 不同處理土壤活性有機(jī)碳含量

2.2 菜薹尾菜原位還田對(duì)土壤微生物功能多樣性的影響

從表2可以看出，不同處理碳源利用能力多樣性指數(shù)在前30 d均沒(méi)有顯著差異。在45 d，CK的均一度指數(shù)顯著高于FS-30N，但FS與兩者差異都不顯著，且至60 d時(shí)，不同處理間的均一度指數(shù)又沒(méi)有顯著差異。就優(yōu)勢(shì)度指數(shù)和香濃多樣性指數(shù)而言，只有在45 d和60 d，CK均顯著高于FS和FS-30N，且45 d FS與FS-30N香濃多樣性指數(shù)差異也達(dá)到了顯著水平。與CK相比，還田后30 d FS-30N碳源利用豐度指數(shù)顯著降低2.61，然而到了45 d，F(xiàn)S和FS-30N處理碳源利用豐度指數(shù)顯著低于CK，且分別減少了4.11和2.00，同時(shí)FS碳源利用豐度指數(shù)比FS-30N降低了2.11，且兩者差異達(dá)到顯著水平。還田后60 d，F(xiàn)S和FS-30N處理碳源利用豐度指數(shù)顯著低于CK，分別降低了2.00和1.77，但FS與FS-30N處理間差異不顯著。

表2 不同處理微生物功能多樣性分析

AWCD表征微生物群落對(duì)碳源的利用率。從圖3可以看出，菜薹尾菜原位還田后，與CK相比，F(xiàn)S和FS-30N處理AWCD均呈下降趨勢(shì)。尾菜還田后的30~60 d，CKAWCD（96~168h）顯著 高于FS和FS-30N（P＜0.05），且在45 d FS-30NAWCD（96~168 h）顯著高于FS（P＜0.05）。以培養(yǎng)120 h的AWCD對(duì)尾菜還田下不同處理土壤微生物碳源利用能力進(jìn)行主成分分析。還田后10、20、30、45、60 d各處理分別提取了6、4、10、9、10個(gè)主成分，其累積方差貢獻(xiàn)率分別達(dá)82.06%、80.20%、84.77%、82.19%和80.54%，其中2個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率分別達(dá)62.89%、69.87%、37.80%、42.35%和33.25%。

圖3 不同處理AWCD和PCA分析

尾菜還田后10 d FS和FS-30N碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類、多聚物的OD顯著低于CK，且分別降低了32.57%和27.80%、27.51%和29.77%、43.93%和50.08%、31.55%和34.75%（圖4）。對(duì)于聚合物而言，與還田后10 d相比，還田后60 d CK、FS和FS-30NOD分別增加了28.32%、77.50%和102.56%。與還田后10 d相比，還田后60 d FS和FS-30N碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類、酚酸、胺類的OD分別提高了29.49%和28.49%、42.70%和27.48%、42.70%和27.48%、33.21%和48.52%、84.58%和37.16%。

圖4 不同處理碳源利用能力分析

在移栽后10 d土壤對(duì)碳水化合物、氨基酸和羧酸類的利用能力較強(qiáng)，隨著時(shí)間的推進(jìn)，土壤主要對(duì)碳水化合物和羧酸類具有較強(qiáng)的利用能力，而到移栽后45 d又以碳水化合物、氨基酸和羧酸類利用為主，到最后60 d則主要以碳水化合物和羧酸類為主。在整個(gè)過(guò)程中，酚酸、多聚物和胺類化合物中的2-羥基苯甲酸、吐溫-80和苯乙胺始終具有較高的利用能力。從圖5可以看出，尾菜還田后10 d土壤微生物功能多樣性發(fā)生了明顯的變化，還田以后也明顯地改變了土壤微生物功能多樣性。

圖5 碳源利用能力熱圖聚類分析

2.3 土壤活性碳氮與功能多樣性相關(guān)性分析

從表3可以看出，相比活性有機(jī)碳，硝態(tài)氮對(duì)六大類碳源的影響較大，其中對(duì)碳水化合物和多聚物的影響比較顯著。六大類碳源對(duì)多樣性指數(shù)的影響最大，其次是優(yōu)勢(shì)度指數(shù)和豐度指數(shù)，對(duì)均一度指數(shù)的影響最小。多聚物對(duì)微生物功能多樣性的影響最大，其次是碳水化合物和氨基酸類。

表3 不同指標(biāo)相關(guān)性分析

3 討論

尾菜還田后能夠改善土壤的理化性狀和作物品質(zhì)，以及提高產(chǎn)量［12，13］。研究發(fā)現(xiàn)蔬菜廢棄物直接還田后能夠增加當(dāng)季或者第二季作物產(chǎn)量［5，14，15］。然而，目前有關(guān)尾菜直接還田后對(duì)土壤基本性質(zhì)影響的研究尚不多見。胡國(guó)平等［7］研究表明蔬菜廢棄物還田可以降低土壤硝態(tài)氮淋失風(fēng)險(xiǎn)。本研究表明，與常規(guī)施肥相比，在常規(guī)施肥基礎(chǔ)上尾菜還田后60 d土壤硝態(tài)氮含量增加了6.51%~21.18%，這與胡國(guó)平等［7］研究結(jié)果一致。然而在尾菜還田的基礎(chǔ)上化肥減施30%，土壤的硝態(tài)氮含量增加了3.79%~18.99%，此外，產(chǎn)量也沒(méi)有顯著差異，這也進(jìn)一步說(shuō)明了低碳氮比（17.5）菜薹尾菜還田增加了速效氮的礦化［7，16］。

土壤活性有機(jī)碳是評(píng)價(jià)土壤碳平衡和土壤化學(xué)、生物化學(xué)肥力保持的重要指標(biāo)［17］。本研究結(jié)果表明，與常規(guī)施肥相比，菜薹尾菜還田后降低了土壤活性有機(jī)碳的含量。張玉軍等［18］研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期有機(jī)肥和秸稈還田也降低了紅壤水稻土的活性有機(jī)質(zhì)含量，但是大量的試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)施有機(jī)肥或者有機(jī)無(wú)機(jī)肥配施，較單施化肥顯著提高了土壤活性有機(jī)碳的含量［19］。這可能是尾菜與有機(jī)肥和秸稈之間碳氮比差異有關(guān)，高碳氮比增加了土壤微生物的活性，大量的速效碳氮被微生物自身消耗而使得土壤累積較少［18］。

研究尾菜還田對(duì)土壤微生物功能多樣性的影響，對(duì)于探索尾菜還田模式下的土壤綠色生態(tài)發(fā)展具有理論指導(dǎo)意義［20，21］。在本研究中，與常規(guī)施肥相比，尾菜還田后10 d土壤微生物功能多樣性發(fā)生了明顯的變化，對(duì)主要碳源的利用能力有所提高，但是與常規(guī)施肥相比，還田處理降低了土壤微生物功能多樣性，但是這種改變?cè)?0 d后得到了緩解。然而目前有關(guān)有機(jī)物料施入對(duì)于土壤微生物碳源利用能力多樣性影響的研究普遍表現(xiàn)為正向效益［22，23］，這主要的原因可能是低碳氮比尾菜（碳氮比17.5）大量還田同時(shí)配合化肥施用短期導(dǎo)致土壤碳氮比降低，影響了有機(jī)質(zhì)的礦化，從而影響碳源利用能力［24］，此外還可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)值觀測(cè)了60 d，還田后的正向激發(fā)效應(yīng)還未顯示出來(lái)，但是60 d已經(jīng)有恢復(fù)的跡象。因此，大量的低碳氮比尾菜還田對(duì)土壤微生物碳源利用能力的影響還需要延長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)一步觀測(cè)。

微生物群落碳源代謝強(qiáng)度和代謝類型的變化被認(rèn)為是預(yù)測(cè)土壤質(zhì)量變化最有潛力的敏感性生物指標(biāo)。在本研究中土壤微生物碳水化合物和羧酸類具有較強(qiáng)的利用能力，且在追肥過(guò)后氨基酸類也表現(xiàn)出較強(qiáng)的利用能力。不同的試驗(yàn)結(jié)果表明土壤微生物利用能力較高的碳源種類不一［25］，這可能是由于土壤生境的差異，造成的微生物對(duì)土壤碳源種類具有不同的偏好［22］。在本研究中硝態(tài)氮對(duì)土壤微生物功能多樣性的影響較大，因此，在尾菜還田后應(yīng)該注意氮肥的運(yùn)籌，從而避免微生物與植物爭(zhēng)“氮”［26，27］。

4 小結(jié)

1）在常規(guī)施肥基礎(chǔ)上尾菜還田后60 d土壤硝態(tài)氮含量增加了6.51%~21.18%，然而在尾菜還田的基礎(chǔ)上化肥減施30%土壤的硝態(tài)氮含量增加了3.79%~18.99%。還田后處理均降低了土壤活性有機(jī)碳的含量。

2）與常規(guī)施肥相比，尾菜還田和還田后化肥減施30%處理均降低了土壤碳源利用能力。尾菜還田后10 d土壤微生物功能多樣性發(fā)生了明顯的變化，但是60 d后處理間的差異有縮小的趨勢(shì)。還田后60 d內(nèi)土壤微生物主要對(duì)碳水化合物和羧酸類具有較強(qiáng)的利用能力。

3）相比活性有機(jī)碳，硝態(tài)氮顯著影響碳水化合物和多聚物代謝。六大類碳源對(duì)多樣性指數(shù)的影響最大，對(duì)均一度指數(shù)的影響最小。多聚物、碳水化合物和氨基酸類對(duì)微生物功能多樣性的影響最大。