基于多成分含量測(cè)定結(jié)合化學(xué)計(jì)量法評(píng)價(jià)水族藥材罵廣瓦質(zhì)量

曾文輝，龔千鋒，楊民榮

1.江西省藥品檢查員中心，江西 贛州 341000；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330000；3.贛州市綜合檢驗(yàn)檢測(cè)院食品藥品檢測(cè)所，江西 贛州 341000

罵廣瓦為馬兜鈴科植物金耳環(huán)Asarum insignediels 的全草。具有溫經(jīng)散寒、消腫化瘀、行氣止痛的功效。多用于治療風(fēng)寒痹痛、跌打損傷等癥［1］。是我國(guó)水族人民常用藥材，又名為金耳環(huán)，被廣泛使用。主要分布在廣西、貴州、福建等地，在《廣西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》1990 版、《廣西壯族質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（第二卷）》中均以金耳環(huán)之名收載，控制項(xiàng)簡(jiǎn)單，不足以控制其藥材質(zhì)量。近年來(lái)，馬兜鈴科的植物因含馬兜鈴酸類成分而被關(guān)注，所含有的馬兜鈴酸I 及馬兜鈴內(nèi)酰胺類化合物都具有腎細(xì)胞毒性［2-4］，而罵廣瓦作為馬兜鈴科植物，對(duì)此，有必要對(duì)其含有的馬兜鈴酸類成分進(jìn)行檢測(cè)和研究。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［5］，罵廣瓦主要含有黃酮類、氨基酸、糖類和揮發(fā)油等，其中甲基丁香酚具有降壓、鎮(zhèn)靜、抗炎等功效［6-8］，相關(guān)藥理表明，罵廣瓦具有鎮(zhèn)痛抗炎、止咳祛痰的功效［9-10］。但目前缺乏有效的質(zhì)量控制，對(duì)罵廣瓦的應(yīng)用開發(fā)具有一定的限制，本文在參考相關(guān)文獻(xiàn)［11-12］基礎(chǔ)上，建立了高效液相色譜法測(cè)量罵廣瓦中5 個(gè)含量（包括馬兜鈴酸類和甲基丁香酚）的方法，并結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)不同產(chǎn)地的樣品進(jìn)行區(qū)別分類探索，為系統(tǒng)的評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津LC-20AD 型高效液相色譜儀，AUW220D型電子天平（十萬(wàn)分之一，日本島津公司）；BS224S型電子天平（萬(wàn)分之一，Sartorius）；KQ5200 型水浴鍋（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

甲基丁香酚（批號(hào)：111642-200301，純度為99.0%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；馬兜鈴酸I（批號(hào)：110746-201912，純度為99.1%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；馬兜鈴酸Ⅱ（批號(hào)：191012-04，純度為99.5%），馬兜鈴內(nèi)酰胺I（批號(hào)：190925-01，純度為98.5%），馬兜鈴?fù)ㄅ?hào)：200721-02，純度為98.7%），均購(gòu)自于成都普思生物科技股份有限公司，供含量測(cè)定使用。甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

本實(shí)驗(yàn)收集到不同批次的罵廣瓦樣品共14 批，樣品信息見表1，樣品經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)龔千鋒教授鑒定為罵廣瓦Asarum insignediels.

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 罵廣瓦藥材供試品溶液

精密稱取罵廣瓦藥材粉末（過(guò)四號(hào)篩）1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱重，回流提取30 min，稱重補(bǔ)重，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取甲基丁香酚、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴內(nèi)酰胺I、馬兜鈴酸I、馬兜鈴?fù)獙?duì)照品適量，分別加甲醇制成每1 mL 含甲基丁香酚123.2 μg、馬兜鈴酸Ⅱ25.2 μg、馬兜鈴內(nèi)酰胺I 3.6 μg、馬兜鈴酸I6.2 μg及馬兜鈴?fù)?2.1 μg 的溶液，備用。

2.3 色譜條件

色譜柱：Welch C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈（A）-7.0 mmol/L 磷酸緩沖溶液（pH=2.3）（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0 →15 min，A：40%；15 →25 min，A：40%～45%；25 →55 min，A：45%～80%；55 →60 min，A：80%～40%）；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；流速：1.0 mL/min，柱溫40 ℃。罵廣瓦藥材供試品溶液中5 個(gè)成分分離度良好，如圖1 中A、B 圖。

圖1 混合對(duì)照品（A）和罵廣瓦供試品（B）色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系試驗(yàn)精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用甲醇按比例稀釋成不同濃度的混合對(duì)照品溶液（母液分別稀釋5 倍、10 倍、50 倍、100 倍、250 倍）。在“2.3”色譜條件下，對(duì)母液及稀釋的不同濃度的對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到表2 中各對(duì)照品的回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

表2 線性關(guān)系

2.4.2 精密度試驗(yàn)分別精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄甲基丁香酚、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴內(nèi)酰胺I、馬兜鈴酸I、馬兜鈴?fù)姆迕娣e值，結(jié)果顯示5 個(gè)成分的RSD 分別0.31%、0.11%、0.54%、0.39%及0.22%。表明儀器的精密性較好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液（批號(hào)：S11），精密吸取供試品溶液10 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，按一定的間隔時(shí)間進(jìn)樣，測(cè)定供試品溶液中甲基丁香酚、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴內(nèi)酰胺I、馬兜鈴酸I和馬兜鈴?fù)迕娣e值，結(jié)果顯示在24 h 內(nèi)5 個(gè)成分的RSD 為0.24%、1.25%、0.78%、1.02%及0.81%。表明供試品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)取已知罵廣瓦藥材（批號(hào)：S11）約1.0 g，共六份，照“2.1”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法制成供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定供試品溶液中甲基丁香酚、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴內(nèi)酰胺I、馬兜鈴酸I 和馬兜鈴?fù)迕娣e值，計(jì)算含量，結(jié)果顯示，甲基丁香酚平均含量為0.052 0 mg/g（RSD 為1.22%）；馬兜鈴酸Ⅱ平均含量為0.031 0 mg/g（RSD 為1.45%）、馬兜鈴內(nèi)酰胺I 平均含量為0.034 0 mg/g（RSD 為0.85%）、馬兜鈴酸I 平均含量為0.038 0 mg/g（RSD 為1.15%）及馬兜鈴?fù)骄繛?.021 0 mg/g（RSD 為1.63%）。表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.4.5 平均加樣回收率試驗(yàn)稱取已知含量的樣品（批號(hào)：S11）約1.0 g 六份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入已配制的甲基丁香酚、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴內(nèi)酰胺I、馬兜鈴酸I、馬兜鈴?fù)獫舛确謩e為0.001 0 mg/mL、0.000 6 mg/mL、0.000 6 mg/mL、0.000 8 mg/mL、0.000 4 mg/mL 的70%甲醇溶液50 mL，按照“2.1”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，測(cè)定溶液中5 個(gè)成分的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

表3 5個(gè)成分的加樣回收率

2.5 樣品的含量測(cè)定

取14 批不同罵廣瓦藥材，分別照“2.1”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每份進(jìn)樣3 次，計(jì)算5 個(gè)成分的含量，結(jié)果見表4。

表4 不同產(chǎn)地罵廣瓦中5個(gè)成分含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

2.6 化學(xué)模式識(shí)別研究

采用SPSS 21.0 軟件將表4 中5 個(gè)成分的定量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以Person 相關(guān)性進(jìn)行間距分析，將14 個(gè)批次進(jìn)行分類，結(jié)果由圖2A 所示?？傮w來(lái)看，14 個(gè)批次不能顯著的進(jìn)行分類區(qū)別，各產(chǎn)地各批次的差異難以區(qū)分。此外，對(duì)5 個(gè)成分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行主成分因子分析，計(jì)算成分的特征值和貢獻(xiàn)率，同時(shí)，計(jì)算相關(guān)系數(shù)矩陣、主成分特征值、累積貢獻(xiàn)率等，得到綜合評(píng)分，對(duì)各批次罵廣瓦進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果見表5，碎石圖見圖2B。由表5 和圖2B 可知，5 個(gè)成分中，前3 個(gè)成分（甲基丁香酚、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴內(nèi)酰胺I 的累積方差貢獻(xiàn)率87.279%）的特征值較大（>1），若以貢獻(xiàn)率80%以上作為標(biāo)準(zhǔn)，前3 個(gè)成分即可反映整體信息。

表5 主成分因子的特征值和方差貢獻(xiàn)率

圖2 罵廣瓦5個(gè)成分含量聚類樹狀關(guān)系圖（A）和碎石圖（B）

收集的14 批罵廣瓦中5 個(gè)成分定量數(shù)據(jù)，運(yùn)用SIMCA 13.0 軟件進(jìn)行主成分分析，從圖3 中的PCA 圖可以看出，批次S1-S5、S6-S10 及S11-S14分別對(duì)應(yīng)廣西、廣東和福建的樣品，可大致的區(qū)分，但存在一定的離散偏差；從OPLS-DA 圖中，可清楚把三個(gè)地方收集的樣品進(jìn)行區(qū)分，可直觀的發(fā)現(xiàn)不同地理來(lái)源罵廣瓦的差異。

圖3 罵廣瓦PCA圖（A）和OPLS-DA分析圖（B）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)供試品提取溶劑（甲醇、乙醇、水及不同比例的甲醇水、乙醇水等），不同流動(dòng)相組成及不同檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了篩選研究。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，70%甲醇作為溶劑時(shí)，提取的成分最多，峰響應(yīng)良好，分離度優(yōu)良，故選用70%甲醇作為本研究中樣品的提取溶劑。選用乙腈-磷酸緩沖鹽作為流動(dòng)相較于乙腈-氨水系統(tǒng)、乙腈-三乙胺等系統(tǒng)在色譜峰基線、峰的對(duì)稱性等方面有優(yōu)勢(shì)；梯度程序洗脫，5 個(gè)待測(cè)峰分離良好。用二極管陣列檢測(cè)器（PDA），在不同的波長(zhǎng)如203 nm、230 nm、270 nm、310 nm 等條件下進(jìn)行峰形的比較，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)器波長(zhǎng)在230 nm時(shí)，峰信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)，出峰較全面，分離度良好，故本研究選用230 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

由表4 中數(shù)據(jù)可知，14 批樣品中，上述5 個(gè)成分中甲基丁香酚的平均含量較其他成分含量最大，且不同產(chǎn)地的樣品有一定的差異，這與其起鎮(zhèn)痛抗炎作用可能存在直接關(guān)系；而馬兜鈴酸類及其內(nèi)酰胺類成分都幾乎小于100 μg/g 的范圍內(nèi)，對(duì)于控制其毒性要求，規(guī)定一定的限量范圍具有指導(dǎo)作用。對(duì)于質(zhì)量標(biāo)志物的選擇，功效成分和有毒成分均可作為選擇的依據(jù)參考，可根據(jù)用藥選擇進(jìn)行考慮；不同產(chǎn)地的5 個(gè)成分在含量存在一定的差異，數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，甲基丁香酚、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴內(nèi)酰胺I 可作為影響差異的主要成分，OPLSDA 圖也可直觀的區(qū)別不同產(chǎn)地的樣品。所以在不同來(lái)源的樣品中比較中，可選擇影響因素大的3 個(gè)成分進(jìn)行說(shuō)明，而針對(duì)功效定量選擇，則可把甲基丁香酚作為指標(biāo)依據(jù)；而對(duì)于毒性的控制，則可選擇馬兜鈴酸類及其內(nèi)酰胺類成分進(jìn)行限量控制，并需要結(jié)合相應(yīng)的毒理實(shí)驗(yàn)。本研究建立的罵廣瓦的含量測(cè)定方法可用于評(píng)價(jià)該藥材的質(zhì)量，具有特異性、選擇性，更能體現(xiàn)質(zhì)量標(biāo)志物以控制產(chǎn)品質(zhì)量。同時(shí)，為后期的藥理、毒理-量效關(guān)系的研究提供一定的基礎(chǔ)。