木犀草素/阿霉素雙載藥納米粒治療三陰乳腺癌的體外研究

常炳程，何蔚，夏志鴻

貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550003

臨床治療后腫瘤的轉(zhuǎn)移復發(fā)，是三陰乳腺癌的患者預后不良的首要原因［1-3］。近年來，各種天然中草藥活性成分正成為國內(nèi)腫瘤藥物開發(fā)的熱點。木犀草素（luteolin，LUT），是一種提取自中草藥的黃酮類化合物，不僅具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗菌、解痙等多重藥理活性，同時對多種腫瘤的耐藥和轉(zhuǎn)移均有強效抑制作用，在三陰乳腺癌的治療方面極具潛力［4-8］。然而，木犀草素在水溶液中溶解度與藥劑溶出速率極低，且在胃腸道中易被微生物降解，難以通過口服吸收的方式遞送至腫瘤組織發(fā)揮療效［8-10］。由此可見，我們急需開發(fā)一種能高效運載木犀草素到達病灶部位發(fā)揮藥理活性的藥物遞送體系。

聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactic acidglycolic acid），PLGA］是一種應用廣泛的藥用輔料，其能夠在人體內(nèi)完全降解為無害的乳酸小分子，生物相容性極好［11］。本研究采用單乳法制備了一種可高效包封木犀草素的納米粒（PLGA-NPs@DOX/LUT），并同時搭載了模式化療藥物阿霉素（doxorubicin，DOX）與其配伍，研究其對三陰乳腺癌轉(zhuǎn)移的治療作用。

1 實驗儀器、材料和方法

1.1 儀器和試劑

PLGA（羧基末端，50∶50，分子量24 000～38 000），PVA（聚乙烯醇；醇解度：98.0～99.0 mol%，黏度：5.2～6.0 mPa.s）；木犀草素、N，N-二甲基甲酰胺、甘露醇等化學試劑均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鹽酸阿霉素購自武漢卡諾斯科技有限公司；MBA-MD-231 三陰乳腺癌細胞系來源于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細胞庫；MTT 試劑盒與細胞培養(yǎng)生化試劑均采購來白鯊公司。

800 目銅碳網(wǎng)購自中鏡科儀；萊恩德全自動多功能酶標儀；日立CF-RN 冷凍高速離心機；奧林巴斯CKX53 倒置相差顯微鏡；Elma P300H 超聲波清洗儀；Nano S90 激光粒度儀（英國馬爾文公司）Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Avestin LF-1 脂質(zhì)體擠出器；賽默飛Forma310/311 二氧化碳培養(yǎng)箱；Corning 公司24 孔板Transwell 3422，8 μm。

1.2 PLGA-NPs@DOX/LUT 與對照組納米粒構(gòu)建

首先將PLGA 3.5 mg，LUT 0.8 mg，脫鹽后的DOX 1 mg，溶解于3 mL 體積比為2∶1 氯仿/乙醇混合溶液中待用。配制6 mL 濃度5 %的PVA水溶液，并將上述PLGA 混合溶液用針頭在超聲波清洗儀中逐滴加入，繼續(xù)超聲5 min 后，將所有溶液轉(zhuǎn)移至小燒瓶中，并同時加入0.5 % PVA溶液15 mL，敞口揮發(fā)有機溶液，磁力攪拌過夜，轉(zhuǎn)速1 000 rpm。12 h 后，收集所有溶液，短暫超聲分離后低速離心5 min（3 000 r/min）除去大顆粒。接著高速離心30 min（18 000 r/min），收集沉淀并重新分散保存于甘露醇水溶液中，最終利用脂質(zhì)體擠出器過膜0.4 μm，得到納米粒PLGA@DOX/LUT。

對照組單藥納米粒與無藥納米粒PLGA-NPs@DOX、PLGA-NPs@LUT、PLGA-NPs 均僅在原料中省去對應成分并采用相同方法構(gòu)建。

所有藥物合成材料與環(huán)境均經(jīng)過無菌過濾處理，而且納米藥物在進入細胞實驗前需利用0.4 μm濾膜除菌后使用。

1.3 納米?；颈碚?/h3>

電鏡拍攝：取納米粒純水分散液數(shù)滴置于800 目銅碳網(wǎng)上，室溫晾干后用磷鎢酸負染液（0.2%）染色5 min，再用蒸餾水再次潤濕后自然干燥。最后將標本寄送至三方電鏡檢測平臺送測。掃描電鏡直接取標本凍干粉末寄送；激光粒度儀檢驗：取納米粒0.1 mg 超聲分散于3 mL PBS 溶液中，直接使用電勢粒度專用池子探頭進行檢驗；體外穩(wěn)定性測試：取納米粒0.1 mg 超聲分散于3 mL PBS 溶液中，分別在既定時間點檢測其粒徑變化；載藥量測試：取納米粒1 mg 溶解于20 mL 的氯仿/乙腈（3∶1）混合溶液中，充分過濾后，旋干后使用展開劑復溶，利用HPLC檢測其中木犀草素與阿霉素含量。標準曲線使用購買的原料藥倍比稀釋配制而成。計算公式：載藥量=（溶出藥物質(zhì)量/所溶解的總納米粒質(zhì)量）×100%。

1.4 體外藥物釋曲線

取納米粒1 mg 分散于pH 7.4 的PBS 或者pH 5.0的醋酸鹽緩沖液中，置于恒溫箱（37 ℃）震蕩；按預設時間定時取出分散液，離心分離上清待測，并重新加入等量新鮮緩沖液，并重復此操作；最后將不同時間點的待測上清溶液凍干后，用以上HPLC流動相復溶并檢測，計算每個時間節(jié)點的累計藥物釋放量并繪圖。

1.5 細胞毒性實驗

細胞采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)擴增后，將消化分散后的MDA-MB-231細胞分別按4 000 個細胞每孔的濃度，鋪入96 孔板。24 h 后，將每孔原有培養(yǎng)基更換為含有梯度濃度（倍比稀釋阿霉素濃度：5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25 μg/mL）的游離阿霉素DOX、PLGA-NPs@DOX/LUT、PLGA-NPs@DOX、PLGA-NPs@LUT、PLGA-NPs 或PBS 的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，接著更換含有MTT 的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 h。小心吸去上清后，加入DMSO 溶解紫色結(jié)晶并使用酶標儀檢測490 nm 處吸光度。

1.6 Transwell 遷移與侵襲實驗

細胞遷移：將游離DOX/LUT、PLGA-NPs@DOX/LUT、DOX、DOX 0.02 mg/mL 或PBS 混入無血清培養(yǎng)基，并且取8 000 個MDA-MB-231 細胞分散至150 μL 無血清培養(yǎng)基中，滴入Transwell 小室薄膜上層，然后將小室放置于小孔中，并在小孔下層加入1 mL 無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后，取出Transwell 小室，抹去薄膜上層細胞，多聚甲醛固定細胞后，用0.1%結(jié)晶紫染色2 min 后，觀察下層遷移過薄膜的細胞。

細胞侵襲實驗在加入細胞前需要先在小室上層鋪入50 μL11% BD Matrigel 基質(zhì)膠。后續(xù)與細胞遷移實驗一致，但培養(yǎng)時間需延長至48 h 后再染色觀測。

1.7 統(tǒng)計學方法

項目數(shù)據(jù)使用SPSS 軟件分析。數(shù)據(jù)均采用t檢驗評價實驗組與對照組差別，每一項數(shù)據(jù)的收集n=3。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 納米粒PLGA-NPs@DOX/LUT 的基本性能表征

首先通過透射電鏡觀察，PLGA-NPs@DOX/LUT 納米粒呈規(guī)則圓球形，分散狀態(tài)良好，未發(fā)現(xiàn)團聚現(xiàn)象（見圖1）；結(jié)合激光粒度儀的動態(tài)光散射數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)納米粒水合粒徑約為114.8 nm，表面電勢為（-15.46 mV)；而且通過溶液萃取納米粒，并利用高效液相色譜分析可知，其實現(xiàn)了難溶性天然中草藥組分木犀草素與阿霉素的高效包封，對阿霉素載藥量為18.11 %，木犀草素10.15 %，分散性與表面電勢也基本符合課題設計要求（見表1）。

圖1 納米粒PLGA-NPs@DOX/LUT的電鏡照片：

此外，動態(tài)光散射數(shù)據(jù)顯示，對照給藥組PLGA-NPs@DOX、PLGA-NPs@LUT、PLGA-NPs 粒徑與實驗組尺寸相似，粒徑均為120 nm 左右，載藥量差異不大（見表1）。

表1 納米粒動態(tài)光散射檢測數(shù)據(jù)與載藥量（）

表1 納米粒動態(tài)光散射檢測數(shù)據(jù)與載藥量（）

2.2 納米粒PLGA-NPs@DOX/LUT 的體外藥物釋放

首先，通過體外穩(wěn)定性測試實驗可見，PLGANPs@DOX/LUT 在含有10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基環(huán)境下結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，粒徑在32 h 內(nèi)變化不明顯，見圖2A。

圖2 納米粒PLGA-NPs@DOX/LUT藥物穩(wěn)定性測試與藥物釋放曲線：A.體外穩(wěn)定性測試；B.藥物釋放曲線

通過藥物釋放實驗可見，納米粒中包封的藥物在中性環(huán)境下藥物釋放緩慢，而當我們利用微酸緩沖液模擬腫瘤微環(huán)境時發(fā)現(xiàn)木犀草素在72 h內(nèi)均勻緩釋，阿霉素釋放相對較快48 h 內(nèi)就釋放超過80%，最終實現(xiàn)了兩種封裝藥物的共同釋放，見圖2B。

2.3 納米粒PLGA-NPs@DOX/LUT 的三陰乳腺癌細胞毒性實驗

為了評價PLGA-NPs@DOX/LUT 對于三陰乳腺癌細胞的抑制效果，我們選用了MBA-MD-231 細胞通過MTT 細胞毒性實驗進行測試。在相同藥物濃度條件下，可見PLGA-NPs@DOX/LUT 的加入明顯比單藥納米組PLGA-NPs@DOX、PLGA-NPs@LUT 對腫瘤細胞的毒性更強（見圖3）。經(jīng)過計算，同樣可知PLGA-NPs@DOX/LUT 中阿霉素的IC50 僅為0.628 μg/mL，遠低于單藥組納米粒（PLGA-NPs@DOX 3.475 μg/mL ;PLGA-NPs@LUT >5 μg/mL）。

圖3 納米粒PLGA-NPs@DOX/LUT的腫瘤細胞殺傷能力

2.4 納米粒PLGA-NPs@DOX/LUT 對三陰乳腺癌轉(zhuǎn)移與侵襲的抑制效果

為了在體外評價PLGA-NPs@DOX/LUT 對于三陰乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移復發(fā)的抑制效果，我們利用了Transwell 細胞遷移與侵襲實驗進行評估。在相同藥物濃度的配比下，可見PLGA-NPs@DOX/LUT 能夠最大限度地降低三陰乳腺癌細胞的遷移能力與侵襲能力，與傳統(tǒng)化療組游離DOX組對比有統(tǒng)計學意義。（見圖4）。

圖4 納米粒PLGA-NPs@DOX/LUT對三陰乳腺癌細胞的遷移與侵襲抑制能力：A細胞遷移實驗與統(tǒng)計結(jié)果；B細胞侵襲實驗與統(tǒng)計結(jié)果

3 討論

在近幾十年的發(fā)展中，納米藥物遞送系統(tǒng)得到飛速的發(fā)展，然而我國傳統(tǒng)中草藥中天然組分的制劑研究卻還遠遠落后，難以滿足當前中草藥制劑現(xiàn)代化改革的需求。本課題組從貴州本省道地藥材白毛夏枯草的調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，其主要抗癌活性成分木犀草素具有抗腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移、抗炎和免疫調(diào)節(jié)多種藥理作用［7,12-14］。但受制于其溶解性差、口服給藥效率極低的問題，嚴重制約了其在臨床一線的應用［15］。

本研究將木犀草素與模式抗癌藥物阿霉素共同封裝于PLGA 納米顆粒之中，初步地解決了傳統(tǒng)中草藥活性成分藥物遞送效率較低的問題。通過三陰乳腺癌的細胞殺傷性實驗與細胞遷移侵襲實驗證明，納米藥物遞送系統(tǒng)能夠有效實現(xiàn)木犀草素的有效包封，使其與化療藥物形成協(xié)同抗癌效應，有希望緩解三陰乳腺癌的復發(fā)轉(zhuǎn)移。然而，本研究僅實現(xiàn)了納米藥物遞送系統(tǒng)的初步構(gòu)建與體外藥效驗證，其在體內(nèi)的有效性以及靶向藥物遞送效率尚有待考察，今后還需進一步研究。