基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)研究丹參治療骨關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制*

趙昱東,夏 雨,鄺高艷,沈 浮,張海燕，朱明雙△

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(成都 610075)；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(長沙 410007)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是常見的關(guān)節(jié)退行性疾病[1]。目前，OA已成為導(dǎo)致殘疾的第二大疾病[2]，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，給患者家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)[3]。由OA導(dǎo)致的活動功能障礙，以及非甾體類抗炎藥的使用，會增加心臟和胃腸道疾病引發(fā)的死亡風(fēng)險[4]。癥狀性膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)在我國的患病率為8.1%，可導(dǎo)致全因死亡率增加近1倍[5-6]。全世界估計有2.5億KOA患者，髖、膝關(guān)節(jié)OA每年造成1 700萬人殘疾，占全因致殘率的2.2%[7]。隨著人口老齡化趨勢和肥胖問題加劇，OA患病率明顯增加，其問題亦隨之凸顯[8-10]。目前對OA患者治療，指南推薦基礎(chǔ)、藥物與外科結(jié)合[11]，但是基礎(chǔ)治療效果不確切且成效較緩；非甾體類抗炎藥、鎮(zhèn)痛藥、糖皮質(zhì)激素等長期服用存在消化道出血、心血管風(fēng)險等副作用[12]；外科治療有費用高、風(fēng)險大、部分病人難以耐受等問題[13]。因此，亟待探索安全的補(bǔ)充治療方案。OA是中醫(yī)骨傷科的優(yōu)勢病種，探索能夠有效延緩 OA 早期進(jìn)展、具有改善作用的中醫(yī)干預(yù)手段是非常有潛力的治療策略[14]。

目前中藥治療OA的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制尚不明確[15]，由于中藥具有多成分、多靶點、多通路的特點，單純依靠實驗分析需要耗費大量時間與精力，而且往往難以科學(xué)、有效、全面地闡釋中藥的作用機(jī)制[16]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從拓?fù)涞慕嵌冗M(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析(考慮網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點連接方式所產(chǎn)生的結(jié)構(gòu))，對于分析復(fù)雜系統(tǒng)極為有效[17]，適合于藥理學(xué)多層網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)[18-19]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選丹參治療OA的潛在活性成分，通過分析其作用靶點，為深入探討丹參治療OA的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件

本研究所涉及的軟件有：Cytoscape(V3.7.2,CytoHubba0.1，CytoNCA2.1.6)，Perl(V5.28.1)，R(V3.6.2)，Autodock Vina(V1.1.2)，AutoDockTools(V1.5.6)，Pymol(V1.7.X)，ChemBio3D Ultra(V14.0)。數(shù)據(jù)庫：TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，TTD (http://db.idrblab.net/ttd/)，DrugBank(https://www.drugbank.ca/)，PharmGKB(https://www.pharmgkb.org)，OMIM(https://www.omim.org)，GAD(https://geneticassociationdb.nih.gov/)，Uniprot(https://www.uniprot.org)，DisGeNET(https://www.disgenet.org)，HPO(https://hpo.jax.org/)，String(https://string-db.org)，PDB(https://www.rcsb.org) ，PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)，GeneCards(https://www.genecards.org)，KEGG(https://www.kegg.jp)，GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。

1.2 丹參的活性成分及靶點

檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP)獲得丹參的活性成分，篩選條件為口服生物利用度(OB)≥ 30%，類藥性(DL)≥0.18。

1.3 OA相關(guān)靶點

以“osteoarthritis”為關(guān)鍵詞，檢索DisGeNET、Drug bank、OMIM、GAD、GeneCards、HPO、PharmGKB、TTD、UniProt數(shù)據(jù)庫，得到OA相關(guān)靶點；檢索GEO數(shù)據(jù)庫，下載基因芯片，提取基因矩陣數(shù)據(jù)，進(jìn)行批次矯正后多基因芯片合并分析，篩選差異表達(dá)基因，使用R語言繪制火山圖、基因熱圖。

1.4 丹參與OA共同靶點

利用R語言將OA相關(guān)靶點與丹參藥物靶點取交集，得到丹參與OA共同靶點Venn圖。

1.5 丹參-活性成分-共同靶點-OA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

用Perl軟件處理數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Cytoscape，得到丹參-活性成分-共同靶點-OA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，利用CytoHubba、CytoNCA插件得出核心成分。

1.6 生物學(xué)功能與信號通路

將丹參與OA共同靶點導(dǎo)出，配合Bioconductor插件運(yùn)行基因功能(GO)和KEGG信號通路富集分析。

1.7 丹參-OA靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein interaction network,PPI)及PPI核心靶點

將共同靶點導(dǎo)入String網(wǎng)站，篩選條件為“Homo sapiens”種屬，最低互作分值設(shè)為0.4，下載PPI網(wǎng)絡(luò)圖，制作PPI核心靶點條形圖。

1.8 分子對接結(jié)合

選擇影響靶點數(shù)目居前3位的活性成分作為配體，PPI 網(wǎng)絡(luò)中鄰接節(jié)點數(shù)最多的靶點作為受體，通過PubChem及ChemBio3D Ultra獲得活性成分的三維結(jié)構(gòu)，從PDB數(shù)據(jù)庫下載靶點的蛋白結(jié)構(gòu)，然后導(dǎo)入PyMOL、AutoDock Tools軟件進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)常規(guī)預(yù)處理，將處理完的受體和配體導(dǎo)入AutoDock Vina進(jìn)行分子對接，對接參數(shù)為默認(rèn)值[20]。PubChem數(shù)據(jù)庫檢索木犀草素、丹參酮ⅡA、隱丹參酮的CID分別為5280445、164676、160254，下載并通過ChemBio3DUltra軟件繪制木犀草素、隱丹參酮、丹參酮ⅡA三維結(jié)構(gòu)。PDB數(shù)據(jù)庫檢索蛋白結(jié)構(gòu)，根據(jù)配體與所選化合物結(jié)構(gòu)類似、解析度較小原則[21]，選取對應(yīng)ID為6HHJ、409H、6GGE的三維結(jié)構(gòu)并下載。進(jìn)行去水分子，分離原始配體等常規(guī)預(yù)處理，導(dǎo)入AutoDockVina進(jìn)行分子對接[22]，對接參數(shù)為默認(rèn)值。

2 結(jié)果

2.1 丹參的活性成分及靶點

排除無對應(yīng)基因名及重復(fù)部分，獲得活性成分57個，作用于106個靶點(表1)。

表1 丹參活性成分信息(按TCMSP數(shù)據(jù)庫序號排列)

2.2 OA相關(guān)靶點

去除重復(fù)項后，得到OA相關(guān)靶點2 695個。選用GSE117999(正常樣本12，OA樣本12)，GSE98918(正常樣本12，OA樣本12)，GSE51588(正常樣本10，OA樣本40)，GSE48556(正常樣本33，OA樣本106)4個基因芯片，繪制火山圖(圖1)，LogFC絕對值<1，校正后P≥0.001，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)的基因為黑點，在OA患者體內(nèi)表達(dá)下調(diào)的差異基因為綠點，共242個；表達(dá)上調(diào)的基因為紅點，共140個，差異表達(dá)基因共382個。篩選LogFC絕對值≥1.5，校正后P<0.001的基因制作熱圖，OA組與正常組基因表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

圖1 OA差異基因火山圖

圖2 OA差異表達(dá)基因熱圖

2.3 丹參與OA共同靶點

篩選出丹參活性成分靶點與疾病數(shù)據(jù)庫中OA相關(guān)靶點及GEO差異表達(dá)基因的交集68個，即丹參治療OA潛在靶點，導(dǎo)出Venn圖(圖3)。

圖3 靶點交集Venn圖

2.4 丹參-活性成分-共同靶點-OA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

影響靶點數(shù)量前3的活性成分為木犀草素、丹參酮ⅡA、隱丹參酮，分別對41、20、14個共同靶點產(chǎn)生影響(圖4)。

圖4 丹參-OA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.5 生物學(xué)功能與信號通路

富集程度前20的GO功能，主要包括：細(xì)胞因子受體結(jié)合，DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性，磷酸酶結(jié)合，泛素蛋白連接酶結(jié)合，受體配體活性，RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激酶調(diào)節(jié)活性等(圖5)。

圖5 GO富集分析氣泡圖(前20)

富集程度前20的KEGG信號通路，主要包括：PI3K-Akt信號通路,腫瘤蛋白多糖信號通路,EB病毒感染信號通路,血流剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路,內(nèi)分泌抵抗信號通路,IL-17信號通路,腫瘤壞死因子信號通路,細(xì)胞凋亡信號通路等(圖6)。

圖6 KEGG富集分析氣泡圖(前20)

2.6 丹參-OA靶點PPI網(wǎng)絡(luò)與PPI核心靶點

繪制核心靶點條形圖，AKT1、IL6、TP53成為丹參治療OA核心靶點幾率較大(圖7)；繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，68個節(jié)點代表丹參-OA共同靶點，1 000條邊代表靶點間基因鄰接、基因融合、基因共現(xiàn)、基因共表達(dá)、基因蛋白同源等相互作用關(guān)系(圖8)。

圖7 丹參治療OA核心靶點

圖8 靶點基因PPI圖

2.7 分子對接結(jié)合

對接結(jié)果顯示，自由結(jié)合能均<-5.0 kcal/mol標(biāo)準(zhǔn)，證明構(gòu)象能量低，分子結(jié)合穩(wěn)固[23]。根據(jù)自由結(jié)合能大小，選取木犀草素、丹參酮ⅡA、隱丹參酮與AKT1分子對接結(jié)果進(jìn)行可視化展示(表2、圖9)。

表2 丹參成分與核心靶點分子對接得分(kcal/mol)

圖9 木犀草素、丹參酮、隱丹參酮與AKT1蛋白分子對接示意圖

3 討論

OA是一種常見的關(guān)節(jié)退行性疾病，發(fā)病因素可能為遺傳、代謝、生化和生物力學(xué)綜合作用導(dǎo)致的軟骨細(xì)胞、軟骨下骨和細(xì)胞外基質(zhì)代謝異常[24]。隨著關(guān)節(jié)軟骨變性及負(fù)重處關(guān)節(jié)軟骨面的消失，軟骨下骨變性，關(guān)節(jié)纖維增生，軟骨下骨骨質(zhì)硬化，關(guān)節(jié)緣骨贅形成，出現(xiàn)滑膜非特異性炎癥[25-26]。由于慢性炎癥的持續(xù)損害和關(guān)節(jié)組織漸進(jìn)的結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致病情不斷進(jìn)展，最終表現(xiàn)為疼痛和關(guān)節(jié)功能不可逆性喪失[27]。

丹參可活血祛瘀、涼血消癰、清心除煩、通經(jīng)止痛[28]。研究[29]表明，丹參注射液關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射在治療OA早期，對膝關(guān)節(jié)功能改善優(yōu)于玻璃酸鈉注射組，遠(yuǎn)期療效與玻璃酸鈉注射組相似,MRI掃描的ADC值以及ISOA評分均較治療前降低。KOA模型大鼠實驗研究[30]表明，丹參酮組KOA評估值低于甲氨蝶呤組和楓楊乙醇提物組，說明丹參酮對KOA有較好的緩解作用。

研究[31-34]結(jié)果顯示，木犀草素可抑制炎癥因子TNF-α、iNos、IL1β、IL6，以及促血管生長相關(guān)因子PDGF、VEGF、HIF-1α的表達(dá)，實驗表明木犀草素可減低OA大鼠腳腫脹體積,關(guān)節(jié)炎指數(shù),血及滑膜液中白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞數(shù)值,調(diào)節(jié)Th1/Th2、Th17/Treg平衡,抑制P2X4信號通路，抑制巨噬細(xì)胞激活?！吨袊幍洹穂35-36]規(guī)定：丹參酮ⅡA、隱丹參酮均為丹參藥材主要質(zhì)控成分。研究[37-39]表明，隱丹參酮可抑制炎癥介質(zhì)，對炎癥反應(yīng)產(chǎn)生保護(hù)作用,還可通過抑制NF-κB和MAPK信號通路改善OA，通過miR-106a-5p/GLIS3軸保護(hù)軟骨。丹參酮ⅡA可通過抑制細(xì)胞凋亡和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)來預(yù)防關(guān)節(jié)軟骨的降解[40]，抑制TNF-α誘導(dǎo)的IL-1β的表達(dá)[41]。OA病理進(jìn)展過程中的眾多關(guān)鍵基因，同時也是丹參活性成分的作用靶點，這為藥效發(fā)揮提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

PPI分析表明，AKT1、IL6、TP53與其余靶點有良好的相互作用。軟骨細(xì)胞中的AKT1通過抑制軟骨內(nèi)骨化和焦磷酸鹽積聚來控制軟骨鈣化[42], AKT1的遺傳變異與中國漢族人群的KOA易感性高度相關(guān)[43]。IL6在OA活動期呈高表達(dá)狀態(tài),治愈后表達(dá)回落[44]。動物實驗中，IL-6可增強(qiáng)MMP3和MMP13表達(dá)，引起軟骨破壞[45]。機(jī)械應(yīng)力和氧化應(yīng)激等外界刺激,能夠通過SIRT1和JNK等多條信號通路激活p53, 從而誘導(dǎo)線粒體DNA損傷,出現(xiàn)線粒體功能失調(diào),最終導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡[46]。OA軟骨細(xì)胞中,p53的表達(dá)高于正常軟骨細(xì)胞,通過下調(diào)p53表達(dá)能夠減少軟骨細(xì)胞凋亡,進(jìn)而預(yù)防和緩解OA[47]。

KEGG信號通路富集分析表明，富集程度最高的PI3K-Akt可通過激活NF-κB途徑增強(qiáng)成骨細(xì)胞增殖、分化和MMP-13的表達(dá)[48]。該信號通路激活的增加與OA異常骨形成有關(guān)，抑制PI3K-Akt/NF-κB軸能夠預(yù)防OA小鼠的異常骨形成并減輕軟骨變性[49]。其他信號通路中，15.5%的滑膜CD8+T細(xì)胞可能對EB病毒裂解周期蛋白的單個表位具有特異性，病毒特異性T細(xì)胞均以高頻率存在，處于激活狀態(tài)并能夠分泌促炎細(xì)胞因子[50]。STAT3可參與IL-6、IL-15、IFNs和GM-CSF等細(xì)胞因子的表達(dá), 進(jìn)而介導(dǎo)炎癥發(fā)展[51]。

綜上所述，丹參治療OA的機(jī)制不僅表現(xiàn)為參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡，調(diào)節(jié)骨代謝水平，還可抑制炎癥、調(diào)節(jié)免疫，影響骨與軟骨微環(huán)境。但是該研究中獲得的結(jié)果尚未通過實驗驗證，有必要進(jìn)一步實驗驗證以提高研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可行性。本研究為后續(xù)實驗驗證丹參治療OA的分子機(jī)制提供了思路，為針對OA的新藥開發(fā)提供依據(jù)。