內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體結(jié)合蛋白1表達(dá)上調(diào)對(duì)肝癌細(xì)胞遷移與侵襲的影響*

熊 蘭，周曉榕，劉 丹，劉國(guó)晨

空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院 疼痛科 (西安 710038)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)參與物質(zhì)運(yùn)輸、代謝與蛋白質(zhì)合成等調(diào)控的重要場(chǎng)所[1]。越來(lái)越多的研究[2]表明，各種原因?qū)е碌募?xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體結(jié)合蛋白1(endoplasmic reticulum ribosome-binding protein 1，RRBP1)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)非蛋白折疊反應(yīng)的重要蛋白之一，既往在結(jié)腸癌[3]、肺癌[4]、乳腺癌[5]等多種惡性腫瘤中證實(shí)了RRBP1表達(dá)的異常上調(diào)，但目前RRBP1在肝癌中的表達(dá)模式及生物學(xué)作用尚不十分清楚。本研究分別用基于TCGA公共數(shù)據(jù)庫(kù)的生物信息學(xué)分析與免疫組化實(shí)驗(yàn)，分析RRBP1在肝癌尤其是轉(zhuǎn)移性肝癌中的表達(dá)變化，并進(jìn)一步通過(guò)體外細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)分析RRBP1在肝癌轉(zhuǎn)移中的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 材料

肝癌HLF細(xì)胞購(gòu)買(mǎi)自日本癌癥研究資源庫(kù)(Japanese cancer research resources bank， JCRRB)細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞培養(yǎng)用加入10%血清的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱內(nèi)溫度設(shè)定為37 ℃，CO2濃度設(shè)定為5%。RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR反應(yīng)96孔板、PCR試劑與PCR引物均購(gòu)自上海生工生物公司。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司，所有抗體均購(gòu)自武漢三鷹生物公司。

1.2 方法

1.2.1 RRBP1表達(dá)的生物信息分析 利用基于癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)的在線腫瘤基因表達(dá)分析工具UALCAN[6]，對(duì)RRBP1在正常肝組織、未轉(zhuǎn)移肝癌組織與轉(zhuǎn)移肝癌組織中的表達(dá)進(jìn)行分析。

1.2.2 免疫組化實(shí)驗(yàn) 選取2012～2019年空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院(唐都醫(yī)院)普外科收集的36對(duì)肝癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶組織，組織依次經(jīng)4%多聚甲醛固定、石蠟包埋與切片后，進(jìn)行免疫組化染色。實(shí)驗(yàn)步驟為：將切片置于 67 ℃溫箱內(nèi)加熱1 h，之后依次置于3個(gè)重復(fù)的二甲苯、無(wú)水乙醇、85% 乙醇、70% 乙醇與3% H2O2的玻璃缸中浸泡，檸檬酸高壓修復(fù)10 min后，用BSA封閉10 min，之后加入稀釋過(guò)的RRBP1抗體在4 ℃孵育12 h，PBS緩沖液清洗3次，隨后依次加入免疫組化試劑盒中的二抗、三抗與DAB。最后，用蘇木精對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行襯染并對(duì)切片進(jìn)行脫水、透明與封片。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA 將處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌HLF細(xì)胞消化、離心并計(jì)數(shù)，隨后按2×105個(gè)/孔的密度接種至6孔板內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)8 h貼壁后進(jìn)行換液，隨后用Lipofectamine 3000為轉(zhuǎn)染介質(zhì)，向肝癌HLF細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染靶向RRBP1(siRRBP1)或?qū)φ?siCtrl)siRNA片段，轉(zhuǎn)染8 h后為細(xì)胞更換新鮮培養(yǎng)液并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。siRRBP1序列為：5′-GCU CUGUAGUGAAUUCCAUTT-3′(正向)與5′-AU GGAAUUCACUACAGAGCTT-3′(反向)；siCtrl序列為：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′(正向)與5′-ACGUGACACGUUCGUAGAATT-3′(反向)。

1.2.4 RT-PCR實(shí)驗(yàn) 首先，用Trizol裂解液提取不同處理組肝癌細(xì)胞的總RNA，隨后將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，最后將反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。各目的基因擴(kuò)增引物序列如下：RRBP1：正向：5′-TACGACACTCAAACCTTG GGG-3′；反向：5′-GTTGGCTAGGGCTTCTTCA TA-3′。E-cadherin：正向：5′-ATTTTTCCCTCG ACACCCGAT-3′；反向：5′-TCCCAGGCGTAGAC CAAGA-3′。N-cadherin：正向：5′-AGCTCCATTC CGACTTAGACA-3′;反向：5′-CAGCCTGAGCAC GAAGAGTG-3′。ZO -1：正向：5′-CGACCAGATC CTCAGGGTAA-3′；反向：5′-TCCATAGGGAGA TTCCTTCTCA-3′。Vimentin：正向：5′-GACGCC ATCAACACCGAGTT-3′；反向：5′-CTTTGTCGT TGGTTAGCTGGT-3′。內(nèi)參β-actin：正向：5′-TC GCCTTTGCCGATCCG-3；反向：5′-ATGATCTG GGTCATCTTCTCG-3′。最后，用2-△△CT法計(jì)算各組細(xì)胞中目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)實(shí)驗(yàn) 首先，將不同處理組的肝癌細(xì)胞用含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液于液冰上裂解0.5 h，隨后將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，4 ℃，離心力14 000 r/min，離心半徑13.5 cm，20 min后收集上清，加入5×loading buffer煮沸6 min，各組細(xì)胞所提的蛋白樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠分離后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，將膜置于脫脂牛奶封閉1 h后加入稀釋過(guò)的一抗(RRBP1)，4 ℃孵育12 h后用緩沖液PBS洗膜3次，加入二抗于室溫下孵育1.5 h，PBS洗膜3次后加入DAB顯色。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將不同處理組的肝癌細(xì)胞用胰酶消化、離心收集并計(jì)數(shù)，然后將2×105個(gè)細(xì)胞接種至6孔板內(nèi)，培養(yǎng)12 h后待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)孔底面積約90%時(shí)，用槍頭在直尺協(xié)助下劃線，PBS洗去劃痕處未脫落細(xì)胞，隨后在顯微鏡下對(duì)劃痕進(jìn)行拍照，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，再次置于顯微鏡下對(duì)劃痕進(jìn)行拍照。最后，用Image J圖像分析軟件分析各組細(xì)胞劃痕愈合程度。

1.2.7 Transwell細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn) 將不同處理組的肝癌細(xì)胞用胰酶消化、離心收集并計(jì)數(shù)，遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)分別用不帶基質(zhì)膠或帶有基質(zhì)膠的Transwell小室進(jìn)行。用移液器將0.2 mL濃度為2×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液接種至Transwell小室內(nèi)，小室下部加入0.5 mL含15%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液，將小室置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h(遷移實(shí)驗(yàn))或48 h(侵襲實(shí)驗(yàn))后取出。用棉簽擦去上室內(nèi)未發(fā)生遷移與侵襲的細(xì)胞，將遷移或侵襲至小室膜另一側(cè)的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定10 min后，隨后加入結(jié)晶紫染色15 min，PBS清洗3次后，將小室置于通風(fēng)櫥內(nèi)晾干，最后在顯微鏡下拍照和計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 RRBP1在肝癌轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)

利用基于TCGA公共數(shù)據(jù)庫(kù)的UALCAN在線分析工具，對(duì)RRBP1在正常肝組織、未發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝癌組織與發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝癌組織中的表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，RRBP1表達(dá)在正常肝組織中最低，其次為未發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝癌組織，而在發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝癌組織中表達(dá)最高(正常vs原位癌，P<0.001；原位癌vs轉(zhuǎn)移癌，P<0.001)，這提示RRBP1在促進(jìn)肝癌發(fā)生與轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了重要作用(圖 1)。

為驗(yàn)證公共數(shù)據(jù)分析所得結(jié)果，用免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了36對(duì)肝癌原發(fā)灶組織與轉(zhuǎn)移灶組織中RRBP1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RRBP1陽(yáng)性染色主要集中在細(xì)胞漿中，并呈顆粒狀著色(圖2A)。與原發(fā)灶肝癌相比，RRBP1在轉(zhuǎn)移灶肝癌組織中的表達(dá)升高(t=6.324，P<0.001)(圖2B)，進(jìn)一步提示RRBP1在促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮調(diào)控作用。

圖2 免疫組化檢測(cè)36對(duì)肝癌原發(fā)灶組織與轉(zhuǎn)移灶組織中RRBP1的表達(dá)

2.2 下調(diào)RRBP1表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與遷移能力的影響

RRBP1在肝癌轉(zhuǎn)移灶組織中表達(dá)高于原發(fā)灶，提示其可能在肝癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用，因此在體外肝癌細(xì)胞中通過(guò)下調(diào)RRBP1表達(dá)，用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)分析了對(duì)肝癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、遷移與侵襲能力的影響。

設(shè)計(jì)合成了靶向RRBP1表達(dá)的siRNA，并將其轉(zhuǎn)入肝癌HLF細(xì)胞內(nèi)，隨后用RT-PCR與蛋白質(zhì)印跡技術(shù)實(shí)驗(yàn)對(duì)RRBP1表達(dá)干涉效率進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染靶向RRBP1的siRNA 24 h后，肝癌細(xì)胞HLF中的RRBP1表達(dá)在mRNA(t=17.012，P<0.001)與蛋白水平中均明顯降低，表明所構(gòu)建RRBP1表達(dá)下調(diào)肝癌模型可滿足后續(xù)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)的要求(圖3)。

圖3 轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)RRBP1表達(dá)的干涉效率鑒定

用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)分析了RRBP1在肝癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中的調(diào)控作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與siCtrl組相比，siRRBP1組肝癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移距離變短(t=6.216，P=0.003)，表明下調(diào)RRBP1抑制了肝癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力(圖4)。

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)分析下調(diào)RRBP1對(duì)肝癌HLF細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響

與劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)，與siCtrl組相比，siRRBP1組的肝癌細(xì)胞由小室上側(cè)遷移至小室下側(cè)的細(xì)胞數(shù)目變少(t=8.674，P<0.001)，進(jìn)一步表明下調(diào)RRBP1抑制了肝癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移能力(圖5)。

圖5 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)分析下調(diào)RRBP1對(duì)肝癌HLF細(xì)胞遷移能力的影響

2.3 下調(diào)RRBP1表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響

利用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分析了下調(diào)RRBP1對(duì)肝癌細(xì)胞HLF侵襲能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與siCtrl組相比，siRRBP1組肝癌細(xì)胞由基質(zhì)膠一側(cè)侵襲至另一側(cè)的細(xì)胞數(shù)變少(t=4.426，P=0.012)，表明下調(diào)RRBP1同樣抑制了肝癌細(xì)胞的侵襲能力(圖6)。

圖6 下調(diào)RRBP1對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響

2.4 下調(diào)RRBP1表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的影響

EMT是腫瘤細(xì)胞獲得遷移侵襲能力的重要機(jī)制，為分析RRBP1是否參與肝癌細(xì)胞的EMT，本研究用RT-PCR與蛋白質(zhì)印跡技術(shù)實(shí)驗(yàn)分析了干涉RRBP1對(duì)EMT標(biāo)志分子表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干涉RRBP1表達(dá)上調(diào)了上皮標(biāo)志E-cadherin(t=9.733，P=0.001)與ZO -1(t=24.380，P<0.001)的mRNA與蛋白表達(dá)，下調(diào)了間質(zhì)標(biāo)志N-cadherin(t=14.643，P<0.001)與Vimentin(t=12.368，P<0.001)的mRNA與蛋白表達(dá)，表明下調(diào)RRBP1抑制了肝癌細(xì)胞由上皮向間質(zhì)的轉(zhuǎn)化(圖7)。

圖7 干涉RRBP1對(duì)肝癌細(xì)胞EMT標(biāo)志分子表達(dá)的影響

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控物質(zhì)運(yùn)輸、生化反應(yīng)與蛋白質(zhì)合成等生物學(xué)過(guò)程的細(xì)胞器[1]。大量研究[7]表明，壓力環(huán)境導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的蛋白質(zhì)非折疊反應(yīng)在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。RRBP1是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)非蛋白折疊反應(yīng)的重要蛋白之一，可能在促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展中發(fā)揮作用，但目前RRBP1在肝癌中表達(dá)與生物學(xué)作用，尤其是其在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用尚不清楚。本研究利用生物信息學(xué)分析與免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RRBP1在肝癌組織中表達(dá)高于正常肝組織。尤為重要的是，RRBP1表達(dá)在發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝癌組織中高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝癌組織，表明RRBP1與肝癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。與本研究所得結(jié)果類似，既往在膀胱癌中的研究[8-9]同樣發(fā)現(xiàn)，與正常膀胱組織相比，膀胱癌組織中RRBP1 表達(dá)上調(diào)。該研究還發(fā)現(xiàn)，RRBP1表達(dá)水平與膀胱癌患者是否發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。此外，宮頸癌[10]、前列腺癌[11]與食道癌[12]中的研究也均表明，RRBP1表達(dá)上調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤致死的最主要原因[13]，本研究中發(fā)現(xiàn)，RRBP1在肝癌轉(zhuǎn)移灶組織中表達(dá)高于原發(fā)灶，提示其可能在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。因此，分別用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)分析了RRBP1在肝癌運(yùn)動(dòng)、遷移與侵襲中的調(diào)控作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下調(diào)RRBP1抑制了肝癌的運(yùn)動(dòng)、遷移與侵襲，表明RRBP1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了肝癌的轉(zhuǎn)移。在膀胱癌的研究[8]中發(fā)現(xiàn)，下調(diào)RRBP1可抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移與侵襲。子宮內(nèi)膜癌的研究[14]也證實(shí)，RRBP1高表達(dá)與腫瘤在肌層浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中均呈正相關(guān)。在肝癌的研究[15]中發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者的高血糖可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，而RRBP1表達(dá)上調(diào)是高血糖誘導(dǎo)肝癌生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制，進(jìn)一步說(shuō)明RRBP1在促進(jìn)肝癌進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用。EMT是腫瘤細(xì)胞獲得遷移侵襲能力的重要機(jī)制[16-17]，但目前各種類型腫瘤中RRBP1表達(dá)上調(diào)是否參與EMT過(guò)程尚不清楚。在肝癌研究中[15]發(fā)現(xiàn)，干涉RRBP1后肝癌上皮標(biāo)志分子E-cadherin與ZO-1表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志N-cadherin與Vimentin表達(dá)下調(diào)，表明下調(diào)RRBP1抑制了肝癌細(xì)胞由上皮樣向間質(zhì)樣的轉(zhuǎn)化，提示RRBP1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲可能是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT。

綜上所述，RRBP1在轉(zhuǎn)移性肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)了細(xì)胞的遷移與侵襲，提示RRBP1是潛在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的分子靶標(biāo)。