茶樹CsMGTs基因的克隆及其鎂轉(zhuǎn)運(yùn)功能分析

唐磊，肖羅丹，黃伊凡，肖斌，龔春梅

茶樹基因的克隆及其鎂轉(zhuǎn)運(yùn)功能分析

唐磊，肖羅丹，黃伊凡，肖斌，龔春梅*

西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100

鎂離子（Mg2+）作為葉綠素的中心成分，是植物細(xì)胞中含量最豐富的二價(jià)陽離子，也是多種酶的激活劑，特別是茶氨酸合成酶的活性依賴Mg2+，常被作為茶樹專用肥的特征成分，因此對(duì)茶樹的生長發(fā)育和茶葉的品質(zhì)形成至關(guān)重要。MRS2/MGT家族鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在維持植物體內(nèi)Mg2+的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)、胞內(nèi)平衡和耐逆性等方面起著重要的作用。為探究茶樹MRS2/MGT家族鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的功能，以茶樹品種陜茶1號(hào)為材料，克隆了4條鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，分別命名為、、和。生物信息學(xué)分析表明，這4個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在C末端均含有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和1個(gè)保守的GMN三肽基序；系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，屬于Clade C成員，而、和屬于Clade B成員，所編碼蛋白與木本植物柑橘M(fèi)GT家族的親緣關(guān)系最近。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析表明，、、和在茶樹的根、莖、葉、花中呈組成型表達(dá)，且根和葉對(duì)Mg2+濃度均表現(xiàn)出不同程度的響應(yīng)。鼠傷寒沙門氏菌鎂轉(zhuǎn)運(yùn)缺失突變株MM281功能互補(bǔ)試驗(yàn)表明，CsMGT1和CsMGT2均具有Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)功能，且CsMGT1的Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)功能優(yōu)于CsMGT2，而CsMGT2.1和CsMGT3幾乎沒有鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能。本研究結(jié)果豐富了茶樹CsMGTs家族的生物學(xué)功能，為進(jìn)一步闡明茶樹通過鎂轉(zhuǎn)運(yùn)功能機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)鎂離子的利用奠定了前期研究基礎(chǔ)。

茶樹；MRS2/MGT；基因克??；表達(dá)模式；功能分析

鎂離子（Mg2+）是一種重要的營養(yǎng)元素，對(duì)植物生長發(fā)育和生殖具有重要影響[1]。Mg2+對(duì)于核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞壁等大分子的構(gòu)象穩(wěn)定至關(guān)重要；作為植物體內(nèi)多種酶的激活劑或輔因子，維持H+-ATP酶、激酶和聚合酶等酶活性[2]；Mg2+還是葉綠素分子的中心組分，可促進(jìn)光合作用的碳同化，參與類囊體膜垛疊形成基粒，調(diào)節(jié)葉綠體不同光系統(tǒng)之間激發(fā)能的分配，穩(wěn)定葉綠體結(jié)構(gòu)[1]。Mg2+還參與跨膜電子梯度的建立，作為細(xì)胞中陰陽離子平衡的調(diào)節(jié)因子，與K+一起作為滲透活性離子調(diào)節(jié)細(xì)胞膨壓[2]。此外，Mg2+在植物抗病[3]、耐重金屬脅迫[4-5]和提高作物產(chǎn)量及品質(zhì)[6-8]中發(fā)揮作用。

CorA蛋白是研究最廣泛的Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，其家族成員廣泛分布于細(xì)菌、真菌、動(dòng)物和植物中，平衡著細(xì)胞內(nèi)Mg2+的流入和流出[9]。在細(xì)菌中的研究結(jié)果表明，編碼一種漏斗狀的同源五聚體蛋白結(jié)構(gòu)，其N端具有一個(gè)酸性周質(zhì)結(jié)構(gòu)域，C端擁有兩個(gè)跨膜區(qū)[10-12]。植物中已鑒定出質(zhì)子依賴型Mg2+/H+交換體和CorA類Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)體（MRS2/MGT）兩類鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[11,13]。MRS2/MGT鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族已在擬南芥[11]、水稻[14]、玉米[15]、油菜[16]、梨[17]、柑橘[18]等植物中被鑒定；在橡膠樹[19]和鐵皮石斛[20]中也鑒定出MRS2/MGT鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的存在。在擬南芥中，參與了根系對(duì)Mg2+的吸收，并提高了植物對(duì)鋁的耐受性[11,21-22]；、和參與了Mg2+的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，并且提高了擬南芥在低鎂和高鎂環(huán)境下的耐受性[9,23-24]；、和對(duì)正常花粉的發(fā)育尤為重要，突變會(huì)引起花粉發(fā)育異?；驍∮齕25-27]；在響應(yīng)低鎂脅迫的同時(shí)，還參與擬南芥對(duì)高鈣環(huán)境的適應(yīng)[28-29]；而影響鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)、葉綠體發(fā)育、光合作用和葉脈黃化表型的發(fā)育[30-32]。此外，玉米和柑橘已被證明受缺鎂誘導(dǎo)，并具有低鎂或缺鎂耐受性[18,33]。

茶樹[（L.）O. Kuntze]是全世界重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，富含茶多酚、茶氨酸、咖啡堿、茶多糖等功能成分，經(jīng)常飲茶有利于人的身心健康。近年來，由于氣候、成土母質(zhì)及氮、磷、鉀化學(xué)肥料的大量施用等原因，我國部分茶園土壤存在著有效鎂含量缺乏的現(xiàn)象[34-37]，從而導(dǎo)致茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)下降[35,37-39]。研究表明，影響茶氨酸合成的茶氨酸合成酶對(duì)Mg2+濃度有依賴性，施鎂增加了茶葉中游離氨基酸和咖啡堿的含量，使酚氨比趨于合理[39-40]。在生產(chǎn)實(shí)踐中，常需要在茶樹專用肥中添加一定比例的鎂元素以滿足茶樹對(duì)鎂元素的需求[41-42]。為了適應(yīng)不同茶園土壤的Mg2+含量，茶樹可以通過MGT等鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié)體內(nèi)Mg2+濃度以維持其生長發(fā)育，并提高產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，探究茶樹MGT鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能對(duì)理解茶樹的鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)吸收機(jī)制具有重要意義。本研究利用RT-PCR技術(shù)從茶樹中克隆了4個(gè)鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，進(jìn)行了生物信息學(xué)分析及不同鎂離子處理下的表達(dá)模式分析，并在鼠傷寒沙門氏菌鎂轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷突變株MM281中驗(yàn)證了其鎂轉(zhuǎn)運(yùn)功能，為進(jìn)一步闡明茶樹通過鎂轉(zhuǎn)運(yùn)功能實(shí)現(xiàn)對(duì)鎂離子的利用奠定了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理方法

試驗(yàn)材料為長勢(shì)和質(zhì)量基本一致的兩年生陜茶1號(hào)扦插苗，用清水洗凈茶苗根部泥土，采用小西茂毅營養(yǎng)液[43]配方（含0.1?mmol?L-1Mg2+），將其水培于西北農(nóng)林科技大學(xué)人工氣候室內(nèi)，保持培養(yǎng)溫度25℃白天/20℃晚上，光周期12?h光照/12 h黑暗，空氣相對(duì)濕度(75±5)%。每周更換1次營養(yǎng)液，24?h連續(xù)通氣。待茶苗培養(yǎng)4個(gè)月后，選取長出大量白色幼根、長勢(shì)一致的茶苗，對(duì)其分別進(jìn)行0?mmol?L-1Mg2+（缺鎂）和2?mmol?L-1Mg2+（高鎂）處理，然后在處理后0、2、6、12、24、48?h分別收集茶樹的幼嫩白根和芽下一、二葉。另外，在西北農(nóng)林科技大學(xué)科研溫室進(jìn)行兩年生陜茶1號(hào)土培處理（保持自然光照和空氣相對(duì)濕度，控制夏季溫度不超過30℃，冬季溫度不低于5℃），采集春季新梢生長至一芽四、五葉茶苗的幼嫩白根，芽下第一、二葉對(duì)應(yīng)的嫩莖，芽下第二葉及秋季盛花期的全花分別作為根、莖、葉、花樣品。每個(gè)處理設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，所有樣品采集后立即液氮速凍，然后保存于–80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取和cDNA的合成

采用CTAB法提取茶樹樣品的總RNA，用NanoDrop 2000c（Thermo Scientific，美國）超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和質(zhì)量，RNA的完整性用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。按照5×All-In-One RT MasterMix試劑盒（ABM，加拿大）說明書進(jìn)行cDNA第一鏈合成，保存于–20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CsMGTs基因的克隆

參照已經(jīng)發(fā)表的云抗10號(hào)茶樹基因組[44]數(shù)據(jù)，使用在線軟件IDT（http://sg.idtdna.com/ calc/analyzer）設(shè)計(jì)基因特異性引物（表1）。以茶樹樣品cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94℃ 5?min；94℃ 30?s，55℃ 30?s，72℃ 90?s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7?min。采用Gel Extraction Kit（OMEGA，美國）純化試劑盒回收PCR產(chǎn)物，然后將其連接至pMD19-T載體上轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性單克隆送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析

通過ProtParam工具（https://web.expasy.org/protparam）計(jì)算CsMGTs的理論等電點(diǎn)（pI）、分子量（Mw）和總平均親水性（GRAVY）等特征；使用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale）預(yù)測(cè)CsMGTs蛋白的親/疏水性；跨膜結(jié)構(gòu)（TM）由TMHMM Server v. 2.0 （www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）預(yù)測(cè)；磷酸化位點(diǎn)采用NetPhos 3.1 Server（www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos）預(yù)測(cè)；采用Gene Structure Display Server 2.0工具（http://gsds.gao-lab.org/index.php）對(duì)基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估；保守基序通過MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）分析。根據(jù)WoLF PSORT程序（https://wolfpsort.hgc.jp）進(jìn)行CsMGTs的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。利用DNAMAN 7.0進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)；系統(tǒng)發(fā)育分析采用MEGA 7.0軟件的鄰接法（Neighbor-Joining tree）完成（Bootstrap檢驗(yàn)值為1?000）。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

1.6 鼠傷寒沙門氏菌鎂轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷突變株MM281功能互補(bǔ)分析

為了闡明CsMGT1、CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3的Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)活性，用帶有酶切位點(diǎn)的基因特異性引物（表2）擴(kuò)增目標(biāo)基因，然后使用NovoRec?Plus PCR（Novoprotein Scientific Inc，中國上海）試劑盒將其插入到經(jīng)過酶切的pTrc99A載體中，熱激轉(zhuǎn)化MM281感受態(tài)細(xì)胞，測(cè)序進(jìn)行陽性驗(yàn)證。以MM1927作為陽性對(duì)照，MM281和轉(zhuǎn)空pTrc99A載體的MM281作為陰性對(duì)照。功能互補(bǔ)試驗(yàn)參照Mao等[9]方法并稍作改進(jìn)。具體步驟為：取各菌液接種于含0.05?mmol?L-1IPTG和10?mmol?L-1MgSO4的LB培養(yǎng)基（含100?mg?L-1Amp，34?mg?L-1Chl），37℃振蕩培養(yǎng)至OD600=1.0，分別將其稀釋為1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4等4個(gè)濃度梯度，吸取3?μL不同濃度的菌液點(diǎn)于N-minimal固體平板（Mg2+濃度依次為：0.01、0.5、1、2、5、10?mmol?L-1），37℃恒溫培養(yǎng)2?d后觀察菌株生長情況并拍照。為了檢測(cè)各菌株在液體培養(yǎng)基中的生長率，將各菌株于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，然后6?000?r?min-1離心2?min，重懸后接種于不同Mg2+濃度（0.01、0.5、1、10?mmol?L-1）的液體培養(yǎng)基，調(diào)整初始OD600=0.001～0.002，37℃ 200?r?min-1振蕩培養(yǎng)，每3?h測(cè)定細(xì)菌OD600直至24?h，繪制生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹CsMGTs基因的克隆

以兩年生陜茶1號(hào)茶樹樣品的cDNA為模板，使用特異性引物（表1）進(jìn)行、、和的PCR擴(kuò)增，分別獲得長度為1?373、1?335、1?335、1?328?bp的條帶（圖1）；測(cè)序分析表明，、、和的序列與云抗10號(hào)茶樹基因組中的候選序列較為一致，其ORF長度分別為1?320、1?335、1?335?bp和1?269?bp，分別編碼439、444、444、422個(gè)氨基酸（表3）；將4條序列與舒茶早和龍井43基因組進(jìn)行比對(duì)（表3）并將其登錄至GenBank，登錄號(hào)分別為MN623276、MN623277、MN623278和MN623279。

表1 基因克隆及熒光定量PCR引物序列

表2 鼠傷寒沙門式菌MM281互補(bǔ)試驗(yàn)引物序列

注：下劃線部分表示酶切位點(diǎn)，GGATCC表示BamHI酶切位點(diǎn)，TCTAGA表示XbaI酶切位點(diǎn)

Note: The underlined parts represent the restriction sites, GGATCC and TCTAGA represent BamHI and XbaI restriction sites, respectively

注：M：D 2?000?bp Marker；1：CsMGT1；2：CsMGT2；3：CsMGT2.1；4：CsMGT3

2.2 編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

運(yùn)用ProtParam tool預(yù)測(cè)氨基酸組成與理化性質(zhì)的結(jié)果表明，CsMGT1、CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3的化學(xué)分子式分別為C2130H3401N589O683S26、C2245H3598N606O672S19、C2241H3565N601O672S18和C2107H3330N562O630S20，編碼蛋白的分子量分別為49.02、50.44、50.26、47.26?kDa，脂肪族氨基酸指數(shù)分別為86.83、99.66、96.60和97.70；理論等電點(diǎn)（pI）最大值為5.59，最小值為4.97，表明這4個(gè)蛋白質(zhì)均為酸性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)分別為43.15、60.21、56.95和40.29，表明其均為不穩(wěn)定蛋白（表3）。負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）的最大值為CsMGT1的66個(gè)，最小值為CsMGT3的51個(gè)；而正電荷殘基（Arg+Lys）的最大值為CsMGT2的55個(gè)，最小值為CsMGT1和CsMGT3的40個(gè)。

親疏水性分析的結(jié)果顯示，CsMGT1、CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3的總平均親水性分別為–0.331、–0.113、–0.096和–0.034（表3），表明其均為親水性蛋白，這與ProtScale的分析結(jié)果較為一致（圖2）。

蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CsMGT1含有45個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中21個(gè)蘇氨酸（T）位點(diǎn)，21個(gè)絲氨酸（S）位點(diǎn)和3個(gè)酪氨酸（Y）位點(diǎn)（圖3-A）；CsMGT2含有48個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中14個(gè)蘇氨酸（T）位點(diǎn)，30個(gè)絲氨酸（S）位點(diǎn)和4個(gè)酪氨酸（Y）位點(diǎn)（圖3-B）；CsMGT2.1和CsMGT3分別含有56個(gè)和41個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中蘇氨酸（T）位點(diǎn)分別有17個(gè)和8個(gè)，絲氨酸（S）位點(diǎn)分別有34個(gè)和29個(gè)，酪氨酸（Y）位點(diǎn)分別有5個(gè)和4個(gè)（圖3-C和圖3-D）。

表3 CsMGT基因及其預(yù)測(cè)蛋白的基本信息

注：基因組編號(hào)中標(biāo)注菱形的來源于龍井43基因組[45]，三角形來源于舒茶早基因組[46]，其余來自云抗10號(hào)基因組[44]。Nucl：細(xì)胞核；Vacu：液泡；Golg：高爾基體；Plas：質(zhì)膜

Note: Unigene IDs marked with diamonds are from the ‘Longjing 43’ genome[45], the triangles are from the ’Shuchazao’ genome[46], and others are from the ’Yunkang 10’ genome[44]. Nucl: nucleus; Vacu: vacuole; Golg: golgi apparatus. Plas: plasma membrane

圖2 茶樹CsMGTs的親/疏水性分析

另外，跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)CsMGT1、CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3在C端均含兩個(gè)保守的跨膜結(jié)構(gòu)域。WoLF PSORT的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明CsMGT1可能定位于細(xì)胞核、液泡和（或）高爾基體，而CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3均定位于質(zhì)膜（表3）。

2.3 基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

使用GSDS工具進(jìn)行的基因結(jié)構(gòu)分析表明，和均含有5個(gè)長度不同的內(nèi)含子，而和均只有4個(gè)內(nèi)含子（圖4-A）。為了研究4個(gè)CsMGT蛋白的保守基序，使用MEME工具完成了10個(gè)Motif的預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，在所有的CsMGTs中均發(fā)現(xiàn)了Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4和Motif 5，Motif 6和Motif 8只存在于CsMGT2和CsMGT2.1中，Motif 10只在CsMGT1和CsMGT3中預(yù)測(cè)到，而Motif 7和Motif 9特異性存在于CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3中（圖4-B和表4）。

2.4 氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析

為探究茶樹CsMGT1、CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3與擬南芥、水稻和柑橘的MRS2/MGT家族的進(jìn)化關(guān)系，選取它們的氨基酸序列并使用MEGA 7.0的鄰接法進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，CsMGT1與柑橘PtrMGT4的親緣關(guān)系最近，與水稻OsMRS2-2、OsMRS2-3及OsMRS2-8同屬于Clade C成員；CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3均屬于Clade B成員，CsMGT2和CsMGT2.1聚在一起，它們與PtrMGT1的親緣關(guān)系最近，其次為AtMGT1、AtMGT2、OsMRS2-1及OsMRS2-9，而CsMGT3與PtrMGT2的親緣關(guān)系最近，其次為AtMGT3（圖5）。這些結(jié)果表明茶樹CsMGT1、CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3與木本植物的MRS2/MGT成員具有較近的親緣關(guān)系。另外，擬南芥、水稻和柑橘的MRS2/MGT家族蛋白均分布于5個(gè)分支中，這表明MRS2/MGT家族成員在單子葉植物和雙子葉植物分開之前就已經(jīng)存在。

選取擬南芥、水稻和柑橘等親緣關(guān)系較近的MRS2/MGT成員的氨基酸序列與茶樹CsMGT1、CsMGT2、CsMGT3和CsMGT4進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們的相似性為56.96%，特別是在C末端均含有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，在第一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)末尾均含有MRS2/MGT家族保守的GMN三肽基序（圖6）。

圖3 茶樹CsMGTs的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

表4 茶樹CsMGTs的蛋白保守序列

注：Cs：茶樹；At：擬南芥；Os：水稻；Ptr：柑橘；A、B、C、D和E表示MRS2/MGT家族的5個(gè)分支

2.5 茶樹CsMGTs基因的表達(dá)模式分析

2.5.1 組織表達(dá)模式

組織特異性表達(dá)分析表明，茶樹、、和在根、莖、葉和花中均呈組成型表達(dá)。和均在莖中表達(dá)量最高，在花中表達(dá)量最低（圖7-A，C）；而和均在根中表達(dá)量最高，其次為莖和葉，在花中表達(dá)量最低（圖7-B，D）。

2.5.2 不同濃度Mg2+處理下的表達(dá)分析

通過熒光定量PCR，分析了在0?mmol?L-1Mg2+（缺鎂）和2?mmol?L-1Mg2+（高鎂）處理下陜茶1號(hào)根和葉中、、和的表達(dá)情況（圖8和圖9）。結(jié)果表明，4個(gè)基因在根和葉中均響應(yīng)不同濃度的Mg2+處理，但其表達(dá)量在不同處理時(shí)間下存在差異。在缺鎂處理的根中，先上調(diào)后下調(diào)，在6?h急劇上升達(dá)到最大值，是0?h的4.51倍（圖8-A）；和則表現(xiàn)為波動(dòng)的變化趨勢(shì)，在2?h和24?h上調(diào)表達(dá)，而在6?h和24?h上調(diào)，在12?h和48?h下調(diào)（圖8-B，C）；在2?h達(dá)到峰值，是0?h的2.30倍（圖8-D）。在高鎂處理的根中，在2?h和48?h上調(diào)表達(dá)且達(dá)到峰值，分別是0?h的3.69倍和2.77倍（圖8-A）；呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)再下調(diào)的趨勢(shì)，在24?h表達(dá)量最高（圖8-B）；和則總體表現(xiàn)為波動(dòng)的變化趨勢(shì)，分別在6?h和2?h達(dá)到最大值（圖8-C，D）。在缺鎂處理的葉中，、和呈下調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)（圖9-A，C，D），而呈先下調(diào)后上調(diào)再下調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)，在24?h達(dá)到峰值，是0?h的1.23倍（圖9-B）。在高鎂處理的葉中，和先下調(diào)后上調(diào)（圖9-A和9-D），而和呈現(xiàn)先下調(diào)再恢復(fù)到0?h水平的趨勢(shì)（圖9-B和9-C）。

注：藍(lán)色直線區(qū)域代表跨膜區(qū)，紅色方框區(qū)域代表保守的GMN基序

注：不同小寫字母表示差異顯著，P<0.05

2.6 茶樹CsMGTs基因的MM281功能互補(bǔ)分析

鼠傷寒沙門氏菌突變體MM281因缺乏鎂轉(zhuǎn)運(yùn)基因、和而沒有Mg2+的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)能力，通常被用作Mg2+功能互補(bǔ)分析系統(tǒng)[11,17,26-27,47]。為了確定CsMGT1、CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3的Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)能力，我們將其分別構(gòu)建到pTrc99A載體上并轉(zhuǎn)入MM281中進(jìn)行功能互補(bǔ)分析。結(jié)果表明，在10?mmol?L-1Mg2+培養(yǎng)基中，所有菌株均能正常生長。陰性對(duì)照MM281和轉(zhuǎn)pTrc99A空載體的MM281在5?mmol?L-1Mg2+培養(yǎng)基中生長不良，而陽性對(duì)照MM1927在0.01?mmol?L-1Mg2+培養(yǎng)基中仍能生長正常。向MM281中轉(zhuǎn)入后，突變株也能在0.01?mmol?L-1Mg2+的培養(yǎng)基中生長，但其生長能力明顯差于MM1927；而轉(zhuǎn)的MM281最低只能在1?mmol?L-1Mg2+的培養(yǎng)基上生長。另外，CsMGT2.1和CsMGT3的互補(bǔ)分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)和的MM281的生長趨勢(shì)比較一致，其生長能力均弱于轉(zhuǎn)的MM281，和陰性對(duì)照類似（圖10）。由此可見，CsMGT1的鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力最強(qiáng)，其次為CsMGT2，而CsMGT2.1和CsMGT3的鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力極弱，幾乎沒有互補(bǔ)功能。

為了進(jìn)一步確認(rèn)CsMGT1、CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3的互補(bǔ)能力，本研究檢測(cè)了7個(gè)菌株在0.01、0.5、1、10?mmol?L-1Mg2+的液體培養(yǎng)基中24?h內(nèi)的生長曲線，結(jié)果與平板試驗(yàn)一致（圖11）。

3 討論

植物MRS2/MGT蛋白具有高度保守的序列結(jié)構(gòu)和進(jìn)化保守性?？缒^(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CsMGT1、CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3在C末端均含兩個(gè)保守的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，這與擬南芥[11, 48]，水稻[14]，梨[17]，甘蔗[49]，油菜[16]等植物的MRS2/MGT家族成員的研究結(jié)果一致。此外，這4個(gè)CsMGT蛋白均具有高度保守的GMN基序，這與擬南芥[11]、柑橘[18]的MRS2/MGT成員一致。系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果表明，MRS2/MGT家族成員被分為Clade A-E共5個(gè)分支，CsMGT1屬于Clade C成員，而CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3屬于CladeB成員。同時(shí)，Blast分析表明CsMGT2和CsMGT2.1與AtMGT2的相似度高于AtMGT1，因此將其分別命名為CsMGT2和CsMGT2.1，由此證明CsMGT2和CsMGT2.1為并系同源序列。在Clade C中，CsMGT1由于在茶樹對(duì)Al3+的響應(yīng)方面[50]可能與水稻OsMRS2-2/OsMGT1對(duì)鋁的耐受性[51]相同而得名。這些結(jié)果表明，CsMGT1、CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3屬于茶樹MGT鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)家族成員，與擬南芥、水稻、柑橘M(fèi)RS2/MGT家族成員表現(xiàn)出高度的進(jìn)化保守性，可能行使茶樹體內(nèi)的Mg2+運(yùn)輸功能。

注：–Mg：0?mmol?L-1 Mg2+處理；+Mg：2?mmol?L-1 Mg2+處理。不同小寫字母表示處理間差異顯著，P<0.05。下同

圖9 Mg2+處理下茶樹CsMGTs在葉中的表達(dá)分析

注：每排菌株從左到右依次稀釋10倍

圖11 CsMGTs在液體培養(yǎng)基上的MM281功能互補(bǔ)分析

已有的研究表明，植物基因具有明顯的組織表達(dá)模式。水稻、柑橘和幾乎所有的擬南芥基因（除外）在研究的組織中均呈組成型表達(dá)[11,14,18]。然而，玉米在根中特異表達(dá)，而Clade C成員和在被檢測(cè)的組織[15]中均未表達(dá)，這說明基因是否呈組成型表達(dá)在不同物種中存在差異。在柑橘中，與親緣關(guān)系最近的在根中表達(dá)量最高，其次為莖，在果實(shí)中表達(dá)量最低；與和同源的在莖和葉中表達(dá)量最高，在花中表達(dá)量最低；而與親緣關(guān)系最近的在根和葉中表達(dá)量最高，在花和果實(shí)中表達(dá)量最低[18]。本研究結(jié)果顯示、、和也呈組成型表達(dá)，它們均在花中表達(dá)量最低，在莖或根中表達(dá)量最高。研究表明茶樹、、和在生長發(fā)育過程中起著不同的作用，同一個(gè)基因在不同物種的生長發(fā)育過程中也可能行使不同的功能，相似的研究結(jié)果在甘蔗[49]和油菜[16]等植物中也被證明。

成員在植物中還參與了對(duì)環(huán)境中Mg2+的響應(yīng)。玉米Clade B成員在缺鎂12?h的新梢中被顯著誘導(dǎo)，而Clade C成員和在缺鎂6?h和24?h的根中上調(diào)表達(dá)[15]。在柑橘中，Clade B成員在缺鎂處理24?h的根中呈上調(diào)表達(dá)而在葉中無顯著變化，而在缺鎂處理的根和葉中均無明顯變化；Clade C成員在缺鎂處理的根中持續(xù)上調(diào)表達(dá)，而在葉中無顯著改變[18]。在缺鎂條件下，水稻在葉片和葉鞘中顯著上調(diào)表達(dá)，在缺鎂的5～7?d其表達(dá)量在新梢中急劇升高，顯著高于0～4?d處理，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其增強(qiáng)了水稻的缺鎂耐受性[52]。本研究中，在缺鎂處理的6?h根中顯著上調(diào)，在葉中則呈下調(diào)表達(dá)；而在高鎂處理2?h的根中急劇上調(diào)，在葉中先下調(diào)后上調(diào)。和在缺鎂處理和高鎂處理的根中波動(dòng)變化，在缺鎂處理的葉中下調(diào)，而在高鎂處理的葉中和呈現(xiàn)先下調(diào)再恢復(fù)到初始水平的趨勢(shì)。隨著處理時(shí)間延長在缺鎂處理的根中先上調(diào)后恢復(fù)到0?h水平，在高鎂處理的根和葉中總體呈波動(dòng)趨勢(shì)，而在缺鎂處理的葉中呈下調(diào)的趨勢(shì)（圖8和圖9）。這些結(jié)果表明，、、和響應(yīng)環(huán)境Mg2+脅迫，可能在茶樹中行使Mg2+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)功能。

通過鎂轉(zhuǎn)運(yùn)功能缺失的鼠傷寒沙門氏菌突變體MM281互補(bǔ)分析也證明了MRS2/MGT的Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)功能。在擬南芥中，MM281互補(bǔ)試驗(yàn)表明AtMGT1和AtMGT10為高親和蛋白[11,53]，AtMGT6、AtMGT7和AtMGT9為低親和蛋白[9,27,47]，而AtMGT5為雙功能蛋白[26]。在玉米中，Clade B成員ZmMGT1和Clade C成員ZmMGT8均顯示明顯的MM281功能互補(bǔ)，均能在0.1?mmol?L-1Mg2+的培養(yǎng)基上生長，但ZmMGT1的互補(bǔ)功能明顯優(yōu)于ZmMGT8，表明它們擁有Mg2+的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)功能[15]，這與梨[17]、甘蔗[49]和油菜[16]的試驗(yàn)結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明，CsMGT1的MM281互補(bǔ)能力高于CsMGT2，且轉(zhuǎn)的MM281能在0.01?mmol?L-1Mg2+的培養(yǎng)基中生長，而CsMGT2.1和CsMGT3的鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力極弱，幾乎不能互補(bǔ)MM281的鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能，這表明CsMGT1可能是茶樹中的高親和Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，而CsMGT2是低親和Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

玉米、和柑橘、在鋁脅迫的根中均不同程度的上調(diào)表達(dá)，而則呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)[15,18]。在擬南芥中，過表達(dá)本氏煙草后提高了植株的耐鋁性[21]。水稻根中也受鋁脅迫和NaCl脅迫的誘導(dǎo)，并提高了水稻的耐鋁性和耐鹽性[51,54]。這些結(jié)果表明植物基因不僅響應(yīng)環(huán)境Mg2+水平，也受鋁離子和NaCl脅迫因子的誘導(dǎo)，會(huì)增強(qiáng)植物的耐逆性。本研究初步解析了茶樹MRS2/MGT家族、、和的組織表達(dá)模式和對(duì)Mg2+的響應(yīng)情況，明確了其在MM281中的Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)能力，為闡明茶樹基因響應(yīng)環(huán)境中Mg2+營養(yǎng)水平進(jìn)而通過鎂轉(zhuǎn)運(yùn)功能實(shí)現(xiàn)對(duì)Mg2+的利用奠定了前期基礎(chǔ)。另外，茶樹CsMGT1、CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3是否像其他植物一樣能夠增強(qiáng)植物的耐鋁性和耐鹽性，仍需深入研究。

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Cloning and Magnesium Transport Function Analysis ofGenes in Tea Plants ()

TANG Lei, XIAO Luodan, HUANG Yifan, XIAO Bin, GONG Chunmei*

College of Horticulture, Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, China

Magnesium (Mg2+), as the central atom of chlorophyll, is the most abundant divalent cation in plant cells. Magnesium is also an activator of various enzymes, especially theanine synthase, whose activity depends on Mg2+concentration and is often used as a characteristic component of special fertilizer for tea plants. Therefore, it is very important for both the growth and development of tea plants and the formation of tea quality. The MRS2/MGT magnesium transporter family plays an important role in maintaining the absorption and transport of Mg2+, intracellular balance and stress tolerance in plants. In order to explore the functions of themagnesium transport genes in tea plants, this study cloned fourmagnesium transporter genes (namely,,and, respectively) from tea cultivar ‘Shaancha 1’. Bioinformatics analysis shows that the four proteins all contain two transmembrane domains and a conserved GMN tripeptide motif at the C-terminal. Phylogenetic analysis shows that CsMGT1 is a member of Clade C, while CsMGT2, CsMGT2.1 and CsMGT3 belong to Clade B, and the four encoded proteins are most closely related to the woodyMGT family. Real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) shows that,,andwere constitutively expressed in the roots, stems, leaves and flowers of tea plants, and the roots and leaves all showed different degrees of response to Mg2+. Functional complementation tests in a magnesium deletion mutant strain MM281 ofshow that both CsMGT1 and CsMGT2 possessed Mg2+transport function, and the Mg2+transport function of CsMGT1 was superior to that of CsMGT2, while CsMGT2.1 and CsMGT3 had almost no Mg2+transport function. The results of this study enriched the biological functions of tea plant CsMGTs family, and laid a foundation for further utilization of magnesium through magnesium transporters in tea plants.

tea plant, MRS2/MGT, gene cloning, expression pattern, function analysis

S571.1；Q946.91+2

A

1000-369X(2021)06-761-16

2020-12-07

2021-05-05

陜西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2020NY-190）

唐磊，男，博士研究生，主要從事茶樹生理與分子生物學(xué)研究，1938170872@qq.com。*通信作者：gcm228@nwafu.edu.cn

（責(zé)任編輯：趙鋒）