茶黃素-3,3'-O-雙沒(méi)食子酸酯對(duì)糖尿病大鼠血管內(nèi)皮損傷及炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用

鄧志慧，曾潔，付紅娟，?；?/p>

茶黃素-3,3'--雙沒(méi)食子酸酯對(duì)糖尿病大鼠血管內(nèi)皮損傷及炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用

鄧志慧，曾潔，付紅娟，常徽*

西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715

探討茶黃素-3,3'--雙沒(méi)食子酸酯（TFDG）對(duì)糖尿病大鼠血管內(nèi)皮損傷及炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。以高脂飼料喂養(yǎng)加鏈脲佐菌素注射制造糖尿病大鼠，將其分為模型組（CON）、5?mg·kg-1和10?mg·kg-1TFDG干預(yù)組（TFDG5和TFDG10），另取正常大鼠為對(duì)照組（NC），分組處理8周，監(jiān)測(cè)體重和空腹血糖變化，觀察大鼠腹主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)變化，ELISA檢測(cè)血漿IL-6、IL-1和TNF-水平，Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，與CON組相比，TFDG干預(yù)對(duì)體重和血糖無(wú)顯著影響，病理切片觀察顯示TFDG干預(yù)組大鼠腹主動(dòng)脈組織損傷較CON組有所改善，同時(shí)TFDG干預(yù)組大鼠血漿炎癥因子水平顯著降低，血漿NO水平顯著升高，腹主動(dòng)脈組織MDA水平降低。進(jìn)一步研究顯示，TFDG下調(diào)了糖尿病大鼠腹主動(dòng)脈組織NLRP3、caspase-1和IL-1的表達(dá)，抑制NLRP3炎癥通路激活。TFDG能夠有效保護(hù)糖尿病大鼠血管內(nèi)皮損傷并抑制炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)NLRP3炎癥通路實(shí)現(xiàn)的。

茶黃素；糖尿??；血管內(nèi)皮損傷；炎癥反應(yīng)

糖尿病是危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)疾病，隨著居民生活水平的提高，國(guó)民飲食結(jié)構(gòu)逐漸向“高糖、高脂、高能量”轉(zhuǎn)變，同時(shí)機(jī)械化和自動(dòng)化的普及，體力勞動(dòng)減少，人們的活動(dòng)量大大降低，由此導(dǎo)致超重、肥胖人群不斷擴(kuò)大，而與之密切相關(guān)的疾病包括糖尿病，其發(fā)病率和發(fā)病人數(shù)不斷上升。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)已成為全球糖尿病第一大國(guó)，成人糖尿病患病率為12.8%，成人糖尿病前期比例為35.2%，糖尿病患者總?cè)藬?shù)估計(jì)為1.298億，居世界首位[1]。糖尿病并發(fā)癥可累及人體眼、腎、神經(jīng)、血管等多種器官，導(dǎo)致其功能不全甚至衰竭[2]，其中2型糖尿病多伴有心血管并發(fā)癥，嚴(yán)重影響病人的治療及預(yù)后。眾所周知，高血糖會(huì)誘發(fā)血管病變，目前心血管病死亡率居我國(guó)居民疾病總死亡原因首位，如何有效減輕高血糖對(duì)血管組織造成的損害是重要的研究課題。

紅茶是國(guó)際市場(chǎng)消費(fèi)的主要茶類(lèi)[3]。紅茶在發(fā)酵制作過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生特征性成分茶黃素（Theaflavin，TF），其含量約占干重的0.3%～1.5%[4]，目前已從紅茶中分離鑒定出20多種TF類(lèi)化合物（TFs），其中主要有茶黃素（TF1）、茶黃素-3--沒(méi)食子酸酯（Theaflavin-3--gallate，TF2A）、茶黃素-3'--沒(méi)食子酸酯（Theaflavin-3'--gallate，TF2B）以及茶黃素-3,3'--雙沒(méi)食子酸酯（Theaflavin-3,3'--digallate，TFDG）等4種，約占總茶黃素的96%[5]。研究顯示，TFs不僅賦予紅茶獨(dú)特的感官品質(zhì)，更具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等生物活性功能[6-7]，其中尤以TFDG最為顯著。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，TF1可減輕H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。TFs對(duì)糖尿病誘發(fā)的血管損傷是否具有保護(hù)效應(yīng)，尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究構(gòu)建體內(nèi)和體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ停^察TFDG對(duì)糖尿病大鼠血管損傷和高糖條件下內(nèi)皮細(xì)胞損傷及炎癥反應(yīng)的影響，并探討相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

TFDG（純度98%）購(gòu)自南京草本源生物科技有限公司，用DMSO溶解–20℃避光分裝保存?zhèn)溆?。鏈脲佐菌素（STZ）、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自Sigma公司。一氧化氮（NO）和丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒、兔抗鼠單克隆抗體（一抗）NLRP3（含NLR家族Pyrin域蛋白3）、caspase-1（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶1）、IL-1（白細(xì)胞介素-1）、-actin（肌動(dòng)蛋白）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（二抗）、DAB顯色試劑盒、IL-6（白細(xì)胞介素-6）、IL-1和TNF-（腫瘤壞死因子-）ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所。一抗cleaved-caspase-1（裂解半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶1）和cleaved-IL-1（裂解白細(xì)胞介素-1）購(gòu)自Cell Signaling公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡雄性SPF級(jí)SD大鼠50只，體質(zhì)量160～200?g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK (京) 2019-0008]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和操作均遵照西南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理規(guī)范進(jìn)行，晝夜光照節(jié)律，自由飲水，水質(zhì)為Ⅲ級(jí)水，每周更換3次墊料，定期對(duì)籠具及水瓶進(jìn)行消毒。本研究所用SD大鼠已經(jīng)過(guò)西南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.3 動(dòng)物飼料

普通飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，具體配方：玉米淀粉、麥芽糖糊精、奶粉、玉米油、無(wú)水奶油、纖維素、酪蛋白、蛋氨酸、礦物質(zhì)混合物、維生素混合物。蛋白質(zhì)含量約22%，總脂肪含量約5%，水分含量約9%，粗纖維含量約2%。高糖高脂飼料：對(duì)普通飼料添加20%蔗糖和10%豬油。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 構(gòu)建糖尿病大鼠模型

50只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3?d后，隨機(jī)取10只作為正常對(duì)照組（NC），其余40只用于構(gòu)建實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停ǜ咛歉咧M）。NC組喂食普通飼料，高糖高脂組喂食高糖高脂飼料，喂食4周后，除NC組外給予STZ（40?mg·kg-1）腹腔注射，注射前夜禁食不禁水12?h以上，STZ以0.1?mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液配制成1% STZ溶液用于注射。注射后第三天和第五天檢測(cè)血糖，以兩次檢測(cè)隨機(jī)血糖值均>16.7?mmol·L-1或空腹血糖值均>11.1?mmol·L-1為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 動(dòng)物分組及處理

取30只造模成功的大鼠，隨機(jī)分為3組：模型組（CON）、5?mg·kg-1TFDG干預(yù)組（TFDG5）和10?mg·kg-1TFDG干預(yù)組（TFDG10），每組10只。NC組繼續(xù)喂食普通飼料，其余3組繼續(xù)喂食高糖高脂飼料，TFDG5組和TFDG10組分別按照5?mg·kg-1和10?mg·kg-1劑量灌胃TFDG溶液，NC組和CON組灌胃等量生理鹽水，分組處理8周后，處死大鼠，腹主動(dòng)脈取血，置于肝素抗凝管中，靜置2?h后，3?000?r·min-1離20?min，取血漿置–80℃冰箱備用。

1.2.3 體質(zhì)量和空腹血糖測(cè)定

大鼠體質(zhì)量和空腹血糖每周測(cè)定1次，測(cè)定前大鼠需禁食12?h，但不禁飲水。測(cè)定時(shí)間為10：00，先用電子秤稱量大鼠體質(zhì)量，然后在大鼠尾靜脈處穿刺取血，浸潤(rùn)血糖檢測(cè)試紙，以快速血糖儀測(cè)定空腹血糖值，大鼠測(cè)定完成后恢復(fù)自由飲食。

1.2.4 動(dòng)脈病理學(xué)觀察

剪取大鼠腹主動(dòng)脈組織，于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟脫水；Harris蘇木素染色，去離子水洗，分化液分化，伊紅染色，自來(lái)水沖洗浸泡；脫水、透明、風(fēng)干，中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察血管病理形態(tài)學(xué)變化。

1.2.5 大鼠血漿NO和炎癥因子水平測(cè)定

取各組大鼠血漿，嚴(yán)格依照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定NO含量和炎癥因子IL-6、IL-1和TNF-水平。

1.2.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

取腹主動(dòng)脈組織樣本，利用RIPA裂解液提取總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定；根據(jù)蛋白濃度，以12%分離膠、5%濃縮膠SDS-PAGE電泳，上樣量為20?μL。用半干性轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%的脫脂奶粉（TBST配制）封閉2?h。加入一抗NLRP3、caspase-1、cleaved-caspase-1、IL-1、cleaved-IL-1和-actin（均1∶1?000稀釋），4℃孵育過(guò)夜，TBST振搖洗膜3次，每次10?min，然后加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗（1∶2?000），室溫振蕩孵育1?h，再以TBST振搖洗膜3次后，DAB顯色，采用VILBER FUSION FX7成像系統(tǒng)自動(dòng)曝光。利用Quantity One軟件進(jìn)行條帶分析。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 TFDG膳食干預(yù)對(duì)糖尿病大鼠體重和血糖的影響

對(duì)大鼠體重的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)（表1和表2）表明，造模前高糖高脂組大鼠體重高于NC組，但兩組間未出現(xiàn)顯著性差異；造模后，CON、TFDG5和TFDG10組糖尿病大鼠體重均出現(xiàn)逐漸下降狀況，且分別在造模后第四、第四和第六周顯著低于NC組。大鼠空腹血糖濃度監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明，造模前高糖高脂組大鼠空腹血糖濃度與NC組相比無(wú)顯著性差異，造模后CON、TFDG5和TFDG10組糖尿病大鼠血糖濃度顯著升高，顯著高于NC組；TFDG5和TFDG10組血糖略低于CON組，但3組間無(wú)顯著性差異。

表1 造模前大鼠體重和空腹血糖濃度變化

表2 造模后各組大鼠體重和空腹血糖濃度變化

注：*＜0.05，與NC組比較；**＜0.01，與NC組比較

Note: *＜0.05, compared with NC group. **＜0.01, compared with NC group

2.2 TFDG膳食干預(yù)對(duì)糖尿病大鼠腹主動(dòng)脈形態(tài)的影響

圖1中腹主動(dòng)脈組織切片HE染色結(jié)果顯示，NC組大鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑平坦，內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊，無(wú)斷裂；CON組大鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)膜不平整，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹脫落，且有炎性細(xì)胞附著，排列紊亂，血管平滑肌肥大，中膜厚度增加；與CON組比較，TFDG5和TFDG10組大鼠腹主動(dòng)脈病理?yè)p傷程度有所改善。

2.3 TFDG對(duì)糖尿病大鼠血漿炎癥因子水平的影響

圖2中炎癥因子水平檢測(cè)結(jié)果顯示，相比于NC組，CON組大鼠血漿中IL-6、IL-1和TNF-水平均顯著升高；與CON組相比，TFDG5和TFDG10組大鼠血漿中IL-6、IL-1和TNF-水平均顯著降低，表明TFDG膳食干預(yù)可有效降低糖尿病大鼠炎癥反應(yīng)。

2.4 TFDG對(duì)糖尿病大鼠血漿NO和腹主動(dòng)脈組織MDA的影響

血漿NO水平檢測(cè)結(jié)果顯示（圖3-A），與NC組相比，CON組糖尿病大鼠血漿中NO的水平顯著降低；相較于CON組，TFDG5和TFDG10組大鼠血漿中NO的水平顯著提高。腹主動(dòng)脈組織MDA水平檢測(cè)結(jié)果顯示，CON組大鼠腹主動(dòng)脈組織中過(guò)氧化產(chǎn)物MDA水平較高，TFDG干預(yù)組MDA水平顯著降低（圖3-B）。

2.5 TFDG對(duì)糖尿病大鼠腹主動(dòng)脈組織NLRP3炎癥通路的影響

Western blot檢測(cè)大鼠腹主動(dòng)脈組織NLRP3炎癥通路蛋白的表達(dá)情況，如圖4所示，CON組糖尿病大鼠NLRP3的表達(dá)水平較NC組顯著升高，且Cleaved caspase-1、Pro-caspase-1、Cleaved IL-1和IL-1的表達(dá)均顯著增高；與CON組相比，TFDG5和TFDG10組大鼠NLRP3的表達(dá)水平顯著降低，且Cleaved caspase-1、Cleaved IL-1和IL-1的水平均顯著下降，表明TFDG膳食干預(yù)可有效抑制糖尿病大鼠腹主動(dòng)脈組織NLRP3/IL-1炎癥通路的激活。

圖1 各組大鼠腹主動(dòng)脈切片形態(tài)學(xué)觀察（HE染色，×400）

注：*P<0.05，**P<0.01，與NC組比較；#P<0.05，##P<0.01，與CON組比較

注：*P<0.05，**P<0.01，與NC組比較；#P<0.05，##P<0.01，與CON組比較

注：*P<0.05，**P<0.01，與NC組比較；#P<0.05，##P<0.01，與CON組比較

3 討論

2型糖尿病是以糖代謝紊亂為主要臨床表現(xiàn)的代謝綜合征，其發(fā)病人數(shù)約占全球人口的8.5%[8]。2型糖尿病患者比非糖尿病患者發(fā)生心血管疾病和死亡的風(fēng)險(xiǎn)要高2～3倍，預(yù)計(jì)壽命平均縮短8年[9]，而高血糖誘發(fā)的血管并發(fā)癥是導(dǎo)致患者致死致殘的主要原因[10]。本研究結(jié)果表明，紅茶中的活性成分茶黃素能夠有效減輕糖尿病大鼠腹主動(dòng)脈血管損傷，并降低炎癥反應(yīng)，保護(hù)高糖條件下內(nèi)皮細(xì)胞活力和功能，其機(jī)制可能涉及對(duì)NLRP3/IL-1炎癥通路的抑制。血管內(nèi)皮能夠調(diào)整血管緊張度，改變血管結(jié)構(gòu)，作為血管內(nèi)感知血液動(dòng)力學(xué)變化和血液中成分信號(hào)變化的第一道屏障。在高血糖條件下，血管內(nèi)皮細(xì)胞最早受到損害。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是2型糖尿病心血管功能改變的始動(dòng)因素和中心環(huán)節(jié)[11]。血管緊張度的維持有賴于內(nèi)皮細(xì)胞釋放各種血管擴(kuò)張因子和緊張因子，其中NO是一種典型的血管擴(kuò)張因子，血管內(nèi)皮細(xì)胞NO釋放量在一定程度上反映了血管內(nèi)皮的損傷程度。長(zhǎng)期的高血糖作用會(huì)限制NO的合成，并引起大量活性氧簇ROS的產(chǎn)生，損害血管的擴(kuò)張功能。ROS的過(guò)量產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致機(jī)體自身氧化與抗氧化防御系統(tǒng)的不平衡，從而形成氧化應(yīng)激狀態(tài)[12]。TF作為一種天然膳食活性成分，因具有特定的分子結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象使得具有優(yōu)良的抗氧化、抑菌、抑癌及抗炎等生物學(xué)特性[13-14]。本研究表明，TFDG能夠降低糖尿病大鼠腹主動(dòng)脈組織MDA水平，且有效保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，降低高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，增加NO的釋放水平，維護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能?？梢?jiàn)，糖尿病患者長(zhǎng)期飲用紅茶可能有利于預(yù)防心血管疾病。

除了氧化應(yīng)激以外，炎癥反應(yīng)同樣是導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷和動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵因素。炎癥小體是一種多蛋白復(fù)合物，在動(dòng)脈粥樣硬化演化和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定中十分重要，其對(duì)調(diào)節(jié)先天免疫和炎癥反應(yīng)至關(guān)重要。在眾多類(lèi)型的炎癥小體中，NLRP3炎癥小體是動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程所必需的，因此引起了廣泛關(guān)注[15]。NLRP3炎性小體由NOD樣受體家族、ASC適配體和procaspase-1組成[16]。很多刺激因素都可以激活NLRP3炎癥小體，包括鈣內(nèi)流、膽固醇、脂多糖、鉀外流、溶酶體受損、活性氧（ROS）等，NLRP3激活后會(huì)促進(jìn)caspase-1的裂解，進(jìn)而導(dǎo)致促炎因子IL-1和IL-18的釋放，顯著增強(qiáng)炎癥反應(yīng)[17]。

NLRP3炎癥小體的激活可能是由細(xì)胞內(nèi)各種因素共同觸發(fā)，而不是直接與某一激動(dòng)劑相互作用[18]。NLRP3炎癥小體的激活和成熟IL-1的大量釋放，決定了局部炎癥的加劇和炎癥因子上調(diào)導(dǎo)致的廣泛組織損傷，其在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中扮演重要角色。例如NLRP3炎癥小體激活會(huì)大量釋放TNF-、IL-6、VCAM-1和ICAM-1，而這些炎癥因子正是動(dòng)脈粥樣硬化的分子標(biāo)記物和亞臨床冠心病的預(yù)測(cè)因子[19]。試驗(yàn)研究和臨床試驗(yàn)表明，抑制NLRP3炎癥小體的激活、降低IL-1的釋放，可有效抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[20]，這也是預(yù)防心血管病的一個(gè)有效策略，一些NLRP3炎癥小體抑制劑已經(jīng)被鑒定和驗(yàn)證，其中一些抑制劑也正在臨床實(shí)踐中使用或正在進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗(yàn)研究[21]。本研究結(jié)果表明，糖尿病會(huì)誘導(dǎo)腹主動(dòng)脈組織NLRP3炎癥小體的激活，增強(qiáng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，TFDG能夠有效抑制NLRP3/IL-1炎癥通路，降低IL-1的釋放和細(xì)胞炎癥反應(yīng)。NLRP3是如何被多種因素激活，其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制怎樣，目前均尚不清楚，闡明NLRP3炎癥小體激活的機(jī)制并開(kāi)發(fā)其特異性抑制劑，對(duì)于治療眾多炎癥相關(guān)疾病包括心血管病具有十分重要的意義。TFDG如何抑制NLRP3/IL-1炎癥通路，其詳細(xì)分子機(jī)制值得深入探究。

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Effects of Theaflavin-3,3'--Digallate on Vascular Endothelial Injury and Inflammation in Rats with Diabetes Mellitus

DENG Zhihui, ZENG Jie, FU Hongjuan, CHANG Hui*

College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China

To investigate the protective effect and mechanism of theaflavin-3,3'--digallate (TFDG) on vascular endothelial injury and inflammation in rats with diabetes mellitus,diabetic rats were made by high fat feed and streptozotocin injection and then divided into model group (CON), 5?mg·kg-1and 10?mg·kg-1TFDG intervention group (TFDG5 and TFDG10). The normal rats were taken as control group (NC). After 8 weeks of treatment, the pathological changes of abdominal aorta were observed. Plasma IL-6, IL-1and TNF-were detected by ELISA. The protein expression was detected by Western blot.Compared with CON, TFDG administration has no significant effects on body weight and fasting blood glucose. Pathological sections show that the injury of aorta tissue in TFDG group was improved compared with that in CON group. At the same time, the level of plasma inflammatory factors was significantly decreased, the level of plasma NO was significantly increased, and the level of MDA in aorta tissue was decreased in TFDG group. Further studies show that TFDG could down-regulate NLRP3, caspase-1 and IL-1expressions in the aorta of diabetic rats. TFDG effectively protected vascular endothelial injury and inhibit inflammatory response in diabetic rats, and its mechanism might be through down-regulation of NLRP3 inflammatory pathway.

theaflavin, diabetes mellitus, vascular endothelial injury, inflammatory response

S571.1；R735.2

A

1000-369X(2021)06-823-08

2021-05-19

2021-08-13

西南大學(xué)全面提升研究生教育質(zhì)量工程項(xiàng)目（XYDS201905）

鄧志慧，女，碩士研究生，主要從事植物化學(xué)物及其生物學(xué)效應(yīng)的研究。*通信作者：changhui2017@swu.edu.cn

（責(zé)任編輯：趙鋒）