不同產(chǎn)地金釵石斛醇提物HPLC指紋圖譜的建立及其抗炎作用的譜效關系研究

馮月 段飛鵬 李一圣 邱書奇

摘 要 目的：建立不同產(chǎn)地金釵石斛醇提物的高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜，并進行其抗炎作用的譜效關系研究。方法：制備12批不同產(chǎn)地金釵石斛（S1～S12）的醇提物樣品。采用HPLC法檢測，并結(jié)合《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012年版）》建立12批金釵石斛醇提物的指紋圖譜并進行共有峰指認和相似度評價。以炎癥因子[白細胞介素4（IL-4）、IL-6]含量為抗炎指標，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗考察12批金釵石斛醇提物對脂多糖誘導的炎癥模型RAW264.7巨噬細胞的抗炎作用;采用灰色關聯(lián)度分析法分析金釵石斛醇提物指紋圖譜中各共有峰與抗炎指標的關聯(lián)度。結(jié)果：12批金釵石斛醇提物共有18個共有峰，指認了12號峰為石斛酚，各樣品相似度為0.911～0.996。金釵石斛S1～S12醇提物均可顯著降低細胞培養(yǎng)液中IL-4的含量（P<0.05或P<0.01），金釵石斛S1～S8、S10醇提物均可顯著降低細胞培養(yǎng)液中IL-6的含量（P<0.05或P<0.01）。經(jīng)灰色關聯(lián)度分析發(fā)現(xiàn)，除4、18號峰外，其余共有峰與IL-4含量的關聯(lián)度均大于0.6，且5、7號峰與IL-4含量的關聯(lián)度均大于0.8;除9、14、4、3、18號峰外，其余共有峰與IL-6含量的關聯(lián)度均大于0.6，且1、12、13號峰與IL-6含量的關聯(lián)度均大于0.8。結(jié)論：12批不同產(chǎn)地金釵石斛醇提物的HPLC指紋圖譜的相似度較高、所含成分一致性較好;其中1、5、7、12（石斛酚）、13號峰所代表的化學成分可能是金釵石斛潛在的抗炎藥效成分。

關鍵詞 金釵石斛;高效液相色譜;指紋圖譜;抗炎作用;譜效關系

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the HPLC fingerprints of ethanol extracts of Dendrobium nobile from different habitats， and to study spectrum effect relationship of its anti-inflammatory effect. METHODS： The ethanol extracts from 12 batches of D. nobile from different habitats （S1-S12） were prepared. The fingerprints of ethanol extracts from 12 batches of D. nobile were established by HPLC and TCM Fingerprint Similarity Evaluation System （version 2012）. Common peaks were identified and the similarity was evaluated. Using the contents of inflammatory factors （IL-4， IL-6） as anti-inflammatory indexes， ELISA was used to investigate the effects of ethanol extracts from 12 batches of D. nobile on RAW264.7 macrophages in inflammatory model induced by lipopolysaccharide. Grey correlation analysis was used to analyze the correlation between common peaks and anti-inflammatory indexes in the fingerprint of ethanol extract from D. nobile. RESULTS： There were 18 common peaks in ethanol extracts from 12 batches of D. nobile， and No. 12 peak was identified as dendrophenol. The similarity of each sample was 0.911-0.996. The content of IL-4 in cell culture medium was significantly reduced by ethanol extracts of D. nobile S1-S12 （P<0.05 or P<0.01）; the content of IL-6 in cell culture was significantly reduced by ethanol extracts of D. nobile S1-S8， S10 （P<0.05 or P<0.01）. Grey correlation analysis found that except for peaks 4 and 18， the correlation degree between the other common peaks and the content of IL-4 was greater than 0.6， and the correlation degree between peaks 5 and 7 and the content of IL-4 was greater than 0.8; except for peaks 9， 14， 4， 3 and 18， the correlation degree between the other common peaks and the content of IL-6 was greater than 0.6， and the correlation degree between peaks 1， 12 and 13 and the content of IL-6 was greater than 0.8. CONCLUSIONS： HPLC fingerprints of ethanol extracts from 12 batches of D. nobile from different habitats have high similarity and good consistency in composition; the chemical constituents represented by peaks 1， 5， 7， 12 （dendrophenol） and 13 may be potential anti-inflammatory components of D. nobile.

KEYWORDS? ?Dendrobium nobile; HPLC; Fingerprint; Anti-inflammatory activity; Spectrum effect relationship

石斛為蘭科植物金釵石斛Dendrobium nobile Lindl、鼓槌石斛D. chrysotoxum Lindl或流蘇石斛D. fimbriatum Hook的栽培品及其同屬植物近似種的新鮮或干燥莖，其性甘、微寒，具有益胃生津、滋陰清熱的功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，石斛具有抗炎、增強免疫力、降血糖、抗衰老、抗腫瘤和保護神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理活性[2]。相關研究結(jié)果顯示，金釵石斛被較好地應用于慢性咽炎[3]，對炎癥因子的分泌和炎癥反應的發(fā)生具有良好的抑制作用[4-5]。然而，不同產(chǎn)地的金釵石斛因其生長的土壤環(huán)境的異質(zhì)性和微生態(tài)差異性[6]，可能在內(nèi)在性狀、化學成分、藥理活性等方面表現(xiàn)出一定的差異[7]，而這些方面的差異在一定程度上影響著金釵石斛的臨床藥效。因此，對不同產(chǎn)地金釵石斛的內(nèi)在質(zhì)量進行考察是必要的，可為其質(zhì)量控制以及臨床用藥提供一定的參考。

目前，相關研究以中藥化學成分譜和中藥藥效活性為切入點進行中藥譜效關系的研究，可以更加全面地對中藥質(zhì)量進行評價，并為其藥效物質(zhì)基礎研究提供新思路[8-9]。已有研究采用譜效關系研究來考察不同產(chǎn)地中藥材的內(nèi)在質(zhì)量差異，并篩選出潛在的藥效成分[10-12]，因此，本研究參考文獻[13-14]方法將12批不同產(chǎn)地金釵石斛以乙醇煎煮回流提取制備醇提物，并建立該醇提物的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜;以白細胞介素4（IL-4）、IL-6為炎癥指標[15]，結(jié)合灰色關聯(lián)度分析法[16]，初步探討金釵石斛抗炎作用的藥效基礎，為該藥材的內(nèi)在質(zhì)量評價提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：e2695/2998型HPLC儀（美國Waters公司），BSA323S型電子精密天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司），Milli-Q Advantage A10型超純水機（美國Millipore公司），SB-1200型數(shù)顯恒溫水浴鍋、N-1200B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司），F(xiàn)D-1C-80型冷凍干燥機（上海比朗儀器制造有限公司），109922-7730型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司），5810F型臺式離心機（德國Eppendorf公司），TUNE型多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用12批金釵石斛藥材（編號S1～S12）分別購自四川省樂山市夾江縣、貴州省赤水市、云南省昭通市鎮(zhèn)雄縣，經(jīng)深圳市龍崗區(qū)耳鼻咽喉醫(yī)院中藥新藥研究室李一圣副主任中藥師鑒定為蘭科植物金釵石斛D. nobile Lindl的干燥莖。其他藥品與試劑有：石斛酚對照品、地塞米松對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111875-201202、100129-201506，純度均不低于99%），DMEM細胞培養(yǎng)基（美國HyClone公司，批號AE25719279），0.25%胰酶-EDTA（美國Gibco公司，批號25200-056），胎牛血清（美國ScienCell公司，批號19797），脂多糖（美國Sigma公司，批號L2630），IL-4酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司，批號M190521-003a），IL-6? ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號JUUIH4ECKG）;甲醇為色譜純，甲酸為分析純，水為超純水。不同產(chǎn)地金釵石斛藥材來源信息見表1。

1.3 細胞

本研究所用小鼠源性RAW264.7巨噬細胞株購自美國ATCC公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 金釵石斛醇提物HPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 金釵石斛醇提物的制備 將12批金釵石斛藥材以打粉機制成粗粉。精密稱取各批藥材粗粉各25 g，分別置于圓底燒瓶中，加入90%乙醇625 mL后，置于60 ℃水浴鍋內(nèi)回流提取2次，每次1 h;過濾，合并2次的濾液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮至20 mL;將濃縮后溶液轉(zhuǎn)入燒杯中，繼續(xù)置于60 ℃水浴鍋中充分揮干乙醇，即得金釵石斛醇提物浸膏。將該浸膏置于-80 ℃條件下冷凍過夜，然后置于冷凍干燥機中凍干，即得金釵石斛醇提物粉末（以生藥量計，得率為6.11%）

2.1.2 色譜條件 色譜柱為Sapphire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相為0.1%甲酸（B）-甲醇（D），梯度洗脫（0～10 min，5%D→10%D;10～20 min，10%D→20%D;20～28 min，20%D→30%D;28～55 min，30%D→60%D;55～65 min，60%D→65%D;65～75 min，65%D→90%D;75～80 min，90%D→10%D）;流速為1.0 mL/min;柱溫為25 ℃;檢測波長為254 nm;進樣體積為20 μL。

2.1.3 供試品溶液的制備 分別稱取“2.1.1”項下制備的12批金釵石斛醇提物粉末25 mg，置于燒杯中，以適量甲醇溶解后，轉(zhuǎn)入25 mL量瓶，以甲醇定容;分別取1 mL上述溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取濾液，即得供試品溶液。

2.1.4 對照品溶液的制備 精密稱取石斛酚對照品250 μg，置于燒杯中，以適量甲醇溶解后，轉(zhuǎn)入25 mL量瓶，以甲醇定容;取1 mL上述溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取濾液，即得對照品溶液。

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.3”項下制備的供試品溶液（S1號樣品醇提物）適量，按“2.1.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。將10號色譜峰（出峰時間適中且峰形較好，下同）作為參照峰（S），計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰的相對保留時間的RSD為0.04%～0.45%（n=6），相對峰面積的RSD為0.55%～2.97%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復性試驗 取S1號樣品醇提物6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.2”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。將10號色譜峰作為參照峰（S），計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰的相對保留時間的RSD為0.02%～0.39%（n=6），相對峰面積的RSD為1.13～2.98%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液（S1號樣品醇提物），于室溫放置0、2、4、8、12、16、24 h后，按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將10號色譜峰作為參照峰（S），計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰的相對保留時間的RSD為0.01%～0.67%（n=7），相對峰面積RSD為1.75%～2.58%（n=7），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 12批不同產(chǎn)地金釵石斛醇提物樣品HPLC指紋圖譜的生成 取“2.1.1”項下制備的12批金釵石斛醇提物粉末，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.2”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012年版）》，將色譜峰峰形較明顯、信號強度較好的S1號樣品醇提物的色譜圖作為參照色譜圖，運用全譜峰匹配法和中位數(shù)法，將時間窗設置為0.1，經(jīng)過多點校正后，自動匹配生成12批不同產(chǎn)地金釵石斛醇提物的HPLC疊加指紋圖譜和對照圖譜R，詳見圖1。

2.1.9 共有峰指認 取“2.1.4”項下對照品溶液，按“2.1.2”項下色譜條件進樣分析，得到如圖2所示的石斛酚對照品色譜圖。由圖1可知，12批不同產(chǎn)地金釵石斛醇提物一共有18個共有峰，通過與圖2進行對比，指認出12號峰為石斛酚。

2.1.10 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012年版）》對12批金釵石斛醇提物的指紋圖譜進行相似度評價。結(jié)果，12批金釵石斛醇提物樣品指紋圖譜的相似度在0.911～0.996范圍內(nèi)，表明這12批樣品的一致性較好，詳見表2。

2.2 金釵石斛醇提物對脂多糖誘導的 RAW264.7巨噬細胞抗炎作用的考察

本研究參考文獻[15]的方法，探究金釵石斛醇提物對脂多糖誘導的炎癥模型RAW264.7巨噬細胞中炎癥因子（IL-4、IL-6）含量的影響，以此評價其抗炎作用。

2.2.1 細胞培養(yǎng) RAW264.7巨噬細胞采用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基（簡稱“培養(yǎng)基”），于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（以下培養(yǎng)條件相同），取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

2.2.2 金釵石斛醇提物對細胞培養(yǎng)液中IL-4、IL-6含量的影響 取RAW264.7巨噬細胞，按5×104個/孔接種于96孔板，然后分為正常對照組、模型組、地塞米松組（陽性對照，100 μg/mL，給藥質(zhì)量濃度根據(jù)文獻[17]設置）和12批金釵石斛（S1～S12）醇提物組（100 μg/mL，給藥質(zhì)量濃度根據(jù)本課題組前期預實驗結(jié)果設置） ，每組設3個復孔。正常對照組加入培養(yǎng)基200 μL，模型組細胞加入含100 ng/mL脂多糖的培養(yǎng)基200 μL，各給藥組加入含100 ng/mL脂多糖和相應藥物的培養(yǎng)基200 μL;細胞培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)液，以3 000 r/min離心5 min，取上清液，按照相應ELISA 試劑盒說明書方法操作;采用酶標儀于450 nm波長下測定吸光度，計算上清液中IL-4、IL-6含量。采用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示。組間比較采用單因素方差分析，方差齊時，采用 LSD檢驗;方差不齊時，采用 Dunnetts T3檢驗。檢驗水準α=0.05。

結(jié)果，與正常對照組比較，模型組細胞培養(yǎng)液中IL-4、IL-6含量均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，地塞米松組細胞培養(yǎng)液中IL-4、IL-6含量均顯著降低（P<0.01），金釵石斛S1～S12醇提物組細胞培養(yǎng)液中IL-4含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），金釵石斛S1～S8、S10醇提物組細胞培養(yǎng)液中IL-6含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），表明12批金釵石斛醇提物對細胞中IL-4、IL-6含量均具有不同程度的抑制作用;且貴州省赤水市產(chǎn)金釵石斛（S1～S4）醇提物的抑制作用較強，云南省昭通市鎮(zhèn)雄縣產(chǎn)金釵石斛（S5～S8）醇提物次之，四川省樂山市夾江縣產(chǎn)金釵石斛（S9～S12）醇提物則相對較弱，詳見表3。

注：與正常對照組比較，**P<0.01;與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

Note： vs. normal group，**P<0.01; vs. model group，#P<0.05，##P<0.01

2.3 譜效關系分析

2.3.1 抗炎指標的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化 將“2.2.2”項下RAW264.7巨噬細胞培養(yǎng)液中IL-4、IL-6含量按以下公式進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化：IL-4抑制率=[1-（給藥組IL-4含量-正常對照組IL-4含量）/（模型組IL-4含量-正常對照組IL-4含量）]×100%;IL-6抑制率=[1-（給藥組IL-6含量-正常對照組IL-6含量）/（模型組IL-6含量-正常對照組IL-6含量）]×100%?？寡字笜说臄?shù)據(jù)轉(zhuǎn)化結(jié)果見表4。

2.3.2 數(shù)據(jù)處理 采用均值法將“2.3.1”項下12批金釵石斛醇提物的抗炎活性指標的轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)與其共有峰峰面積數(shù)據(jù)進行歸一化處理[18-19]。將歸一化后的抗炎活性指標設置為母序列Y（k），18個共有峰歸一化后峰面積設置為子序列為Xi（i表示共有峰編號1、2、3……18），然后計算母序列與子序列的灰色關聯(lián)系數(shù)Ai（k）：Ai（k）=

[Δi（k）min+ρ×Δi（k）max]/[Δi（k）+ρ×Δi（k）max]，其中Δi（k）=|Y（k）-Xi |，分辨系數(shù)ρ為0.5。

2.3.3 灰色關聯(lián)度分析 根據(jù)“2.3.2”項下得到的數(shù)據(jù)，采用灰色關聯(lián)度分析法計算母序列與子序列的灰色關聯(lián)系數(shù)Ai（k）的平均值，即關聯(lián)度。當關聯(lián)度大于0.8，則表示母序列與子序列關聯(lián)度較大;當關聯(lián)度介于0.6～0.8之間，則表示兩者關聯(lián)度一般;當關聯(lián)度小于0.6，則表示兩者關聯(lián)度較小[19]。結(jié)果顯示，12批金釵石斛醇提物的18個共有峰與IL-4含量的關聯(lián)度為0.503 4～0.815 8，除4、18號峰外，其余共有峰與IL-4含量的關聯(lián)度均大于0.6，且5、7號峰與IL-4含量的關聯(lián)度均大于0.8;12批金釵石斛醇提物的18個共有峰與IL-6含量的關聯(lián)度為0.554 0～0.844 0，除9、14、4、3、18號峰外，其余共有峰與IL-6含量的關聯(lián)度均大于0.6，且1、12、13號峰與IL-6含量的關聯(lián)度均大于0.8，詳見表5、表6。

3 討論

本研究基于12批金釵石斛醇提物HPLC指紋圖譜與其抗炎作用的譜效關系，初步揭示了不同產(chǎn)地金釵石斛內(nèi)在質(zhì)量的差異以及潛在的抗炎作用成分。由指紋圖譜可知，12批不同產(chǎn)地金釵石斛醇提物中有18個共有峰，并指認出12號色譜峰為石斛酚。由相似度評價結(jié)果可知，四川省樂山市夾江縣、貴州省赤水市、云南省昭通市鎮(zhèn)雄縣這3個產(chǎn)區(qū)的金釵石斛醇提物的相似度較高，均不低于0.9，表明各產(chǎn)地的金釵石斛所含成分一致性較好。

本研究進一步研究了12批不同產(chǎn)地金釵石斛醇提物對脂多糖誘導的炎癥模型RAW264.7巨噬細胞的抗炎作用，發(fā)現(xiàn)貴州省赤水市產(chǎn)金釵石斛（S1～S4）和云南省昭通市鎮(zhèn)雄縣產(chǎn)金釵石斛（S5～S8）對細胞中炎癥因子IL-4、IL-6具有較強的抑制作用;四川省樂山市夾江縣產(chǎn)金釵石斛（S9～S12）也能降低細胞中IL-4、IL-6水平，但其抑制作用相對較弱。這表明不同產(chǎn)地金釵石斛所含成分在一致性較好的情況下，其內(nèi)在質(zhì)量仍有可能存在差異。由此筆者推測，這種差異可能與不同產(chǎn)地的氣候條件、土壤酸堿度、微量元素、植株根際細菌多樣性等因素有關[20]。

通過灰色關聯(lián)度分析發(fā)現(xiàn)，本研究建立的12批金釵石斛醇提物HPLC指紋圖譜的共有峰中，除4、18號峰外，其余共有峰與IL-4含量的關聯(lián)度均大于0.6，且5、7號峰與IL-4含量的關聯(lián)度均大于0.8;除9、14、4、3、18號峰外，其余共有峰與IL-6含量的關聯(lián)度均大于0.6，且1、12、13號峰與IL-6含量的關聯(lián)度均大于0.8。由此說明，金釵石斛醇提物發(fā)揮抗炎作用的基礎可能是其各共有峰所代表的化學成分共同作用的結(jié)果。

綜上所述，本研究建立了12批不同產(chǎn)地金釵石斛醇提物的HPLC指紋圖譜，其中5、7號峰所代表的成分與抗炎指標IL-4的關聯(lián)度較大，1、12、13號峰與抗炎指標IL-6的關聯(lián)度較大，由此推測，1、5、7、12（石斛酚）、13號峰所代表的化學成分可能是金釵石斛潛在的抗炎藥效成分。后續(xù)本課題組將完善上述共有峰的指認和鑒定，從而進一步明確金釵石斛抗炎作用的藥效物質(zhì)，以期為該藥材的整體質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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（收稿日期：2021-04-25 修回日期：2021-06-07）

（編輯：唐曉蓮）