線粒體自噬在阿霉素心臟毒性中的研究進(jìn)展*

周 云，王玲娥，余 薇，查文良**

(1.湖北科技學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院)

阿霉素(doxorubicin，DOX)是一種從鏈霉菌中提取出的蒽環(huán)類抗生素，被廣泛用于治療白血病、實(shí)體腫瘤、軟組織肉瘤和乳腺癌等多種癌癥[1]。然而，當(dāng)機(jī)體內(nèi)阿霉素的累積劑量超過(guò)其治療安全閾值時(shí)，心臟的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)受到嚴(yán)重?fù)p傷，表現(xiàn)為心律失常、心肌病、左室功能障礙與充血性心力衰竭等一系列病理改變，致使阿霉素在臨床應(yīng)用上受到嚴(yán)重限制[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)[4]，阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷涉及多種機(jī)制，包括活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生、脂質(zhì)過(guò)氧化和線粒體功能障礙等，其中線粒體功能障礙被認(rèn)為是阿霉素誘導(dǎo)心臟毒性發(fā)生的關(guān)鍵，因此，其調(diào)控途徑可作為防治阿霉素心臟毒性的一個(gè)新的潛在靶點(diǎn)。

1 線粒體自噬

線粒體作為真核細(xì)胞的動(dòng)力來(lái)源，主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)產(chǎn)生和細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵細(xì)胞器。同時(shí)也作為ROS的主要來(lái)源，其產(chǎn)生的ROS可氧化線粒體內(nèi)外的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及核酸，引起細(xì)胞內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)損傷和功能紊亂，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡。

線粒體自噬作為一種選擇性的自噬，一直被認(rèn)為是負(fù)責(zé)調(diào)控線粒體質(zhì)量的潛在機(jī)制，主要通過(guò)自噬體形成以及自噬體和溶酶體融合的方式選擇性清除細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙的線粒體或降解不必要的正常的線粒體，防止ROS等有害產(chǎn)物的積累，同時(shí)保證線粒體的正常功能，對(duì)滿足細(xì)胞能量需求和維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡具有關(guān)鍵作用。值得注意的是，功能失調(diào)的，主要是有缺陷的線粒體自噬參與各種人類疾病的病理生理進(jìn)程，包括心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥、自身免疫性疾病和衰老等[5]。因此，線粒體自噬的分子機(jī)制和功能研究備受關(guān)注。目前，研究發(fā)現(xiàn)線粒體自噬的分子機(jī)制與酵母中的自噬相關(guān)蛋白32以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的線粒體分裂和融合相關(guān)蛋白、PTEN誘導(dǎo)性激酶蛋白1(PTEN induced putative kinase 1，PINK1)、E3泛素連接酶Parkin、Bcl-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3，BNIP3)、Nip3樣蛋白X(NIP3-like protein X，NIX)、FUN14結(jié)構(gòu)域包含蛋白1(FUN14 domain containing 1，F(xiàn)UNDC1)等密切相關(guān)[6-7]。例如，在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)中，磷酸酶張力蛋白同源物通過(guò)抑制線粒體自噬促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，同時(shí)高蛋白飲食導(dǎo)致過(guò)量氨基酸攝入，也會(huì)通過(guò)阻斷NIX介導(dǎo)的線粒體自噬活性，加劇動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的巨噬細(xì)胞凋亡和熱下垂[8]。此外，在阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性中，阿霉素誘導(dǎo)線粒體自噬，表現(xiàn)為自噬小體、輕鏈3(light chain 3，LC3)、Beclin1增加、p62減少以及LC3在線粒體中的共定位，同時(shí)阿霉素激活PINK1/Parkin通路，促進(jìn)PINK1/Parkin向線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。因此，表明線粒體自噬與阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性密切相關(guān)，然而其確切的分子機(jī)制尚未完全闡明。

2 阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性中線粒體自噬的分子機(jī)制

在阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性中，阿霉素誘發(fā)的ROS超載和凋亡啟動(dòng)蛋白的釋放與抑制受損或不必要線粒體的清除有關(guān)，通過(guò)線粒體自噬可確保阿霉素所致的受損或不必要線粒體的選擇性清除。目前據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]，阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性中線粒體自噬受線粒體分裂及融合相關(guān)蛋白和線粒體自噬受體PINK1/Parkin、BNIP3/NIX、FUNDC1等調(diào)控。特別是自噬受體，它們有一共同特征，即具有和LC3相互作用的LC3結(jié)合位點(diǎn)，從而促使線粒體被包裹進(jìn)自噬囊泡中，誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生，清除受損或不必要的線粒體，最終維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定。

2.1 線粒體分裂及融合相關(guān)蛋白

線粒體分裂由線粒體外膜(outer mitochondrial membrane，OMM)上的蛋白質(zhì)、裂變蛋白1(fission protein 1，F(xiàn)IS1)、線粒體分裂因子、線粒體動(dòng)力蛋白49/50以及動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin related protein 1，DRP1)相互作用介導(dǎo)。線粒體融合由OMM上的線粒體融合蛋白1與線粒體融合蛋白2(mitofusin 2，MFN2)或MFN2與MFN2的二聚引發(fā)的OPA1介導(dǎo)。其中MFN2在PINK1的介導(dǎo)下磷酸化，并將融合蛋白轉(zhuǎn)化為線粒體自噬受體，減少線粒體的融合，從而減輕細(xì)胞損傷。首次在阿霉素誘導(dǎo)的肝損傷中發(fā)現(xiàn)，線粒體分裂及融合和線粒體自噬機(jī)制的改變可防止阿霉素引起的肝毒性，而線粒體分裂可能作為一種自適應(yīng)反應(yīng)參與阿霉素介導(dǎo)的線粒體自噬的發(fā)生發(fā)展[12]。有研究發(fā)現(xiàn)[13]，在阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性中，盡管阿霉素降低了線粒體融合的初級(jí)調(diào)節(jié)因子OPA1的蛋白表達(dá)水平，但線粒體分裂的調(diào)節(jié)因子DRP1和FIS1的表達(dá)并沒(méi)有變化，引起線粒體碎片增加、線粒體自噬激活，而DRP1敲除后線粒體碎片減少、心肌細(xì)胞線粒體自噬通量降低、阿霉素誘導(dǎo)的心臟損傷減輕，這些現(xiàn)象表明線粒體分裂及融合，尤其是依賴于DRP1的線粒體分裂在阿霉素誘導(dǎo)的線粒體自噬中是必不可少的。

2.2 PINK1和Parkin

目前，PINK1/Parkin途徑介導(dǎo)的線粒體自噬是哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中研究最廣泛的途徑[14]。PINK1作用于Parkin的上游，是Parkin激活和募集去極化線粒體所必需的。在健康的線粒體中，PINK1作為線粒體靶向蛋白通過(guò)OMM定位的X線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶(translocase of outer mitochondrial membrane，TOM)復(fù)合物和線粒體內(nèi)膜定位的線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)位酶(translocase of inner mitochondrial membrane，TIM)復(fù)合物導(dǎo)入線粒體，并被早老素相關(guān)菱形樣蛋白降解而維持在低水平。而在受損的線粒體中，線粒體的去極化及膜電位的耗散可抑制貫穿于TIM/TOM復(fù)合體的PINK1導(dǎo)入線粒體，PINK1在OMM上積累并穩(wěn)定在一個(gè)由TOM7、TOM40、TOM70、TOM20和TOM22組成的復(fù)合物中，從而將Parkin從胞漿招募到泛素化OMM蛋白的線粒體，最終激活線粒體自噬[15]。有研究發(fā)現(xiàn)[16]，在阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性中，阿霉素引起線粒體損傷并破壞PINK1/Parkin依賴性的線粒體自噬，通過(guò)促進(jìn)Parkin向線粒體的積累，激活Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬以維持線粒體功能，最終改善阿霉素對(duì)心肌細(xì)胞的損傷。因此，可猜測(cè)PINK1/Parkin途徑介導(dǎo)的線粒體自噬與阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性密切相關(guān)。

2.3 BNIP3和NIX

BNIP3是Bcl-2家族的成員，與DRP1和OPA1相關(guān)，促進(jìn)線粒體分裂而抑制融合，同時(shí)BNIP3含有的LC3相互作用基序(LC3-interacting region，LIR)能夠通過(guò)促進(jìn)LC3的表達(dá)，降低哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的活性，獨(dú)立影響線粒體自噬。NIX與BNIP3同源，是線粒體更新和程序性細(xì)胞死亡途徑的雙重調(diào)節(jié)因子，參與細(xì)胞內(nèi)的線粒體自噬和細(xì)胞死亡。同時(shí)，NIX作為一種線粒體外膜蛋白，也含有定位于自噬體膜表面的LIR基序，可介導(dǎo)線粒體隔離進(jìn)入自噬小泡，從而誘導(dǎo)線粒體自噬和清除損傷的線粒體。有研究發(fā)現(xiàn)[17]，在阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性模型中，BNIP3可轉(zhuǎn)移到線粒體，促進(jìn)通透性轉(zhuǎn)變和去極化，誘導(dǎo)Parkin招募到線粒體，啟動(dòng)線粒體自噬。此外，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，BNIP3觸發(fā)DRP1從胞漿向OMM轉(zhuǎn)運(yùn)并招募Parkin，從而激發(fā)線粒體自噬以清除受損線粒體?？梢?jiàn)，BNIP3介導(dǎo)的線粒體自噬依賴于心肌細(xì)胞中的Parkin募集，參與阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性的發(fā)生及發(fā)展。

2.4 FUNDC1

FUNDC1作為缺氧條件下哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的一種線粒體外膜蛋白，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸位點(diǎn)相互作用而被積累，通過(guò)LIR基序與自噬標(biāo)記LC3結(jié)合發(fā)揮作用。在缺氧條件下，F(xiàn)UNDC1被SRC激酶和CK2在酪氨酸18和絲氨酸13的位點(diǎn)磷酸化時(shí)，降低了它對(duì)LC3的親和力；而被PGAM5或其他尚待鑒定的磷酸酶去磷酸化時(shí)，很大程度上增加了它與LC3或其他自噬基因的相互作用，從而啟動(dòng)線粒體自噬[18]。迄今為止，僅研究過(guò)缺氧條件下誘導(dǎo)的線粒體自噬，而阿霉素對(duì)FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬的作用仍有待確定[10]。不過(guò)，F(xiàn)UNDC1在線粒體分裂過(guò)程中也是DRP1的一個(gè)適配器，F(xiàn)UNDC1過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)線粒體分裂，而FUNDC1基因敲除則導(dǎo)致線粒體融合。

3 線粒體自噬在阿霉素心臟毒性中的作用

近年來(lái)，心臟組織中豐富的線粒體已被確定為阿霉素誘導(dǎo)心臟毒性發(fā)生的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一[19]。目前，研究者通過(guò)大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對(duì)線粒體自噬在阿霉素心臟毒性中的作用進(jìn)行了研究。首先，在阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性的體外研究中，Xu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，1μmol/L阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞24h后，阿霉素可通過(guò)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB，TFEB)功能異常來(lái)抑制溶酶體功能，從而破壞心臟自噬，心臟自噬過(guò)程的中斷導(dǎo)致ROS過(guò)量產(chǎn)生以及△ψm分離，最終使線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和死亡。說(shuō)明缺陷的線粒體自噬在阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性中發(fā)揮損傷作用，而線粒體自噬的增加是降低細(xì)胞凋亡的有效手段，這也從反面證實(shí)了線粒體自噬可通過(guò)選擇性清除受損的線粒體對(duì)心臟發(fā)揮保護(hù)作用。此外，小劑量阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性與DRP1磷酸化抑制、mTOR磷酸化升高以及TFEB的表達(dá)受到抑制有關(guān)，通過(guò)DRP1/mTOR/TFEB途徑增加線粒體自噬可減輕阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性。大劑量阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性與細(xì)胞內(nèi)的線粒體自噬增加有關(guān)，最終導(dǎo)致心功能發(fā)生障礙[10]。也有研究者發(fā)現(xiàn)[13]，DRP1抑制劑mdivi-1通過(guò)抑制線粒體分裂和線粒體自噬阻止了阿霉素的損傷作用。因此，上述研究表明線粒體自噬在阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性中發(fā)揮雙重作用：缺陷或過(guò)度的線粒體自噬可加重心肌損傷，而適量的線粒體自噬可通過(guò)線粒體自噬-溶酶體蛋白降解系統(tǒng)清除損傷的線粒體減輕心臟損傷，這可能是由于阿霉素劑量的不同導(dǎo)致的。

有趣的是，也有研究者發(fā)現(xiàn)線粒體自噬在阿霉素誘導(dǎo)的體外實(shí)驗(yàn)中的雙重作用除了與阿霉素劑量有關(guān)外，可能還與細(xì)胞品系和孵育時(shí)間有關(guān)。例如，Liang等[21]研究表明，5μmol/L阿霉阿霉素誘導(dǎo)新生小鼠心室肌細(xì)胞24h后，阿霉素促進(jìn)線粒體和溶酶體的共定位，誘導(dǎo)線粒體自噬。他們發(fā)現(xiàn)，在阿霉素刺激下LRRK2和Rab7水平升高，TOM20和TIM23水平降低，用線粒體自噬抑制劑蓮心堿處理后逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象，其Rab7水平的降低抑制自噬小體和溶酶體融合以抑制阿霉素刺激心肌細(xì)胞的線粒體自噬，從而減輕阿霉素引起的心臟功能障礙。相比之下，Xiao等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在2μmol/L阿霉阿霉素誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞24h后，Parkin的蛋白和mRNA水平均降低，用構(gòu)建的質(zhì)粒高表達(dá)Parkin可減弱細(xì)胞凋亡；用Ad-RFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，Parkin表達(dá)顯著增加了自噬小體和自噬溶酶體數(shù)量；Parkin過(guò)表達(dá)導(dǎo)致LC3顯著升高。他們認(rèn)為Parkin過(guò)表達(dá)提高線粒體自噬可能保護(hù)了阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷。此外，Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，1μmol/L阿霉阿霉素誘導(dǎo)新生大鼠心肌細(xì)胞12h后，透射電鏡圖像顯示很少有自噬小體吞噬線粒體，同時(shí)線粒體中的Parkin、LC3Ⅱ和p62蛋白水平以及Parkin和p62與線粒體的共定位均降低，SESN2過(guò)表達(dá)增加它們的表達(dá)和共定位，激活Parkin依賴性線粒體自噬保護(hù)心肌細(xì)胞免受阿霉素誘導(dǎo)的損傷。

同樣的，在阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中線粒體自噬亦發(fā)揮雙重作用。然而，線粒體自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，在阿霉素誘導(dǎo)的急性心臟毒性模型中并不僅是簡(jiǎn)單的激活或抑制線粒體自噬，也關(guān)系到線粒體自噬通量的整個(gè)過(guò)程。Liu等[11]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在阿霉素誘導(dǎo)的急性心臟毒性，阿霉素抑制Parkin的表達(dá)及其從胞漿到線粒體的易位，這損害了線粒體自噬，同時(shí)，阿霉素還破壞了線粒體自噬通量，而Rubicon缺失可改善阿霉素處理后心臟的線粒體自噬通量和線粒體自噬。相對(duì)的，在阿霉素誘導(dǎo)的慢性心臟毒性模型中，阿霉素處理后5d，Parkin/PINK1的表達(dá)水平降低，證明在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬的吞噬功能降低；然而阿霉素處理后2周，這些蛋白的表達(dá)水平發(fā)生反彈，甚至超過(guò)對(duì)照組，同時(shí)線粒體分裂與線粒體自噬增加相關(guān)的FIS1蛋白的表達(dá)也增加[22]。因此，這些研究表明模型類型及處理時(shí)間的不同也可能是線粒體自噬雙重作用的原因。

綜上所述，線粒體自噬發(fā)生的“量”是保護(hù)或有助于阿霉素心臟毒性的關(guān)鍵。有文獻(xiàn)報(bào)道[19]，線粒體自噬在阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性中發(fā)揮的不同作用可能還與用于測(cè)量線粒體自噬的方法不同有關(guān)。然而，尚無(wú)足夠的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。因此，在將來(lái)研究線粒體自噬在阿霉素心臟毒性中的作用及調(diào)控機(jī)制時(shí)，需考慮到上述這些因素的影響，這對(duì)于臨床上防治阿霉素的心臟毒性有著重要的研究?jī)r(jià)值。

4 展 望

21世紀(jì)以來(lái)，阿霉素劑量依賴性和累積性誘發(fā)的不可逆的退行性心肌病和充血性心力衰竭等心臟毒副作用給患者帶來(lái)了極大的不利影響。因此，及時(shí)監(jiān)測(cè)和調(diào)節(jié)線粒體自噬水平、了解影響線粒體自噬“量”變化的因素及機(jī)制、掌控線粒體自噬發(fā)揮保護(hù)作用的“量”以及維持線粒體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等措施在防治阿霉素心臟毒性方面至關(guān)重要。目前，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中線粒體分裂及融合相關(guān)蛋白、PINK1/Parkin、BNIP3/Nix以及FUNDC1等分子途徑，尤其是PINK1/Parkin途徑相關(guān)的線粒體自噬作為選擇性地清除細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙的線粒體或降解不必要的正常線粒體的一種方式，參與阿霉素心臟毒性的發(fā)生發(fā)展。然而，由于線粒體自噬在阿霉素心臟毒性中的作用及確切機(jī)制尚未完全闡明，故需針對(duì)線粒體自噬在阿霉素心臟毒性中的作用及機(jī)制做進(jìn)一步研究，為臨床上阿霉素心臟毒性的防治提供新的理論依據(jù)和靶點(diǎn)。