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    高效液相色譜法測定糧油食品中黃曲霉毒素含量

    2021-12-09 06:58彭立
    食品安全導(dǎo)刊 2021年11期
    關(guān)鍵詞:糧油食品含量測定高效液相色譜法

    彭立

    摘 要:目的:選擇高效液相色譜法對(duì)糧油制品中黃曲霉毒素B1展開快速測定。方法:提取、凈化并濃縮樣品中黃曲霉毒素B1后,確定流動(dòng)相為乙酸銨溶液(5 mmol/L)、乙腈-甲醇溶液(50︰50),以梯度洗脫程序?yàn)橐罁?jù),采取液相色譜法展開測定,定量使用外標(biāo)法。結(jié)果:在濃度范圍為0.2~20 ng/mL時(shí),黃曲霉毒素B1線性回歸方程為Y=68 577.3X-20 845,R>0.998,線性關(guān)系良好;方法檢出限為0.07 μg/kg、定量限為0.2 μg/kg;加標(biāo)回收率超過85.0%,RSD不超過5.5%。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好,可用于快速檢測糧油制品中黃曲霉毒素B1。

    關(guān)鍵詞:高效液相色譜法;糧油食品;黃曲霉毒素;含量測定

    Determination of Aflatoxin in Cereals, Oils and Foods by HPLC

    PENG Li

    (Yichun Grain and Oil Quality Supervision and Inspection Station, Yichun 336000)

    Abstract: objective: to develop an HPLC method for the rapid determination of aflatoxin B1 in grain and oil products. Methods: after extraction, purification and concentration of aflatoxin B1 in the sample, the mobile phase was determined as ammonium acetate solution (5 mmol/L) and acetonitrile methanol solution (50:50). Based on the gradient elution procedure, the determination was carried out by liquid chromatography, and the external standard method was used quantitatively. Results: In the concentration range of 0.2~20 ng/mL, the linear regression equation of aflatoxin B1 was, and the linear relationship was good; The detection limit was 0.07 μg/kg,limit of quantitation 0.2 μg/kg;The recovery rate of standard addition is more than 85.0%,and the RSD is not more than 5.5%.Conclusion: the results of this method are accurate, reliable and reproducible.It can be used for the rapid determination of aflatoxin B1 in grain and oil products.

    Keywords: high performance liquid chromatography; grain, oil and food; aflatoxin; content determination

    黃曲霉與寄生曲霉等菌株在特定溫濕度條件下會(huì)產(chǎn)生黃曲霉毒素,屬于一類二級(jí)代謝產(chǎn)物,此類毒素對(duì)人體有強(qiáng)烈致癌危害。黃曲霉毒素包含黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2,其中毒性最強(qiáng)的為黃曲霉毒素B1。由于自然環(huán)境中存在的黃曲霉毒素相對(duì)較多,且對(duì)人類的危害性極高,因此有必要做好相關(guān)的控制工作。目前,在檢測黃曲霉毒素時(shí)多選擇液相色譜法、金標(biāo)試紙法、酶聯(lián)免疫法及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等。其中,高效液相色譜法具備極高的靈敏度和可觀的準(zhǔn)確性,能夠精確定量黃曲霉毒素,因此被廣泛應(yīng)用于食品中黃曲霉毒素的檢測。本文選擇免疫親和柱凈化-高效液相色譜技術(shù)測定糧油食品中黃曲霉毒素B1。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    甲醇、乙腈(色譜級(jí));乙酸銨(分析純);0.22 μm

    微孔有機(jī)濾膜;黃曲霉毒素免疫親和柱;黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(2 μg/mL)。實(shí)驗(yàn)用糧油樣品獲取自近期本地市場抽樣。

    1.2 儀器與設(shè)備

    液相色譜儀(Agilent 1260);電子天平(梅特勒ME204E型);渦旋混合器(vortex genie2);臺(tái)式高速離心機(jī)(TG16)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

    精準(zhǔn)量取黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入適量甲醇稀釋為100 ng/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

    1.3.2 配制標(biāo)準(zhǔn)工作液

    分別量取0.20 μL、2.00 μL、5.00 μL、10.00 μL、20.00 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于樣品瓶內(nèi),加入初始比例流動(dòng)相定容,完成濃度分別為0.20 ng/mL、2.00 ng/mL、5.00 ng/mL、10.00 ng/mL、20.00 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制。

    1.3.3 樣品提取

    精準(zhǔn)稱取5.00 g糧油樣品置于離心管(50 mL),加入甲醇-水溶液(70︰30)25.0 mL,渦旋混勻后轉(zhuǎn)移至超聲波儀內(nèi)持續(xù)20 min提取后,再持續(xù)10 min離心(6 000 r/min),收集上清液,待凈化。

    1.3.4 樣品凈化

    精準(zhǔn)量取上清液5.0 mL,加入含1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液20 mL并混勻,待免疫親和柱原有液體恢復(fù)至室溫并流進(jìn)后,用注射器裝載上述樣液,控制下滴流速為1.0 mL/min,全部下滴后用水淋洗免疫親和柱(分2次,共計(jì)耗水20 mL)[1-2]。待滴完水后抽干免疫親和柱,用甲醇洗脫免疫親和柱(分2次,共計(jì)使用甲醇2 mL),控制下滴流速為1.0 mL/min,用氮吹管裝載收集的洗脫液,50 ℃下氮?dú)獯蹈珊?,殘?jiān)贸跏急壤鲃?dòng)相(1 mL)溶解后,過0.22 μm微孔有機(jī)濾膜并轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶內(nèi),待測。

    1.3.5 色譜條件

    選擇Shim-pack GIST C18色譜柱,100 mm×2.1 mm,2 μm;40 ℃柱溫,0.3 mL/min柱流量,10 μL進(jìn)樣體積[3]。流動(dòng)相A、B分別為乙酸銨溶液(5 mmol/L)、乙腈-甲醇溶液(50︰50).表1為梯度洗脫程序。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 線性方程及相關(guān)性

    根據(jù)1.3.1和1.3.2的步驟完成標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制,檢測不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,參照對(duì)應(yīng)化合物濃度(X)和目標(biāo)化合物響應(yīng)峰面積(Y)獲取黃曲霉毒素B1線性回歸方程為Y=68 577.3X-20 845,線性范圍為0.2~20 ng/mL,R>0.998。

    2.2 方法檢出限

    精準(zhǔn)量取適量的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,移至空白樣品溶液內(nèi),加入初始流動(dòng)相逐級(jí)稀釋,以檢出限為信噪比S/N=3為根據(jù),通過計(jì)算獲取0.07 μg/kg的黃曲霉毒素B1檢出限,以定量限為信噪比S/N=10為根據(jù),通過計(jì)算獲取0.2 μg/kg的黃曲霉毒素B1定量限。

    2.3 加標(biāo)回收率及重現(xiàn)性

    分別精準(zhǔn)稱取空白糧油樣品5.00 g,共計(jì)18份,圍繞1 ng/mL、4 ng/mL、15 ng/mL的水平對(duì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備分別進(jìn)行6次加標(biāo),通過處理檢測后得到黃曲霉毒素B1加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。加標(biāo)回收率超過85.0%,RSD處于2.8%~5.5%,見表2。

    2.4 實(shí)際樣品測定

    為對(duì)該方法實(shí)用性與可靠性展開驗(yàn)證,參照上述實(shí)驗(yàn)方法對(duì)2種能力驗(yàn)證樣品及3種市場糧油制品進(jìn)行前處理后,獲取黃曲霉毒素B1含量測定結(jié)果,見表3。根據(jù)兩種能力驗(yàn)證樣品中測定的黃曲霉毒素B1含量結(jié)果得知,Z比分?jǐn)?shù)為-0.83,|Z|≤2,結(jié)果滿意,證實(shí)了該方法的準(zhǔn)確性。以《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》(GB 2761—2017)中有關(guān)谷物及其制品、油脂及其制品中規(guī)定的黃曲霉毒素B1為5.0~20 μg/kg、10~20 μg/kg的安全限量為根據(jù),市場糧油制品測定結(jié)果中的黃曲霉毒素B1含量與國家安全限量標(biāo)準(zhǔn)相符合。

    2.5 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

    經(jīng)提取、凈化后的糧油制品,結(jié)合高效液相色譜法檢測黃曲霉毒素B1,獲取的結(jié)果與國家安全限量標(biāo)準(zhǔn)相符合,加標(biāo)回收率超過85.0%,RSD處于2.8%~5.5%。實(shí)際樣品檢測中,結(jié)果滿意,證實(shí)了方法準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好,可用于快速檢測糧油制品中黃曲霉毒素B1。

    3 討論與結(jié)論

    3.1 檢測方法選擇

    目前,可用于檢測黃曲霉毒素的方法有很多,如膠體金試紙條法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法、薄層色譜法及免疫親和柱-溴化熒光分光光度法等。其中,由于薄層色譜法會(huì)消耗大量溶劑,且重現(xiàn)性不太可觀,因此在檢測黃曲霉毒素中并不太適用[4]。膠體金試紙條法與酶聯(lián)免疫吸附法一般在快速篩查黃曲霉毒素中應(yīng)用,液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法能夠同時(shí)檢測多種真菌毒素,然而因本身需要使用過于昂貴的儀器,會(huì)產(chǎn)生較高的使用成本,故而也不太適用。免疫親和柱無需消耗太多有機(jī)溶劑,且特異性強(qiáng)、機(jī)制干擾少、靈敏度高,在多種復(fù)雜基質(zhì)樣品中適用,在精確定量及確認(rèn)黃曲霉毒素中十分適用[5]。因此,本試驗(yàn)在綜合對(duì)比多種方法的優(yōu)劣后,最終選擇了免疫親和柱凈化-高效液相色譜技術(shù)對(duì)糧油食品中的黃曲霉毒素B1展開測定。

    3.2 樣品前處理優(yōu)化

    實(shí)驗(yàn)室檢測樣品中黃曲霉毒素時(shí),在樣品前處理方面多以手動(dòng)凈化的方式為主[6]。但是該凈化方式涉及了過于煩瑣的過程,且會(huì)消耗大量時(shí)間,每天能夠完成的樣本處理量較少,面對(duì)較大樣品量時(shí)會(huì)暴露出人為因素影響大、時(shí)效性低等不足。而通過免疫親和柱在線凈化高效液相色譜法的應(yīng)用,能將上述不足有效彌補(bǔ),大幅提升檢測時(shí)效性,且能為檢測結(jié)果提供準(zhǔn)確性保障。

    3.3 流動(dòng)相選擇

    以標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.22—2016中洗脫程序?yàn)楦鶕?jù),以甲醇-乙腈和水、乙腈-水、甲醇-乙腈和0.5 mmol/L乙酸銨溶液為對(duì)象,對(duì)比流動(dòng)相組合洗脫效果[7]。其中,甲醇-乙腈洗脫效率更顯著,洗脫時(shí)間更短。通過乙酸銨溶液的添加,能獲取對(duì)稱性良好的峰型,出峰時(shí)間更穩(wěn)定,單個(gè)樣品測試時(shí)間更短。因此,在綜合對(duì)比多種流動(dòng)相的優(yōu)劣后,本實(shí)驗(yàn)中確定流動(dòng)相為甲醇-乙腈(50︰50)溶液和乙酸銨溶液(0.5 mmol/L)。

    3.4 提取劑選擇

    本次實(shí)驗(yàn)前對(duì)提取劑選擇甲醇-水溶液和乙腈-水溶液時(shí)的提取效果展開對(duì)比分析,分析得到兩者之間不存在明顯差異,確定提取劑為成本相對(duì)更低的甲醇-水[8]。

    參考文獻(xiàn)

    [1]李麗,吳宇,王海波,等.全自動(dòng)免疫親和固相萃取超高效液相色譜法測定糧油中黃曲霉毒素[J].中國糧油學(xué)報(bào),2020,35(7):165-172.

    [2]李宗師.糧油食品中黃曲霉毒素檢測技術(shù)研究[J].現(xiàn)代食品,2020(5):132-133.

    [3]唐志峰,盧錦永.糧油食品中黃曲霉毒素的檢測方法[J].現(xiàn)代食品,2017(1):80-81.

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    [6]田爾諾,杜馨,蔡俊.有機(jī)溶劑萃取-高效液相色譜法檢測玉米漿中黃曲霉毒素B1[J].食品工業(yè)科技,2018,39(23):267-271.

    [7]楊柳,王朝仁,楊黎耀,等.冷凍-離心凈化-高效液相色譜法測定植物油中黃曲霉毒素B1[J].中國糧油學(xué)報(bào),2020,35(1):169-175.

    [8]林玉娜,羅曉燕,朱惠揚(yáng),等.廣州市市售糧油食品中黃曲霉毒素B1的污染調(diào)查分析[J].醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制,2019,35(7):86-88.

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