大腸埃希氏菌熒光定量PCR法與酶底物法相關(guān)性分析

路曉鋒，吳 凡

(廣東粵港供水有限公司，廣東深圳 518001)

大腸埃希氏菌，屬于革蘭氏陰性短桿菌，鞭毛周生，能運(yùn)動，無芽孢，兼性厭氧生長，是人體和其他動物腸道中的正常寄居細(xì)菌[1-2]。但當(dāng)人體機(jī)體免疫功能降低時，這類細(xì)菌會表現(xiàn)出對人體的致病性，通常表現(xiàn)為腹瀉、腸炎等癥狀，因此，大腸埃希氏菌也被歸類為條件致病菌[3-5]。在水質(zhì)檢測領(lǐng)域，國內(nèi)外水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中通常把大腸埃希氏菌作為水體受糞便污染的檢測指標(biāo)。

國內(nèi)《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》(GB/T 5750—2006)中對大腸埃希氏菌的檢測方法包括多管發(fā)酵法、濾膜法和酶底物法，其中酶底物法檢測步驟最簡單，僅需在水樣中加入MMO-MUG培養(yǎng)基進(jìn)行24 h培養(yǎng)后即可得到大腸埃希氏菌的結(jié)果，目前已逐漸被廣泛采用。但檢測結(jié)果需要1 d，具有一定的滯后性，不能滿足水樣應(yīng)急檢測的需求。熒光定量PCR法通過提取大腸埃希氏菌的基因，利用設(shè)計(jì)好的大腸埃希氏菌靶標(biāo)基因引物進(jìn)行基因擴(kuò)增，以儀器讀取的熒光強(qiáng)度計(jì)算出基因的拷貝數(shù)，整個操作僅需1～2 h，且能對多個樣品進(jìn)行同步檢測，適合大批量的試驗(yàn)操作。樓秋雯等[6]進(jìn)行相關(guān)的方法研究，使用熒光定量PCR中的染料法對大腸埃希氏菌靶標(biāo)基因進(jìn)行定量檢測。由于染料法使用SYBR Green Ⅰ對雙鏈DNA結(jié)合后的熒光信號值進(jìn)行檢測判斷，同時對非特異擴(kuò)增的熒光信號也會進(jìn)行讀取，容易造成檢測結(jié)果的誤差。因此，本試驗(yàn)使用探針法檢測大腸埃希氏菌靶標(biāo)基因，提高檢測的特異性。對大腸埃希氏菌不同檢測方法的比較，陳樑[7]將熒光定量PCR法和濾膜法的檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)兩種方法的相關(guān)性較強(qiáng)。但大多數(shù)研究使用定性的結(jié)果進(jìn)行比較，沒有進(jìn)行定量，且目前針對水體中大腸埃希氏菌的熒光定量PCR法與酶底物法檢測結(jié)果的相關(guān)性研究仍較少，能否把熒光定量PCR法作為酶底物法的補(bǔ)充方法仍缺乏相關(guān)的數(shù)據(jù)支撐。

通過前期的試驗(yàn)，建立了針對大腸埃希氏菌靶標(biāo)基因gus的熒光定量PCR法，方法靈敏度高、檢測時間短，能批量進(jìn)行樣品檢測。在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步比較分析熒光定量PCR法和酶底物法的相關(guān)性，為熒光定量PCR法能實(shí)際應(yīng)用于水體中大腸埃希氏菌的檢測提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 設(shè)備和耗材

熒光定量PCR儀(美國伯樂)；恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒)；移液槍(德國艾本德)；高壓蒸汽滅菌器(雅馬拓)；生物安全柜(蘇凈安泰)；程控定量封口機(jī)(美國愛德士)；97孔定量盤(美國愛德士)；8連PCR管(美國伯樂)；純水機(jī)(密理博)；水浴鍋(常州朗越)；核酸分光光度計(jì)(美國賽默飛)；接種環(huán)。

1.2 菌種和試劑

大腸埃希氏菌(CMCC 44102，中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心)；酶底物法試劑盒(美國愛德士)；麥?zhǔn)媳葷峁茉噭┖?廣東環(huán)凱)；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱)；2×itaq Mix試劑盒(美國伯樂)；大腸埃希氏菌質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)菌株(上海生工)；質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(北京天根)；引物和探針(上海生工)，堿基序列如表1所示。

表1 大腸埃希氏菌熒光定量PCR檢測用引物和探針序列Tab.1 Primers and Fluorogenic Probes for Detection of Escherichia coli

1.3 樣品檢測

1.3.1 樣品制備與采集

(1)標(biāo)準(zhǔn)菌株模擬配水樣品

制備不同濃度梯度的大腸埃希氏菌模擬水樣樣品。對干粉菌株進(jìn)行復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)，第三代的培養(yǎng)物作為試驗(yàn)用菌株。使用接種環(huán)挑取培養(yǎng)后的菌落接種于肉湯培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)把肉湯培養(yǎng)物添加到1號麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)管內(nèi)，對照標(biāo)準(zhǔn)管的細(xì)菌濃度使用0.9%滅菌的生理鹽水進(jìn)行稀釋，麥?zhǔn)媳葷岬臉?biāo)準(zhǔn)對照如表2所示。以系列稀釋方式制備1、10、50、100、500、1 000、1 500、2 000 CFU/(100 mL)的大腸埃希氏菌系列樣品，每個梯度樣品各200 mL。對梯度樣品分別使用酶底物法和熒光定量PCR法進(jìn)行操作，兩種方法使用的樣品量均為100 mL。

表2 麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)對照Tab.2 McFarland Standards Control

(2)采集實(shí)際水樣樣品

采集不同來源的水源水各300 mL，分別使用100 mL水樣進(jìn)行熒光定量PCR法和酶底物法的比對試驗(yàn)，編號分別為1#水源水、2#水源水和3#水源水。同時，同步采集不同的出廠水(1#出廠水、2#出廠水和3#出廠水)各300 mL和不同的管網(wǎng)水(1#管網(wǎng)水、2#管網(wǎng)水和3#管網(wǎng)水)各300 mL進(jìn)行兩種方法的比對試驗(yàn)，每種方法使用水樣各100 mL，并分別在90 mL的3#水源水、3#出廠水和3#管網(wǎng)水中加入10 mL濃度為5 000 CFU/(100 mL)標(biāo)準(zhǔn)菌株，編號分別為4#含標(biāo)準(zhǔn)菌株水源水、4#含標(biāo)準(zhǔn)菌株出廠水和4#含標(biāo)準(zhǔn)菌株管網(wǎng)水。

1.3.2 酶底物法檢測大腸埃希氏菌

參照《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》(GB/T 5750.12—2006)4.3節(jié)中酶底物法操作進(jìn)行。

1.3.3 熒光定量PCR法檢測大腸埃希氏菌

使用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒對含標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)粒菌株提取質(zhì)粒DNA，用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，取10 μL液體作為檢測用的標(biāo)準(zhǔn)品DNA模板。使用快速法提取水樣樣品的DNA。對樣品進(jìn)行離心，10 000 r/min離心10 min，留取下層液體約5 mL，充分混勻后分次轉(zhuǎn)移到1.5 mL同一離心管中，7 500 r/min離心5 min收集菌體沉淀物，在沉淀物中加入10 μL的無菌水，充分混勻，100 ℃水浴10 min，水浴結(jié)束后12 000 r/min離心10 min，吸取上清液約10 μL作為檢測用的DNA模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

配置標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)濃度梯度，對提取的質(zhì)粒DNA使用核酸分光光度計(jì)進(jìn)行質(zhì)粒的濃度測定，核酸分光光度計(jì)在檢測前需使用滅菌的去離子水進(jìn)行調(diào)零。測定的質(zhì)粒濃度經(jīng)換算公式得出標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)，使用無菌水進(jìn)行10倍的逐級稀釋，制備成107、106、105、104、103、102、101Copies/μL這7個標(biāo)準(zhǔn)濃度，用于建立熒光定量PCR法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

配置熒光定量PCR反應(yīng)體系，具體含量如下：10 μmol/L的上游引物2.5 μL，10 μmol/L的下游引物2.5 μL，10 μmol/L的探針2.5 μL，2×itaq Mix試劑12.5 μL，DNA模板2 μL，無菌水補(bǔ)充至25 μL。反應(yīng)體系設(shè)置陽性對照和陰性對照，其中，陽性對照使用拷貝數(shù)為102Copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對照使用無菌水。

熒光定量PCR擴(kuò)增程序，95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，變性與延伸步驟循環(huán)40次，延伸階段讀取熒光信號，熒光通道選擇6-羧基熒光素(FAM)模式。

2 結(jié)果和討論

2.1 酶底物法檢測

對大腸埃希氏菌系列濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)水樣和實(shí)際水樣進(jìn)行酶底物法檢測，使用愛德士酶底物法檢測試劑盒，每個樣品使用量為100 mL，培養(yǎng)結(jié)束后使用366 nm紫外光光源照射，大腸埃希氏菌在光源下會顯示熒光，統(tǒng)計(jì)97孔定量盤中發(fā)出熒光的孔數(shù)，對照MPN表得出檢測結(jié)果，如表3～表5所示。

表3 大腸埃希氏菌酶底物法標(biāo)準(zhǔn)水樣檢測結(jié)果Tab.3 Detection Results of Escherichia coli by Enzyme Substrate Technique for Standard Water Samples

由表3可知，酶底物法檢測結(jié)果與比濁法測定的樣品濃度接近，相關(guān)系數(shù)r=0.99，表明酶底物法能較真實(shí)地反映濃度梯度范圍內(nèi)的樣品濃度。表4和表5是使用酶底物法應(yīng)用于水源水、出廠水和管網(wǎng)水的檢測結(jié)果，水源水、含標(biāo)準(zhǔn)菌株水源水、含標(biāo)準(zhǔn)菌株出廠水和含標(biāo)準(zhǔn)菌株管網(wǎng)水結(jié)果顯示，酶底物法能有效檢出含有大腸埃希氏菌的實(shí)際水樣，且檢測結(jié)果與含標(biāo)準(zhǔn)菌株水樣的理論濃度接近，可作為與熒光定量PCR法方法比對的可靠方法。

表4 大腸埃希氏菌酶底物法實(shí)際水樣檢測結(jié)果Tab.4 Detection Results of Escherichia coli by Enzyme Substrate Technique for Water Samples

表5 含標(biāo)準(zhǔn)菌株水樣檢測結(jié)果Tab.5 Detection Results of Water Samples Containing Standard Strains

2.2 熒光定量PCR法檢測

2.2.1 建立標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒對質(zhì)粒DNA進(jìn)行抽提，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，最后使用10 μL無菌水洗脫質(zhì)粒，對抽提的質(zhì)粒DNA使用核酸分光光度計(jì)進(jìn)行濃度檢測，質(zhì)量濃度為40 ng/μL，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)為2.01×1010Copies/μL，具體計(jì)算如式(1)[8]。對初始標(biāo)準(zhǔn)品使用無菌水稀釋后配置成系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品，先取5 μL拷貝數(shù)約為2.01×1010Copies/μL的初始標(biāo)準(zhǔn)品與5 μL無菌水混勻，此時標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)約為1010Copies/μL，再取10 μL拷貝數(shù)約為1010Copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品與90 μL無菌水混勻制備成拷貝數(shù)約為109Copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品。以相同10倍逐漸稀釋的方式制備成約107、106、105、104、103、102、101Copies/μL的系列標(biāo)準(zhǔn)品用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線用于樣品的定量，以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以儀器測定的熒光信號到達(dá)閾值時的循環(huán)數(shù)(cycle threshold,Ct值)為縱坐標(biāo)，其中Ct值即PCR擴(kuò)增反應(yīng)的次數(shù)，當(dāng)樣品的初始拷貝數(shù)越高，所需要的反應(yīng)次數(shù)越少，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。濃度梯度質(zhì)粒的擴(kuò)增曲線如圖2所示，橫坐標(biāo)為Ct值，圖上表示從基線到指數(shù)增長的拐點(diǎn)所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)，即擴(kuò)增曲線與水平基線相交點(diǎn)所對應(yīng)的橫坐標(biāo)的值；縱坐標(biāo)為相對熒光單位(relative fluorescence units,RFU)，表示經(jīng)PCR反應(yīng)后的信號強(qiáng)度，即被擴(kuò)增的產(chǎn)物量。

圖1 大腸埃希氏菌熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard Curve Recorded with the Real-Time PCR for Escherichia coli Detection

圖2 大腸埃希氏菌熒光定量PCR擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification Curves Recorded with the Real-Time PCR for Escherichia coli Detection

(1)

其中：Cn——標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)，Copies/μL，即每μL中大腸埃希氏菌gus基因的個數(shù)；

NA——阿伏加德羅常數(shù)，6.02×1023Copies/mol，即1 mol的拷貝數(shù)為6.02×1023Copies；

C——質(zhì)粒濃度，ng/μL，取40 ng/μL；

L——大腸埃希氏菌gus基因長度，1 811 堿基數(shù)(bp)，bp代表基因的長度；

660——每個堿基的物質(zhì)的摩爾質(zhì)量，g/(mol·bp)。

圖1的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Ct=-3.368 6x+39.041，相關(guān)系數(shù)r=0.999，擴(kuò)增效率為98.1%，擴(kuò)增效率表示PCR反應(yīng)對擴(kuò)增樣品的效率，理論上PCR反應(yīng)為指數(shù)增長，即反應(yīng)n次，對應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物增長為原來的2n，擴(kuò)增效率計(jì)算如式(2)[9]。不同擴(kuò)增曲線間的間隔明顯，可滿足標(biāo)準(zhǔn)曲線用于大腸埃希氏菌樣品的定量檢測。

(2)

其中：E——擴(kuò)增效率，一般在90%～110%；

k——標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的斜率。

2.2.2 大腸埃希氏菌熒光定量PCR法檢測

對大腸埃希氏菌系列濃度標(biāo)準(zhǔn)水樣和實(shí)際水樣進(jìn)行定量分析，每個樣品進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，通過檢測的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式，計(jì)算得出拷貝數(shù)濃度，最后經(jīng)體積換算出100 mL樣品的大腸埃希氏菌靶標(biāo)基因的拷貝數(shù)。具體檢測結(jié)果如表6和表7所示。

表6 大腸埃希氏菌熒光定量PCR法標(biāo)準(zhǔn)水樣檢測結(jié)果Tab.6 Detection Results of Escherichia coli by Fluorescence Quantitative PCR for Standard Water Samples

表7 大腸埃希氏菌熒光定量PCR法實(shí)際水樣檢測結(jié)果Tab.7 Detection Results of Escherichia coli by Fluorescence Quantitative PCR for Water Samples

大腸埃希氏菌熒光定量PCR檢測結(jié)果與比濁法檢測的菌液濃度無顯著性差異，兩者相關(guān)系數(shù)r=0.99，陰性對照與陽性對照結(jié)果準(zhǔn)確，表明用于大腸埃希氏菌靶標(biāo)基因gus的熒光定量PCR法能真實(shí)反映濃度梯度范圍內(nèi)的樣品濃度。從實(shí)際水樣的檢測結(jié)果分析，熒光定量PCR法對含標(biāo)菌的不同類型水樣及水源水均能檢出，且含標(biāo)菌樣品檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)菌株濃度相接近，表明熒光定量PCR法對實(shí)際水樣的檢測結(jié)果可靠。濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)水樣樣品和實(shí)際水樣樣品平行樣品間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在3%～16%和8%～16%，檢測方法的精密度較好，能滿足對大腸埃希氏菌的檢測要求。對于濃度在1～10 CFU/(100 mL)的樣品，熒光定量PCR法不能進(jìn)行檢測，所有檢測結(jié)果均為未檢出，方法適合應(yīng)用于50 CFU/(100 mL)及以上的樣品的定量檢測。

2.2.3 熒光定量PCR法與酶底物法相關(guān)性分析

將熒光定量PCR法與酶底物法的檢測結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性線性回歸分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 熒光定量PCR法與酶底物法線性回歸圖Fig.3 Linear Regression between Fluorescence Quantitative PCR and Enzyme Substrate Technique

由圖3可知，兩種方法的相關(guān)性系數(shù)r=0.99，表明兩種方法的相關(guān)性較好。如表8所示，將兩種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用配對t檢驗(yàn)方法進(jìn)行結(jié)果評價，分析結(jié)果表明，P=0.58>0.05，配對t檢驗(yàn)結(jié)果的絕對值|t|=0.56，小于t雙尾臨界值，表示兩組數(shù)據(jù)在α=0.05的置信水平上無差異。綜上，熒光定量PCR法能作為酶底物法的有效補(bǔ)充方法。

表8 熒光定量PCR法與酶底物法統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Tab.8 Statistical Analysis between Fluorescence Quantitative PCR and Enzyme Substrate Technique

劉渠等[10]使用總大腸菌群β-半乳糖苷酶編碼基因lacZ作為靶標(biāo)基因建立熒光定量PCR法，并與多管發(fā)酵法進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明含量為100 CFU/(100 mL)水平以上的總大腸菌群樣品，兩種檢測方法的相關(guān)性較高，相關(guān)性系數(shù)r=0.99。劉永軍等[11]使用通用引物熒光定量PCR法對5個地表水體的病原性腸桿菌進(jìn)行檢測，并與濾膜法檢測的總大腸菌群、菌落總數(shù)與糞大腸菌群的計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示熒光定量PCR結(jié)果與總大腸菌群、菌落總數(shù)與糞大腸菌群的濾膜法計(jì)數(shù)結(jié)果均呈顯著性正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為0.983、0.908、0.948。本研究對含量為50 CFU/(100 mL)的大腸埃希氏菌樣品建立熒光定量PCR法與酶底物法的相關(guān)性分析，結(jié)果表明在此濃度上的相關(guān)系數(shù)r=0.99，相比使用lacZ基因的總大腸菌群熒光定量PCR檢測結(jié)果，試驗(yàn)在更低細(xì)菌含量水平上達(dá)到較好的相關(guān)性，表明方法的靈敏度比以往的研究方法高。同時，使用針對β-葡萄糖醛酸酶編碼基因gus進(jìn)行大腸埃希氏菌熒光定量PCR法檢測，比使用通用引物對大腸菌群進(jìn)行檢測的相關(guān)系數(shù)更高，表明使用專一性引物比通用引物具有更高的準(zhǔn)確性。

在實(shí)際水質(zhì)檢測中，對于大腸埃希氏菌的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法均需要經(jīng)過至少24 h的培養(yǎng)基培養(yǎng)后才能得出檢測結(jié)果，不能滿足應(yīng)急檢測時檢測結(jié)果的及時性要求。從對比試驗(yàn)分析，可以采用熒光定量PCR法應(yīng)用于水體中大腸埃希氏菌的檢測，且熒光定量PCR法能在1～2 h內(nèi)得出檢測結(jié)果，能更好地適用于水體大腸埃希氏菌的應(yīng)急檢測需求。

3 結(jié)論

(1)使用熒光定量PCR法能檢測大腸埃希氏菌靶標(biāo)基因gus，檢測濃度在101～ 107Copies/μL具有較高的線性關(guān)系。

(2)熒光定量PCR法檢測濃度梯度的大腸埃希氏菌樣品時，檢測結(jié)果與比濁法的菌液濃度數(shù)值相接近；在實(shí)際水樣檢測中，對含有標(biāo)準(zhǔn)菌株的不同類型水樣及水源水均能檢出陽性結(jié)果，管網(wǎng)水與出廠水均為陰性結(jié)果，含標(biāo)準(zhǔn)菌株樣品檢測結(jié)果與理論濃度值接近。PCR陰性對照結(jié)果為未檢出，陽性對照檢測結(jié)果分別為105 Copies/μL和93 Copies/μL，與標(biāo)準(zhǔn)濃度100 Copies/μL相接近。以上結(jié)果表明檢測方法的準(zhǔn)確度高。濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)水樣與實(shí)際水樣平行樣品間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在3%～16%和8%～16%，檢測方法的精密度較好。方法適合于濃度在50 CFU/(100 mL)及以上樣品的定量檢測。

(3)熒光定量PCR法與酶底物法相關(guān)性分析，在系列濃度為50～2 000 CFU/(100 mL)的模擬水樣及實(shí)際水樣檢測中，兩種方法的相關(guān)系數(shù)r=0.99，相關(guān)性較好，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩種方法無顯著性差異，表明熒光定量PCR法能作為酶底物法的有效補(bǔ)充方法。