乳疾康納米微乳制劑治療乳腺增生小鼠的藥效學(xué)研究Δ

張 弦，趙 強(qiáng)，徐巧玲，丁 一，李 霞，唐華非，馬 瑞#

(1.解放軍第305醫(yī)院藥局，北京 100017； 2.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥學(xué)部，陜西 西安 710032)

乳腺增生在中年女性群體中具有較高的發(fā)病率，并與乳腺癌的發(fā)生有著密切關(guān)聯(lián)[1]。伴有非典型乳腺增生的女性，在10年內(nèi)發(fā)展為浸潤(rùn)性乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)約為4%～7%，在整個(gè)生命過(guò)程中發(fā)展為惡性腫瘤的概率增加4倍[2]。調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)女性乳腺增生的發(fā)生主要在30～40歲，近年來(lái)發(fā)病率呈逐步升高趨勢(shì)[3]。目前，乳腺增生的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，關(guān)于該病的治療方法多樣，西醫(yī)學(xué)認(rèn)為主要病因以內(nèi)分泌失調(diào)為主，通過(guò)心理和藥物干預(yù)，必要時(shí)采取手術(shù)進(jìn)行治療[4];國(guó)內(nèi)多采用中醫(yī)藥治療乳腺增生，其中中藥外用治療方法安全有效、無(wú)顯著不良反應(yīng)，易于被患者接受[5-7]。乳疾康納米微乳制劑是由丹參、黃芪、肉蓯蓉、葛根、山藥和玫瑰等多種中藥材制成的中藥復(fù)方制劑，采用恒低溫18 ℃破壁提取技術(shù)，保留了植物的有效活性成分，遞送載體為90 nm微乳技術(shù)組分，全方具有溫陽(yáng)活血、化痰軟堅(jiān)的功效[8]。本研究旨在對(duì)乳疾康納米微乳制劑治療乳腺增生小鼠的藥效學(xué)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 儀器

80-2型臺(tái)式低速離心機(jī)(上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；WH-2型振蕩器(上海滬西分析儀器廠)；Tanon5200型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；muLISKANMK3型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；JJ-12J型脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；RM2016型切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司)；JB-P5型包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；Nikon Eclipse CI型成像系統(tǒng)(日本尼康公司)；Centrifuge 5415R型4 ℃離心機(jī)(美國(guó)Eppendorf公司)；muLISKANMK3型磁力攪拌器(江蘇中大儀器科技有限公司)；KD-P型組織攤片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選取7～8周的SPF級(jí)雌性ICR小鼠30只，體重20～25 g(購(gòu)買(mǎi)于斯貝福，動(dòng)物合格證編號(hào)：NO.1103242011003580)，隨機(jī)分為5組，每組6只小鼠，分別為正常組、模型組和治療組[溴隱亭組(涂抹溴隱亭)、高劑量組(涂抹高劑量乳疾康納米微乳制劑)和低劑量組(涂抹低劑量乳疾康納米微乳制劑)]。

1.3 藥品與試劑

苯甲酸雌二醇(北京Solarbio公司，批號(hào)為E8430)；黃體酮注射液(浙江仙琚制藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字H33020828，規(guī)格為1 ml∶20 mg)；0.9%氯化鈉溶液(國(guó)藥集團(tuán)榮生制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字H20044024，規(guī)格為10 ml∶90 mg)；乳疾康納米微乳制劑(自制)；甲磺酸溴隱亭片(意大利DOPPEL Farmaceutici S.r.l.公司，注冊(cè)證號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字HJ20160030，規(guī)格為2.5 mg)；雌二醇(E2)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)為H102)；孕酮(P)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)為H089)；蘇木素-伊紅染色液(北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為DH0006)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為C1098)；抗小鼠Caspase-3抗體(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)為ab4051)；抗小鼠Bcl-2抗體(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)為ab182858)。

1.4 造模與實(shí)驗(yàn)方法

模型組和治療組小鼠分別腹腔注射苯甲酸雌二醇，劑量為0.5 mg/kg，隔日注射1次，連續(xù)30 d；正常組小鼠注射等體積0.9%氯化鈉溶液，周期為30 d[9]。給藥30 d后，模型組和治療組小鼠連續(xù)3 d腹腔注射黃體酮，劑量為0.5 mg/kg；正常組小鼠注射等量0.9%氯化鈉溶液。模型構(gòu)建成功后，治療組小鼠乳房涂抹不同劑量的乳疾康納米微乳制劑，1日2次，連續(xù)30 d；溴隱亭組小鼠涂抹溴隱亭，1日1次，連續(xù)30 d；模型組和正常組小鼠涂抹0.9%氯化鈉溶液，1日2次，連續(xù)30 d。

1.5 樣本收集和觀察指標(biāo)

動(dòng)物模型構(gòu)建過(guò)程中，每周觀察小鼠體重；末次給藥后，小鼠經(jīng)異氟烷呼吸麻醉后，腹部脫毛，游標(biāo)卡尺量取腹部第二對(duì)乳頭乳暈直徑、乳頭直徑；腹主動(dòng)脈采血，應(yīng)用生化檢測(cè)法測(cè)定血清中E2、P水平；乳暈基底部最大面積截取乳房，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，脫水，石蠟包埋，制備切片，采用蘇木精-伊紅(HE)染色觀察小鼠乳房組織病理變化，對(duì)乳房增生病理變化核心指標(biāo)進(jìn)行分析[10]；應(yīng)用TUNEL染色法觀察小鼠乳房組織細(xì)胞凋亡情況并進(jìn)行半定量統(tǒng)計(jì)分析；應(yīng)用免疫印跡(Western Blot)法檢測(cè)活化Caspase-3和Bcl-2蛋白變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 體重變化

注射苯甲酸雌二醇30 d后，與正常組比較，模型組小鼠的體重明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，溴隱亭組小鼠的體重明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，乳疾康納米微乳低劑量、高劑量治療組小鼠的體重均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組與正常組小鼠體重比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。這可能是因?yàn)槟Ｐ徒M小鼠體內(nèi)雌激素水平升高，導(dǎo)致小鼠代謝紊亂，而外用乳疾康納米微乳制劑能通過(guò)調(diào)理小鼠體內(nèi)雌激素水平，改善小鼠代謝水平。

表1 五組小鼠體重變化比較Tab 1 Comparison of changes of body mass among five

2.2 乳暈與乳頭直徑的變化

模型組小鼠注射苯甲酸雌二醇后，乳暈、乳頭直徑明顯增大，與正常組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，P<0.000 1)；治療組小鼠涂抹乳疾康納米微乳制劑30 d后，高劑量組小鼠乳暈、乳頭直徑較模型組明顯減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.001)，低劑量組小鼠與模型組的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.05)，見(jiàn)表2。表明乳疾康納米微乳制劑能顯著抑制小鼠體內(nèi)雌激素對(duì)乳腺的刺激作用。

表2 五組小鼠乳暈和乳頭直徑變化比較Tab 2 Comparison o changes of areola and nipple diameter among five groups of

2.3 血清E2、P水平變化

五組小鼠血清E2、P水平變化見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，與正常組比較，模型組小鼠血清E2水平顯著升高，P水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；溴隱亭組與模型組小鼠血清E2、P水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與模型組比較，高劑量組小鼠血清E2水平大幅降低，且P水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組小鼠血清E2水平降低，P水平升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說(shuō)明乳疾康納米微乳制劑能夠很好地調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)雌激素水平的變化，有效抵抗雌激素紊亂。

A.E2；B.P；與模型組比較，*P<0.05，***P<0.001；與正常組比較，###P<0.001A.E2；B.P； vs. the model group, *P<0.05, ***P<0.001; vs. the normal group, ###P<0.001圖1 五組小鼠血清E2、P水平變化Fig 1 Comparison of changes of serum E2 and P levels among five groups of mice

2.4 病理結(jié)構(gòu)變化

A.正常組；B.溴隱亭組；C.高劑量組；D.低劑量組；E.模型組；與模型組比較，*P<0.05，***P<0.001；與正常組比較，####P<0.000 1A.normal group; B.bromocriptine group; C.high-dose group; D.low-dose group; E.model group; vs. the model group, *P<0.05, ***P<0.001; vs. the normal group, ####P<0.000 1圖2 五組小鼠病理結(jié)構(gòu)變化(×100)Fig 2 Changes of pathogeny structure in five groups of mice (×100)

對(duì)各組小鼠乳房組織HE染色結(jié)果進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，正常組小鼠乳腺組織結(jié)構(gòu)正常，乳腺小葉形態(tài)規(guī)則，體積小，腺泡上皮細(xì)胞正常，乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞排列整齊，見(jiàn)圖2(A)。溴隱亭組小鼠乳腺組織結(jié)構(gòu)輕度異常，腺泡數(shù)量無(wú)明顯增多，腺腔無(wú)明顯擴(kuò)張，個(gè)別上皮細(xì)胞可見(jiàn)壞死，腺泡腺腔輕度擴(kuò)張，見(jiàn)圖2(B)。模型組小鼠乳腺組織結(jié)構(gòu)異常，乳腺小葉數(shù)量明顯增多，小葉體積較大，腺泡數(shù)增多，腺泡腔和腺導(dǎo)管腔擴(kuò)張，多囊呈篩狀，上皮細(xì)胞排列紊亂，部分上皮細(xì)胞壞死，胞核固縮深染，間質(zhì)水腫，纖維組織增生，見(jiàn)圖2(E)。與模型組比較，高劑量組小鼠乳腺組織結(jié)構(gòu)只有輕度異常，腺泡數(shù)量增多，上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，無(wú)明顯變性壞死，泡腺腔輕度擴(kuò)張，見(jiàn)圖2(C)；但是低劑量組小鼠的乳腺結(jié)構(gòu)仍異常，乳腺小葉腺泡數(shù)量較多，部分乳腺管腔擴(kuò)張，上皮細(xì)胞可見(jiàn)壞死變性，圖2(D)。對(duì)各組小鼠的病理結(jié)構(gòu)變化評(píng)分結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，模型組小鼠與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)；溴隱亭組小鼠與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；高劑量組小鼠與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2(F)。該結(jié)果提示，外用高劑量的乳疾康納米微乳制劑對(duì)乳腺增生具有良好的預(yù)后效果。

2.5 組織細(xì)胞凋亡情況

各組小鼠乳腺組織TUNEL染色結(jié)果顯示，正常組幾乎沒(méi)有觀察到凋亡細(xì)胞，見(jiàn)圖3(A)；溴隱亭組只有少量凋亡細(xì)胞，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)圖3(B)、圖3(F)；與正常組比較，模型組凋亡細(xì)胞數(shù)量急劇增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)，見(jiàn)圖3(E)、圖3(F)；高劑量組有部分凋亡細(xì)胞，但與模型組比較，凋亡細(xì)胞顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)圖3(C)、圖3(F)；與模型組比較，低劑量組凋亡細(xì)胞也有所減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)圖3(D)、圖3(F)。該結(jié)果說(shuō)明乳疾康納米微乳制劑在一定程度上還可以抑制乳腺組織上皮細(xì)胞凋亡。

A.正常組；B.溴隱亭組；C.高劑量組；D.低劑量組；E.模型組；與模型組比較，***P<0.001；與正常組比較，###P<0.000 1A.normal group; B.bromocriptine group; C.high-dose group; D.low-dose group; E.model group; vs. the model group, ***P<0.001; vs. the normal group, ###P<0.000 1圖3 五組小鼠組織細(xì)胞凋亡情況(×200)Fig 3 Cell apoptosis in five groups of mice (×200)

2.6 Casepase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)情況

各組Western Blot蛋白定量分析結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組的Caspase-3表達(dá)明顯降低(P<0.001)，Bcl-2的表達(dá)明顯升高(P<0.001)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而治療組分別與模型組比較，Caspase-3表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001，P<0.001)，Bcl-2的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.001，P<0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖4。該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，乳疾康納米微制劑可通過(guò)抑制乳腺細(xì)胞的凋亡，降低乳腺組織癌變概率。

與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與正常組比較，###P<0.001vs. the model group, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; vs. the normal group, ###P<0.001圖4 五組小鼠Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)水平Fig 4 Expression of Caspase-3 and the Bcl-2 protein in five groups of mice

3 討論

乳腺增生為女性人群高發(fā)疾病，其病理因素主要包括：(1)雌激素和孕激素比例失調(diào)，使乳腺實(shí)質(zhì)增生過(guò)度；(2)乳腺性激素受體異常，使乳腺各部分增生程度參差不齊；(3)催乳素水平升高，影響乳腺生長(zhǎng)、發(fā)育和泌乳功能[11]。中醫(yī)認(rèn)為，乳腺增生的病因是肝郁痰凝、沖任失調(diào)，病機(jī)多為因肝氣郁結(jié)或肝病犯脾，導(dǎo)致氣滯、血瘀、痰凝互結(jié)于乳房，形成腫塊或疼痛[12-13]。

乳腺增生組織癌變是一種多基因多分子共同參與的過(guò)程，涉及凋亡、壞死和氧化應(yīng)激等多種機(jī)制，其中Caspase-3和Bcl-2在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到重要調(diào)控作用，且與惡性腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)[14]。臨床研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌患者中，Caspase-3蛋白表達(dá)陽(yáng)性率顯著低于乳腺良性病變患者，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于乳腺良性病變患者。故Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)被作為臨床評(píng)價(jià)乳腺癌生物學(xué)行為及判斷預(yù)后的重要參考指標(biāo)[15]。

本研究采用性激素紊亂乳腺增生小鼠模型，研究中藥制劑乳疾康納米微乳制劑對(duì)乳腺增生及腫瘤相關(guān)蛋白的調(diào)控作用，結(jié)果顯示，乳疾康納米微乳制劑能有效調(diào)控內(nèi)分泌失調(diào)、雌激素紊亂所致體重增加，乳暈、乳頭增大，血清E2水平升高和P水平降低等病理變化，且相關(guān)療效呈劑量依賴趨勢(shì)，由此可以推測(cè)，該藥對(duì)機(jī)體性激素具有很好的平衡調(diào)控作用，可能與肉蓯蓉、葛根和玫瑰提取物的激素樣作用以及黃芪提取物抑制炎癥因子表達(dá)相關(guān)[16-20]。同時(shí)，使用乳疾康納米微乳制劑能顯著調(diào)控增生乳腺結(jié)節(jié)組織中凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3及Bcl-2的表達(dá)水平，因此具有一定程度的抑制增生乳腺結(jié)節(jié)癌變的作用。

綜上所述，乳疾康納米微乳制劑能顯著抑制由于激素紊亂而導(dǎo)致的小鼠乳腺增生及相關(guān)并發(fā)癥，并能夠一定程度抑制增生組織癌變進(jìn)程，其機(jī)制可能與其中多種有效成分的抗氧化作用及類(lèi)激素作用相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)可為中藥治療乳腺增生的研究和開(kāi)發(fā)提供前期的理論依據(jù)，但所有中藥組分的協(xié)同治療機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。