中草藥脫毒技術(shù)研究進(jìn)展

蔡時(shí)可，李靜宇，梅 瑜，顧 艷，徐世強(qiáng)，孫銘陽(yáng)，王繼華

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省道地南藥資源保護(hù)與利用工程中心，廣東 廣州 510640）

中醫(yī)藥極具中國(guó)民族特色，發(fā)展和推進(jìn)中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化是國(guó)家中長(zhǎng)期發(fā)展規(guī)劃目標(biāo),其中,中草藥是產(chǎn)業(yè)的基礎(chǔ)也是我國(guó)重要的戰(zhàn)略資源之一［1］。近年來(lái)，隨著中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，對(duì)中藥材種植業(yè)要求也越來(lái)越高，而種業(yè)是中藥材生產(chǎn)的源頭［2］。然而，在中藥材種植生產(chǎn)實(shí)踐中，由于植物病毒和病原菌等在中藥材體內(nèi)進(jìn)行傳遞及積累，導(dǎo)致其正常生長(zhǎng)受到抑制、甚至死亡，也是種性退化的主要原因，進(jìn)而制約種植效益的提升［3］。特別是多年生無(wú)性繁殖的中草藥品種，由于生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，受到病害侵染的機(jī)率高，生產(chǎn)上種源缺乏嚴(yán)格檢測(cè)容易帶毒，導(dǎo)致其農(nóng)藝性狀和藥效成分下降，影響藥農(nóng)的種植收益和中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

自然界中，植物花葉病是較為常見(jiàn)的植物病害。該病毒可導(dǎo)致植物葉片萎蔫，呈黃白色斑駁，破壞葉綠體的完整性，光合作用速率降低，影響植物正常生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致植株死亡。為解決這個(gè)問(wèn)題，生產(chǎn)上可以利用植物脫毒技術(shù)開(kāi)展健康種苗生產(chǎn)，對(duì)植物病毒和病菌進(jìn)行有效清除。其中，以花葉病為代表的植物病毒是植物種苗脫毒的主要目標(biāo)之一。病毒或病菌在莖尖等生長(zhǎng)迅速的組織內(nèi)由于繁殖速度低于植物細(xì)胞生長(zhǎng)而含量低。利用植物激素處理離體的莖尖可獲得完整的無(wú)毒植株。1952 年Morel 利用莖尖脫毒技術(shù)在感染花葉病毒的大麗菊得到無(wú)病毒植株，建立了植物組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)，并在生產(chǎn)上得到逐漸應(yīng)用［4］。目前，依托植物組培技術(shù)的脫毒方式是主要途徑，生產(chǎn)上可結(jié)合物理和化學(xué)處理，更為有效清除植株體內(nèi)的病毒和病菌，達(dá)到提純復(fù)壯、恢復(fù)種性、有效提高產(chǎn)量和品質(zhì)的效果。

近年來(lái)，植物脫毒技術(shù)已在甘蔗、草莓、馬鈴薯、甘薯和香蕉等植物上得到廣泛研究及應(yīng)用，有效推動(dòng)種苗的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。目前在部分藥用植物如半夏、菊花、地黃和百合等逐漸開(kāi)展應(yīng)用。植物脫毒技術(shù)可以恢復(fù)藥用植物的種性，純化種質(zhì)，緩解當(dāng)前中草藥種植過(guò)程中種苗混雜的現(xiàn)狀，與系統(tǒng)選育、工廠化育苗技術(shù)相結(jié)合，可有效提升中草藥的育種水平，加速良種的應(yīng)用，推進(jìn)中草藥種植的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，促進(jìn)中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。

1 中草藥脫毒方法

1.1 組織培養(yǎng)脫毒法

1.1.1 莖尖與珠芽培養(yǎng)脫毒法 自從Morel 獲得脫毒大麗菊以來(lái)，植物健康種苗得到廣泛研究與應(yīng)用［3］。其原理是利用病毒在寄主植物體內(nèi)不同組織和部位分布不均勻。其中，在分裂和組織生長(zhǎng)迅速的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)，同時(shí)也缺乏維管束系統(tǒng)的運(yùn)輸，病毒在胞間連絲傳遞的速率比較緩慢，病毒濃度積累低。因此，在靠近頂端分生組織，病毒濃度低，通過(guò)對(duì)莖尖剝離和培養(yǎng)，容易脫去病毒、細(xì)菌、真菌等，獲得無(wú)病毒植株［3，5］。但莖尖大小與莖尖脫毒成活率和脫毒效果密切相關(guān)，是影響植物脫毒效率的重要因素。大體積的離體莖尖外植體容易成活，但是含有病毒的風(fēng)險(xiǎn)大，太小，則不容成活［6］。莖尖培養(yǎng)具有脫毒效果好、變異率低的優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是取材部位有限和操作繁瑣。莖尖脫毒技術(shù)近年來(lái)在中草藥上應(yīng)用已取得一定的進(jìn)展。

半夏莖尖在植物激素處理下容易形成愈傷組織，脫毒研究也相對(duì)較多，已獲得多種脫毒健康半夏種苗。王寶霞等［5］利用濃度分別為1.5、2.0 mg/L 的6-BA 和2,4-D 處理半夏莖尖，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，并可一次性成苗，檢測(cè)結(jié)果表明TMV、CMV 和SMV 脫毒率均達(dá)到100%。李會(huì)等研究表明，掌葉半夏0.2～0.5 mm 的莖尖培養(yǎng)在MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)上添加1.0 mg/L 6-BA 和0.1 mg/L NAA 的培養(yǎng)基上，試管苗可以一次性誘導(dǎo)成功，成活率為53.3%，病毒脫除率為76.7%，而在培養(yǎng)基中附加247 mg/L NH4+可有效提高莖尖成活率至86.7%，移栽后成活率高達(dá)100%。MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+GA30.5mg/L 組合最有利于試管莖的形成和發(fā)育［6］。太子參的脫毒技術(shù)也較為成熟，一般取長(zhǎng)約0.5 mm、帶有1～2個(gè)葉原基的莖尖，以MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA 為出苗最優(yōu)培養(yǎng)基，培養(yǎng)40 d 出苗率可達(dá)到86.7%；而在1/2MS+1.5 mg/L IBA+0.5 mg/L IAA的培養(yǎng)基上，生根率達(dá)到93.3%；組培苗成活率為85.2%，定植成活率為100%，經(jīng)過(guò)目測(cè)法和指示植物鑒定法檢測(cè)，獲得不帶病毒組培苗，單株產(chǎn)量比傳統(tǒng)種根組培苗增產(chǎn)102.7%［7］。大量研究表明，離體莖尖的大小為0.2 mm 左右，在太子參脫毒率和成活率方面可以達(dá)到最優(yōu)［8］。

1.1.2 愈傷組織誘導(dǎo)脫毒法 單個(gè)莖尖通過(guò)器官發(fā)生途徑進(jìn)行增殖，擴(kuò)繁效率相對(duì)較低，而植物愈傷組織途徑的增殖更為有效。利用外源植物激素誘導(dǎo)植物器官或組織產(chǎn)生愈傷組織來(lái)誘導(dǎo)脫毒，再分化出芽并培養(yǎng)成為完整植株，經(jīng)病毒檢測(cè)篩選獲得無(wú)毒植株的方法，在生產(chǎn)中往往選擇病害較少的植物組織作為外植體，如莖尖、花藥和嫩葉等來(lái)提高脫毒效率。愈傷組織誘導(dǎo)脫毒技術(shù)現(xiàn)已在多種大田植物上獲得成功［3］。李松等利用甘蔗莖尖胚狀體脫毒苗快繁技術(shù)，在莖尖胚狀體分化苗增殖5 代后擴(kuò)繁 2 589 倍，對(duì)甘蔗宿根矮化病病菌的去除率為95%，而花葉病病毒的去除率達(dá)到100%［9］。目前，利用愈傷組織開(kāi)展脫毒中草藥種苗繁育的還不多。其中，利用2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA 的激素可誘導(dǎo)丹參葉片產(chǎn)生愈傷組織，最佳分化培養(yǎng)基配方為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，出芽率為90%；1/2 MS+0.5 mg/L IBA 適宜于試管苗生根，為解決丹參栽培中的資源和質(zhì)量問(wèn)題提供技術(shù)支撐［10］。但是，大中草藥愈傷組織的再生體系是研究的熱點(diǎn)，鎖陽(yáng)［11］、梔子［12］、川貝母等［13］等均有完整的再生體系，本研究室近年來(lái)也已獲得了廣藿香、穿心蓮、春砂仁和千里香的再生體系，為脫毒種苗的規(guī)?；a(chǎn)提供了技術(shù)支撐。

1.2 物理脫毒法

高溫和低溫處理可以鈍化植物病毒的活性，而化學(xué)試劑可以抑制病毒的復(fù)制，物理和化學(xué)處理法可用于植物脫毒研究，而這些方法可與組織培養(yǎng)的方法結(jié)合，大大提升脫毒的效率［3］。

1.2.1 熱處理脫毒法 和植物細(xì)胞相比，病毒的耐熱能力相對(duì)較弱，在高溫脅迫下容易失去活性，同時(shí)，適當(dāng)?shù)臒崽幚硪矔?huì)加快植物的生長(zhǎng)。因此，針對(duì)植物及病毒對(duì)溫度的敏感程度不同的特點(diǎn)，進(jìn)行特定的溫度和時(shí)間范圍處理，使植物病毒死亡或者鈍化，或者降低病毒擴(kuò)散速度，使其低于植物細(xì)胞分裂速度，容易在生長(zhǎng)點(diǎn)形成無(wú)病毒區(qū)域；再利用細(xì)胞全能性，將把不含病毒的生長(zhǎng)點(diǎn)進(jìn)行人工培養(yǎng)，可以獲得無(wú)毒植株［3］。近年來(lái)結(jié)合熱處理和莖尖培養(yǎng)法比一些單獨(dú)使用莖尖或熱處理果樹(shù)脫毒效果好。熱處理一般采用35～55 ℃的熱水或高溫蒸汽、高溫空氣，處理時(shí)間根據(jù)溫度的高低和外植體的種類(lèi)決定［3］。例如，38.5 ℃熱處理羅漢果組培苗10 d，可獲得完全脫毒的健康種苗［14］；半夏莖尖呈疊套型生長(zhǎng)，切取完整離體莖尖比較困難，采取高溫鈍化病毒結(jié)合莖尖脫毒的方法，將半夏的試管植株先采用高溫（38 ℃，40 d）處理，然后再切取莖尖，去除病毒效果明顯，脫毒率達(dá)到88.9%，是一種行之有效的方法和手段［15］。由于外植體成活率隨熱處理時(shí)間增加而降低，研究發(fā)現(xiàn)變溫處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)可有效提高外植體成活率和脫毒率。配合抗生素可進(jìn)一步加強(qiáng)抑制高溫條件下病毒的活性，極大地增加獲得脫病毒植株的成功率，采取高溫結(jié)合剝離莖尖脫毒的方法，再輔以抗生素的使用，可使病毒去除成功率高達(dá)85%以上［16］。

1.2.2 超低溫處理脫毒法 超低溫處理脫毒也是一種常用的植物脫毒方法，大多與植物組織培養(yǎng)技術(shù)配合使用，也是利用植物細(xì)胞的特定和病毒分布特點(diǎn)。植物莖尖和根尖的頂端分生組織的細(xì)胞具有排列緊密、體積小、無(wú)成熟液泡、細(xì)胞分裂和再生能力強(qiáng)的特點(diǎn)，由于細(xì)胞自由水含量低，細(xì)胞質(zhì)容易處于無(wú)定形狀態(tài)，在超低溫環(huán)境中也較易存活，存在病毒的可能性也較小。而生長(zhǎng)點(diǎn)周?chē)募?xì)胞大多為成熟的細(xì)胞，容易帶有病毒，由于液泡成熟而含有大量自由水，在超低溫環(huán)境中會(huì)形成樹(shù)枝狀冰晶，破壞細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡［3，17］。利用超低溫對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行選擇性殺傷，殺傷含有病毒的成熟細(xì)胞，得到病毒含量低的頂端分生組織，容易得到脫毒植株［3，17］。超低溫脫毒方法最早由Brison 使用，結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒方法，成功去除了李屬根狀莖上的李痘病毒，脫毒率達(dá)到50%，是單一使用莖尖剝離脫毒率 19%的2.5 倍［18］。目前常用的超低溫方法還發(fā)展出包埋干燥法、玻璃化法、小滴玻璃化法和包埋玻璃化法。低溫脫毒的流程包括：一是預(yù)處理，超低溫處理前，首先要對(duì)莖尖進(jìn)行脫水和干燥，增強(qiáng)莖尖對(duì)超低溫的耐受能力（可使用高濃度蔗糖的使其脫水，或者利用甘露糖、甘露醇和二甲基亞砜等保護(hù)劑，也可利用無(wú)菌風(fēng)干燥或玻璃化處理）；二是液氮超低溫處理（將莖尖置于液氮中），進(jìn)行選擇性殺死生長(zhǎng)點(diǎn)外圍細(xì)胞；三是冷凍處理的莖尖復(fù)蘇及再生；四是再生植株的繼代繁殖及相關(guān)檢測(cè)，得到無(wú)毒的健康植株。其中，低溫處理材料的狀態(tài)是脫毒成敗的關(guān)鍵因素，如外植體的大小、品種間的差異、外植體的生理狀況。因此，超低溫處理需要針對(duì)不同植物材料對(duì)脫水劑種類(lèi)、脫水劑濃度、脫水時(shí)間、脫水步驟進(jìn)行優(yōu)化［17］。以太子參莖尖為外植體，采用超低溫去除病毒方法，優(yōu)化了芽增殖誘導(dǎo)、叢生芽誘導(dǎo)、生根壯苗的適合條件，獲得了太子參規(guī)?；缂夹g(shù)。結(jié)果表明：超低溫處理1 h 后，太子參脫毒率可達(dá)90%以上；規(guī)模化組培育苗最適宜配方為初代培養(yǎng)基為改良MS+2.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA，繼代增殖培養(yǎng)基為改良MS+1.2 mg/L KT+0.5 mg/L NAA，壯苗生根培養(yǎng)基為改良MS+0.2 mg/L KT+1.5 mg/L AD-6+10%蛋白粉［19］。

超低溫處理、熱處理及莖尖培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合的綜合脫毒方法也逐漸應(yīng)用。靳慧潔等結(jié)合超低溫脫毒、莖尖培養(yǎng)及熱處理脫毒方法成功獲得了百合脫毒苗［20］。然而超低溫脫毒目前只應(yīng)用于十幾種植物，但廣泛應(yīng)用于植物材料的超低溫保存，已成功應(yīng)用于約200 種植物，其應(yīng)用前景非常廣闊［3，17］。超低溫脫毒處理?xiàng)l件比較嚴(yán)格，是限制該方法應(yīng)用的主要因素。因此，篩選出相對(duì)通用的超低溫處理方法將是未來(lái)研究的重點(diǎn)［17］。

1.3 化學(xué)物質(zhì)脫毒法

病毒抑制劑可通過(guò)不同的作用方式抑制和清除植物病毒，可用于中草藥的健康種苗生產(chǎn)。目前常用于組織培養(yǎng)的病毒抑制劑有三氮唑核苷（病毒唑）、9-（2-羥二氧）甲基鳥(niǎo)嘌呤、2-硫尿嘧啶、疊氮胸苷、5—二氫尿嘧啶（DHT）和雙乙酰-二氫-5=氮尿嘧啶（DA—DHT）等［3］。目前的研究表明，病毒唑的抑制效果相對(duì)較好，應(yīng)用也較為廣泛。這些藥物可以直接注射到帶病毒的植株上或者添加到植株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上用于植物病毒的清除［21］。采用莖尖培養(yǎng)和使用病毒抑制劑相結(jié)合的脫毒方法，對(duì)材料大小要求不嚴(yán)，則對(duì)于有些比較難脫除的病毒，采用病毒抑制劑結(jié)合熱處理和莖尖培養(yǎng)的方法使用，效果較好，如10 mg/L 病毒唑和熱處理（39 ℃處理15 d），對(duì)于東方百合的無(wú)癥病毒及百合斑駁病毒的脫毒率分別為55%和40%［22-23］。

在生產(chǎn)上中草藥的脫毒技術(shù)也逐步從莖尖培養(yǎng)、熱處理脫毒、冷凍脫毒、病毒抑制劑處理等單一脫毒方法，向2 種和3 種復(fù)合方法結(jié)合使用發(fā)展，逐步提高脫毒率；同時(shí)，培養(yǎng)條件的不斷優(yōu)化也逐步提高成苗率和繁殖率，提高工廠化和商品化規(guī)模，降低生產(chǎn)成本，促進(jìn)脫毒苗的生產(chǎn)應(yīng)用［5，24］。

1.4 病毒檢測(cè)技術(shù)

利用病毒學(xué)檢測(cè)方法來(lái)確定植物脫毒效果，在健康種苗的生產(chǎn)上，植物病毒檢測(cè)方法與有效的脫毒方法都非常重要。自1990 年起，建立了大豆黃葉病毒、馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯A 病毒、甘蔗花葉病等多種植物病毒的檢測(cè)方法。病毒檢測(cè)的方法也隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展不斷改進(jìn)，包括目測(cè)法、指示植物法、顯微鏡檢測(cè)、核酸檢測(cè)和免疫檢測(cè)等，這些方法在脫毒苗的檢測(cè)中各有優(yōu)劣。目測(cè)法是傳統(tǒng)上一直沿用的檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)單，但是這種方法依賴(lài)植株的病癥，因此需要較長(zhǎng)的時(shí)間，對(duì)一些未知的病毒很難檢出。指示植物法，對(duì)檢測(cè)的范圍有所增加，結(jié)果更為準(zhǔn)確，但也存在費(fèi)時(shí)，效率低的問(wèn)題。近年來(lái)隨著生物科學(xué)的迅猛發(fā)展，許多先進(jìn)的理化與分子檢測(cè)技術(shù)如免疫學(xué)方法，分子生物學(xué)方法等成為病毒檢測(cè)技術(shù)的常用的方法［21］。其中，依賴(lài)以核酸的病毒檢測(cè)技術(shù)主要有簡(jiǎn)并引物PCR 技術(shù)、免疫捕捉PCR 技術(shù)、多重PCR 技術(shù)、環(huán)狀等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和熒光定量PCR 方法等5 種。與其他方法相比，熒光定量PCR 方法的特異性強(qiáng)，靈敏度高適合高通量的檢測(cè)，因而適于廣泛應(yīng)用［21］。

在脫毒中草藥的檢測(cè)方面也是經(jīng)歷了從直觀到微觀的過(guò)程。早期，采用田間觀察法和指示作物法檢測(cè)亳菊病毒病，其中，黃瓜、中國(guó)枸杞、千日紅等為指示植物，但大多數(shù)病毒病癥狀為花葉、黃化、畸形，易與環(huán)境脅迫或生理病害混淆，因此田間觀察法具有一定的缺陷［25］。利用SMV、CMV、TMV 單克隆抗體和RT-PCR 方法對(duì)半夏無(wú)毒苗進(jìn)行病毒檢測(cè)，表明不同培養(yǎng)基對(duì)病毒的脫毒效果有影響。其中培養(yǎng)基H 對(duì)SMV、CMV 和TMV 的脫毒率達(dá)到100.0%;而培養(yǎng)基B所誘導(dǎo)的無(wú)毒苗脫毒不徹底［5］。太子參中的的主要病毒為蕪菁花葉病毒（TuMV）和蠶豆萎蔫病毒（BBWV）根據(jù) GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的 TuMV、BBWV 外殼蛋白（CP）基因核苷酸序列的保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物建立的雙重 RT-PCR 快速檢測(cè)方法可穩(wěn)定、準(zhǔn)確、靈敏地同時(shí)檢測(cè)TuMV 和BBWV［26］。目前中草藥脫毒苗的應(yīng)用還不多，檢測(cè)的重視程度還有待提高。

2 中草藥種傳病源

2.1 中草藥種傳病源

中草藥的病源主要有病毒、細(xì)菌和真菌，其中在百合、半夏、地黃和菊花中植物病毒的危害較為常見(jiàn)，如半夏病毒病、菊花病毒病、地黃病毒病等病毒病，而細(xì)菌病有廣藿香青枯病、廣藿香根瘤病等。生產(chǎn)上，百合由于長(zhǎng)期采用鱗莖、鱗片等營(yíng)養(yǎng)器官進(jìn)行無(wú)性繁殖，加之，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，導(dǎo)致病毒積累，種球種性退化嚴(yán)重，直接影響百合的品質(zhì)和產(chǎn)量，制約了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，在貴州銅仁、畢節(jié)等產(chǎn)地尤為突出［27］。目前報(bào)道的菊花病毒有10 余種，但不同的品種和種植區(qū)域病毒的種類(lèi)也有差異［25］。其中，在浙江省桐鄉(xiāng)侵染杭白菊的病毒病原為菊花病毒［28］。半夏的病毒種類(lèi)較多，且與種植地區(qū)和品種相關(guān)，病毒種類(lèi)主要有紫花苜?；ㄈ~病毒、馬鈴薯病毒、大豆花葉病毒、煙草花葉病毒、番茄斑萎病毒、黃瓜花葉病毒、南芥菜花葉病毒、彈狀病毒和魔芋花葉病毒等均有報(bào)道［5，15-16］，其中在來(lái)自浙江寧波、浙江蕭山、河北、安徽、四川南充、北京和江蘇豐縣七個(gè)地區(qū)的三葉半夏中均存在黃瓜花葉病毒或大豆花葉病毒，但野生三葉半夏的帶毒率明顯低于栽培三葉半夏［29］；同時(shí)，在三葉半夏中還有檢測(cè)到軟腐病原菌［29］。太子參的病毒病同樣普遍，在福建省閩東地區(qū)侵染病毒種類(lèi)有4 種：蕪菁花葉病毒、黃瓜花葉病毒、蠶豆萎蔫病毒和煙草花葉病毒［7］。煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、蠶豆萎蔫病毒和康乃馨意大利環(huán)斑病毒等在懷地黃上均有報(bào)道［30-31］。河北傳統(tǒng)藥材產(chǎn)區(qū)的丹參易感染黃瓜花葉病毒［32］。藏紅花的主要病毒有蕪菁花葉病毒、黃瓜花葉病毒、鳶尾花葉病毒、煙草脆裂病毒和菜豆黃花葉病毒［3］。

2.2 種傳病源危害現(xiàn)狀

植物病毒在入侵宿主后，在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制和傳播，干擾新陳代謝，最后使整株植物發(fā)病，甚至導(dǎo)致植物死亡，植物病毒素有“植物癌癥”之稱(chēng)，自然界中可侵染植物的病毒有600 余種，但缺乏病毒病的特效治療藥物，每年造成的經(jīng)濟(jì)損失約600 億美元以上［5，8］，已成作物產(chǎn)量和質(zhì)量降低的主要因素之一［33-34］。隨著中草藥的規(guī)模化人工種植，植物病毒的危害也日益嚴(yán)重。

病毒侵染人工栽培的半夏后，葉片皺縮呈斑駁、花葉、變小、沿脈變色，植株矮化及畸形等癥狀［5，15-16］。在羅漢果主產(chǎn)區(qū)90%以上的植株感染花葉病毒，給種植戶(hù)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［35］。菊花被病毒侵染后，影響植株生長(zhǎng)，導(dǎo)致植株矮小，花的直徑變小，葉片上出現(xiàn)斑點(diǎn)甚至壞死，在減產(chǎn)的同時(shí)還嚴(yán)重降低經(jīng)濟(jì)價(jià)值［25］。長(zhǎng)期來(lái)，太子參以種根無(wú)性繁殖，在產(chǎn)區(qū)往往因?yàn)檫B作和蚜蟲(chóng)傳毒，根內(nèi)的花葉病毒逐年積累，造成葉片光合作用變?nèi)?，太子參病毒病普遍發(fā)生，參根產(chǎn)量和質(zhì)量下降嚴(yán)重［7，36］。目前，太子參花葉病病情日趨嚴(yán)重，部分地區(qū)發(fā)病率高達(dá)60%～90%,每年平均減產(chǎn)22%［7］。太子參懷地黃病毒導(dǎo)致葉片呈現(xiàn)花葉、褪綠、黃化及畸形等典型病毒病癥狀；地下塊根表現(xiàn)為不能正常膨大、籠頭變長(zhǎng)和產(chǎn)量嚴(yán)重下降［30-31］。河北產(chǎn)區(qū)的丹參易感染黃瓜花葉病毒，產(chǎn)量及丹參酮含量大幅下降［32］?？糠智驘o(wú)性繁殖的藏紅花，積累病毒后使品質(zhì)及產(chǎn)量下降［3］。對(duì)脫毒植株進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用是防治植物病毒病最有效的途徑之一［19］。目前，植物病毒的剔除是利用植物脫毒技術(shù)開(kāi)展中草藥健康種苗生產(chǎn)的熱點(diǎn)。但與大田農(nóng)作物相比，中草藥的病害研究目前還相對(duì)落后。

3 脫毒技術(shù)在中草藥上的應(yīng)用

3.1 脫毒種苗的表現(xiàn)

植物病毒主要是通過(guò)植物營(yíng)養(yǎng)體的無(wú)性繁殖進(jìn)行傳播，并逐漸積累，長(zhǎng)期依賴(lài)無(wú)性繁殖的品種，由于體內(nèi)病毒大量積累，致使植物發(fā)生病癥，并導(dǎo)致種性退化，無(wú)法滿(mǎn)足中藥材生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展［24］。脫毒苗在種植早期不存在病毒的侵?jǐn)_，在生長(zhǎng)、抗性上要優(yōu)于傳統(tǒng)種苗，因此在產(chǎn)量、品質(zhì)上有很大的提升。目前對(duì)于一些中草藥病毒病害的防治還沒(méi)有特別安全有效的方法,而半夏脫毒苗的培養(yǎng)成為解決中草藥病毒病最經(jīng)濟(jì)、有效、安全的途徑［5］。

3.1.1 對(duì)生長(zhǎng)的影響 脫毒苗最直觀的表現(xiàn)在于其形態(tài)的變化，生長(zhǎng)速度加快，生長(zhǎng)勢(shì)明顯提高。脫毒半夏植株葉色綠、生長(zhǎng)健壯、整齊、抗病效果明顯，較未脫毒植株株高增加 0.7～1.7 cm，珠芽離地面高度增加0.2～0.3 cm［15］。麥冬脫毒苗分蘗快，分蘗數(shù)明顯增多，塊根數(shù)目增加［37］。脫毒懷地黃苗的株高、冠幅、葉片數(shù)、最大葉面積、功能葉片的光合色素含量、凈光合速率、蒸騰速率等各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于非脫毒苗、塊根膨大速度也明顯加快［38-39］。太子參的3 種組培脫毒種苗（即莖尖苗、愈傷組織苗、種子苗）的大田生長(zhǎng)速度均顯著優(yōu)于對(duì)照苗［36］。但是隨著種植代數(shù)的增加，植株在生長(zhǎng)過(guò)程中受到病毒的危害，生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)逐漸減少，需要重新脫毒。脫毒懷地黃一代、二代、三代、四代種苗的大田生長(zhǎng)葉片進(jìn)行了病毒檢測(cè)，一代和二代沒(méi)有感染病毒，從第三代開(kāi)始感染病毒，第三代的感染率為60%，第四代的感染率為100%［40］。

3.1.2 對(duì)產(chǎn)量的影響 脫病毒后的藥用植物產(chǎn)量明顯提高。杭白菊脫毒種苗在分枝數(shù)、有效花朵數(shù)、葉綠素相對(duì)含量參數(shù)方面與常規(guī)苗有顯著性差異，脫毒早小洋菊單產(chǎn)達(dá)490.1 kg/667m2，脫毒小洋菊單產(chǎn)達(dá)1 083.3 kg/667m2，分別增產(chǎn)11%和29%［28］。祁菊花脫毒后，菊花的花朵數(shù)增加，花的干物質(zhì)產(chǎn)量顯著提高，增產(chǎn)幅度為37%～50%［41］。脫毒微型半夏種莖播種后產(chǎn)生的C2 代與野生種莖相比具有顯著的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，產(chǎn)量達(dá)1 148.48 kg/667m2，增殖系數(shù)為5.74，產(chǎn)量是野生種的2.02 倍，與野生種莖相比產(chǎn)量具有顯著差異［42］。薄荷新品種阜油1 號(hào)脫病毒苗鮮草量增加3 654.15～7 564.35 kg/hm2；出油率提高0.3%～2.3%，在界首市、太和縣示范基地大田種植增產(chǎn)達(dá)30%［43］。盆栽麥冬脫毒苗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單株產(chǎn)量脫毒苗與未脫毒苗分別為4.87、3.36 g，產(chǎn)量增加44.9%［37］。太子參的3 種組培脫毒種苗參根產(chǎn)量均顯著優(yōu)于對(duì)照［36］。

隨著脫毒種苗在田間的種植，種苗的世代增加，病毒也會(huì)不斷在體內(nèi)積累，導(dǎo)致產(chǎn)量逐漸下降。脫毒懷地黃苗的塊根產(chǎn)量提高、品質(zhì)改善，增產(chǎn)幅度在77.35%以上［38］。脫毒懷地黃不同世代脫毒種苗在大田生長(zhǎng)中不斷感染病毒，脫毒一代、二代、三代、四代種苗單產(chǎn)、梓醇和毛蕊花糖苷含量均依次下降，其中單產(chǎn)分別為 5 603.90、4 359.50、3 992.50、3 258.20 kg/hm2［40］。

有些無(wú)性繁殖的品種，第一代脫毒種苗由于母體往往偏小，在第二代得到恢復(fù)，產(chǎn)量會(huì)增加。脫毒玄參子代高產(chǎn)試驗(yàn)中脫毒玄參產(chǎn)量比未脫毒玄參產(chǎn)量平均增產(chǎn)30%。三代、二代、一代種苗均較未脫毒種苗有顯著差異。并且三代種苗產(chǎn)量高于二代，二代高于一代，這可能是脫毒玄參在栽培中復(fù)壯引起［44］。從生長(zhǎng)發(fā)育（農(nóng)藝性狀、生理生化特性）、產(chǎn)量和品質(zhì)方面，對(duì)懷黃菊一代、二代、三代脫毒苗進(jìn)行比較研究，二代種苗產(chǎn)量最高、品質(zhì)較佳，為最佳種植代數(shù)。懷菊花脫毒苗規(guī)模化生產(chǎn)采用二級(jí)繁育技術(shù)體系［45］。因此，脫毒中草藥種苗在使用過(guò)程中既要注意病毒的檢測(cè)，確保使用無(wú)毒苗，同時(shí)也要比較不同世代的產(chǎn)量，發(fā)揮其增產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)。

3.1.3 對(duì)藥效分成含量的影響 中藥材有效成分的含量高低和穩(wěn)定性是其治療效果的基礎(chǔ)，也是中草藥種植的最基本的要求。脫毒種苗的后代生長(zhǎng)旺盛、整齊一致，在增產(chǎn)的同時(shí)，其穩(wěn)定性增加，有效成分也增加。半夏塊莖鮮汁中分離的半夏蛋白是半夏抗腫瘤和抗生育等藥理作用的有效成分，脫毒半夏塊莖中蛋白平均含量為2.86%，比常規(guī)的半夏塊莖中蛋白含量高0.3%［46］。脫毒‘早小洋菊’和‘小洋菊’中總黃酮和綠原酸含量高于常規(guī)苗，綠原酸含量高于藥典的規(guī)定［28］。脫毒懷地黃苗的塊根產(chǎn)量提高，品質(zhì)改善，增產(chǎn)幅度在77.35%以上，藥用成分梓醇含量提高了32.90%［38］。3 種太子參組培脫毒苗的參根氨基酸總量都明顯分別高于對(duì)照苗［36］。

3.2 脫毒種苗的現(xiàn)狀

3.2.1 健康種苗生產(chǎn)現(xiàn)狀 標(biāo)準(zhǔn)的脫毒種苗生產(chǎn)流程，是中草藥種苗脫毒質(zhì)量穩(wěn)定的基礎(chǔ)。相比果樹(shù)和花卉以及大宗農(nóng)作物，中草藥品種的特異性、當(dāng)前中草藥育種水平和種植規(guī)模限制了其應(yīng)用。組培技術(shù)是脫毒的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在保障種苗質(zhì)量的基礎(chǔ)上，對(duì)組培過(guò)程中培養(yǎng)參數(shù)的改良，相應(yīng)地降低了生產(chǎn)成本，可使中草藥種苗脫毒技術(shù)更為廣泛地推廣應(yīng)用，可以有效促進(jìn)中草藥的生產(chǎn)。改良地黃組培及快繁培養(yǎng)基配方，可降低試管苗生產(chǎn)成本47%左右，縮短繼代時(shí)間以及組培和常規(guī)營(yíng)養(yǎng)繁殖相結(jié)合，提高了快繁的速度和系數(shù)［47］。在目前育種水平低下的情況下，利用脫毒技術(shù)與組培工廠化育苗可以迅速開(kāi)展良種的選育和擴(kuò)繁。

中草藥種苗脫毒育苗流程：選取種性?xún)?yōu)良的健壯單株→確定所需脫毒病原菌的種類(lèi)→優(yōu)化病原物清除方法→選擇綜合方法進(jìn)行病原物的去除→根據(jù)脫毒品種建立相應(yīng)組織培養(yǎng)體系→叢生芽的誘導(dǎo)與增殖→外植體材料病原早期檢測(cè)→健康種苗增殖擴(kuò)繁→一級(jí)苗圃假植與擴(kuò)繁→大田一級(jí)種苗田擴(kuò)繁→病原檢測(cè)→合格種苗→大田二級(jí)種苗田擴(kuò)繁或在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用［48］。部分中草藥品種存在二代苗的產(chǎn)量高于原種，在生產(chǎn)上根據(jù)種苗生長(zhǎng)的特點(diǎn)選擇合適的世代苗作為種苗。其中，懷黃菊二代脫毒苗產(chǎn)量在三個(gè)世代中最高、品質(zhì)較佳，為最佳種植代數(shù)，在懷菊花脫毒苗規(guī)模化生產(chǎn)采用二級(jí)繁育技術(shù)體系［45］。脫毒苗的生產(chǎn)中要做好病蟲(chóng)害防控，嚴(yán)格開(kāi)展病毒的檢測(cè)，確保生產(chǎn)用種的質(zhì)量。

3.2.2 脫毒種苗的產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀 生產(chǎn)上使用的脫毒種苗作為生產(chǎn)用種的較為成熟，但是在中草藥上還不多，僅有菊花、半夏、地黃、羅漢果和太子參等進(jìn)行了生產(chǎn)試驗(yàn)。其中，健康種苗的成本是目前影響其規(guī)?；瘧?yīng)用的主要限制因素。高效的種苗生產(chǎn)體系對(duì)降低種苗生產(chǎn)成本至關(guān)重要，體系主要包括種植的基質(zhì)、肥料和密度等。在基質(zhì)方面，黃壤土使用方便，生產(chǎn)成本低，選用含水量在20%～30%的疏松黃壤土作為半夏組培苗的基質(zhì)易獲得高產(chǎn)，并且，基質(zhì)保持水分能力越強(qiáng)，產(chǎn)量越高，基質(zhì)保持水分能力越弱，產(chǎn)量越低［42］。同時(shí)，種苗的種植密度是影響中藥材產(chǎn)量最重要的因素，半夏組培苗種植密度大時(shí)，多小塊莖，少大塊莖；密度小時(shí)則相反。因此，在半夏微型塊莖繁殖生產(chǎn)時(shí)，需要增加移栽密度從而提高其繁殖的系數(shù)。在生產(chǎn)上脫毒種莖的適宜移栽密度為200 株/m2，其C2代產(chǎn)量可達(dá)1 148.48 kg/667m2，種苗增殖系數(shù)為5.74，產(chǎn)量是野生種的2.02 倍，具有顯著的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)［42］。懷地黃脫毒苗在生產(chǎn)上，其冠幅、葉片數(shù)和葉片面積隨著種植密度增加而減少。生產(chǎn)上其種植密度宜為20 000 株/667m2，其株高、產(chǎn)量和藥用成分梓醇的含量最高，鮮質(zhì)量為6 105.80 kg，干質(zhì)量為1 393.30 kg，梓醇含量2.86%［49］。脫毒懷地黃苗塊根產(chǎn)量提高、品質(zhì)改善，增產(chǎn)幅度在77.35%以上，藥用成分梓醇含量提高32.90%［38］。

脫毒種苗的生長(zhǎng)與營(yíng)養(yǎng)條件密切相關(guān)。在氮磷鉀復(fù)合肥1 687.5 kg/hm2，較適宜脫毒懷地黃苗的生長(zhǎng)發(fā)育，懷地黃苗的功能葉面積（8 月份）和冠幅（9 月份）最大，葉綠素總含量、凈光合速率和蒸騰速率也最高［50］。生產(chǎn)上脫毒種苗的產(chǎn)量根據(jù)中草藥品種的特性而增產(chǎn)的方式不同。其中，生育期延長(zhǎng)、植株生長(zhǎng)快、健壯、分叉多、花數(shù)多和單花干重高等是脫毒菊花苗增產(chǎn)的主要因素［41］。而杭白菊、祁菊花脫毒種苗在分枝數(shù)、有效花朵數(shù)、葉綠素相對(duì)含量、花的干物質(zhì)產(chǎn)量顯著性高于常規(guī)種，增產(chǎn)10%～50%［28，41］。麥冬脫毒苗盆栽結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其分蘗速度快，分蘗數(shù)增多明顯，有效塊根數(shù)增加，單株產(chǎn)量脫毒苗與未脫毒苗分別為4.87、3.36 g，產(chǎn)量增加44.9%［37］。通過(guò)莖尖和愈傷組織脫毒的太子參種苗，在種植過(guò)程中生長(zhǎng)速度和參根產(chǎn)量根氨基酸總量顯著優(yōu)于對(duì)照苗［36］。脫毒苗在生產(chǎn)上作為種苗，其存在后期重新感染病毒的風(fēng)險(xiǎn)，因此在脫毒苗的種植過(guò)程中脫毒苗的代數(shù)需要科學(xué)控制。其中，脫毒懷地黃種苗在大田種植過(guò)程中，前兩代沒(méi)有病毒感染，而從第三代開(kāi)始感染病毒，感染率達(dá)到60%，第四代則完全感染；并且隨著病毒感染率的上升，產(chǎn)量、梓醇和毛蕊花糖苷含量均依次下降，脫毒的優(yōu)勢(shì)喪失［40］。

4 展望

目前，很多中草藥品種都是通過(guò)無(wú)性繁殖方法進(jìn)行種苗培育，如丹參、半夏、菊花、地黃、春砂仁、羅漢果、紫菀、白芷和太子參等，由于多年的自繁自育，種苗培育缺乏科學(xué)指導(dǎo)和統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，大多數(shù)品種在種植過(guò)程中都已經(jīng)感染病毒或病菌。病毒和病菌往往和種苗伴生，加之，生產(chǎn)上缺乏高效的防治方法，帶毒種苗導(dǎo)致中草藥種植過(guò)程中管理困難和成本增加等危害，嚴(yán)重制約中草藥的標(biāo)準(zhǔn)化種植和種植效益的提升。健康種苗是提高這類(lèi)中草藥生產(chǎn)效益最為有效的方法之一。植物目前商業(yè)化的脫毒試管苗在果樹(shù)、蔬菜、花卉及藥用植物上的應(yīng)用已經(jīng)非常廣泛，并取得了良好的效益，如香蕉、木瓜、馬鈴薯、甘薯、草莓和金線蓮等。在中草藥的脫毒技術(shù)上可使用的傳統(tǒng)方法較多，但效率相對(duì)較低，而且個(gè)別病毒不能完全清除［37］。一般生產(chǎn)上基于莖尖組織培養(yǎng)的脫毒效果最為徹底，也得到越來(lái)越多的研究與應(yīng)用。隨著技術(shù)的發(fā)展，綜合脫毒方法在健康種苗上的應(yīng)用逐漸增加。其中，組織培養(yǎng)結(jié)合熱處理或病毒抑制劑處理將是健康種苗培育的有效途徑［3］。其中，組織培養(yǎng)技術(shù)要求較高，受到的限制因子較多，其中植物的遺傳特性、外植體的生理狀態(tài)和所清除病毒或病菌的種類(lèi)是影響脫毒效率的主要因素。培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基的組分、溫度和光照都直接影響組培苗的生長(zhǎng)和發(fā)育［38］。培養(yǎng)基組分也與脫毒的效率相關(guān)，含有高濃度6-BA 的培養(yǎng)基可加快半夏莖尖細(xì)胞的分裂速度，抑制了病毒向莖尖部位的移動(dòng)或積累而脫毒更加徹底［5］。因此，不斷改進(jìn)植物組培脫毒技術(shù)以適應(yīng)大規(guī)模的工廠化和商品化勢(shì)在必行。隨著中醫(yī)藥事業(yè)對(duì)中藥材需求的日益增加，推廣健康種苗是有利于中草藥種植的綠色種植和可持續(xù)發(fā)展。因此，應(yīng)加大中藥脫毒苗研制技術(shù)的投入，建立脫毒方法，提高脫毒和繁殖效率，降低生產(chǎn)應(yīng)用成本，提高種植者的效益。同時(shí)，加大中草藥健康種苗的大面積產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用和推廣，促進(jìn)中草藥種業(yè)的升級(jí)和中藥農(nóng)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展［37］。