枸樹干基腐朽病病原菌鑒定及其生物學特性研究

單金雪，李增平，張宇，王曉宇，胡真臻，朱清亮，陳獻鐳

摘? 要：2018年12月在海南省儋州市的枸樹活立木上發(fā)現(xiàn)一種由靈芝屬真菌引起的干基腐朽病，從病樹上采集新鮮的擔子果，組織分離法分離病原菌，對其進行科赫氏法則驗證，明確該菌為致病菌。采用ITS-SSU-LSU多基因聯(lián)合構建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過形態(tài)學特征及分子生物學鑒定為南方靈芝[Ganoderma australe （Fr.） Pat.]，生物學特性測定結果表明該病原菌在溫度條件為25～32 ℃范圍內(nèi)生長較好，最適溫度為28 ℃，適宜生長pH為4～7，最適pH為6，在CA、PDA、PSA培養(yǎng)基上生長狀態(tài)較好，最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，光照對病原菌菌絲的生長有抑制作用。

關鍵詞：枸樹;莖腐病;南方靈芝;生物學特性

中圖分類號：S763.7? ? ? 文獻標識碼：A

Identification and Biological Characteristics of Pathogen of Stem Rot of Broussonetia papyrifera

SHAN Jinxue， LI Zengping*， ZHANG Yu， WANG Xiaoyu， HU Zhenzhen， ZHU Qingliang， CHEN Xianlei

College of Plant Protection， Hainan University / Key Laboratory of Green Prevention and Control of Tropical Plant Diseases and Pests， Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract： In December 2018， a stem rot disease was found on Broussonetia papyrifera in Danzhou City， Hainan Province. Basidiocarps related to the disease were collected. The pathogenic pathogen was isolated by the conventional tissue separation method， and the pathogenicity was determined. The phylogenetic tree was constructed by ITS-SSU-LSU multi-gene combination. It was identified as Ganoderma australe by morphology and molecular biology. The results of biological characteristics showed that the pathogen grew well in 25-32 ℃， the optimal temperature was 28 ℃， the optimal growth pH was 4-7， and the optimal growth pH was 6. It grew well on CA， PDA and PSA medium， the optimal medium was PDA medium; light had inhibitory effect on the growth of mycelia of the pathogen.

Keywords： Broussonetia papyrifera; stem rot; Ganoderma australe （Fr.） Pat.; biological characteristics

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.027

枸樹（Broussonetia papyrifera）也稱為構樹，是桑科、枸樹屬的一種落葉喬木，高10～20 m，適應性強，具有喜光、速生、抗逆性強等特點。枸樹在我國大部分地區(qū)都有分布。由于其對灰塵、煙塵和高溫的高度耐受性，果實及根可入藥，嫩葉可作豬飼料等，枸樹被認為是生物群落多樣性中很重要的組成部分，并廣泛用于醫(yī)學、畜牧業(yè)、造紙等多個領域，具有很高的經(jīng)濟價值[1-3]。

目前關于枸樹病害的相關報道主要集中在葉部病害，主要有枸樹細菌性葉斑病[4]，由病毒引起的枸樹葉片卷曲病[5]，真菌病害有枸樹褐斑病[6]、枸樹葉片黑斑病[7]。尚未發(fā)現(xiàn)由靈芝屬真菌引起枸樹干基腐朽病的有關報道。筆者從海南儋州軍屯的枸樹活立木上發(fā)現(xiàn)一種由靈芝屬真菌引起枸樹干基腐朽病，從病樹莖干上采集新鮮的擔子果并進行分離培養(yǎng)，對分離得到的菌株進行鑒定，并完成致病性測定和生物學特性研究，為研究枸樹莖腐病的發(fā)病規(guī)律及防治技術等提供理論基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

于2018年12月31日從海南省儋州市軍屯的枸樹活立木莖基部采集到與病害相關的靈芝擔子果，分離病原菌，并對標本進行風干保存。供試植株為海南大學教學實習基地內(nèi)種植的1年生枸樹苗。

木屑培養(yǎng)基、PDA、PSA、CA、OMA、CMA、Richards、枸樹枝條浸汁培養(yǎng)基的配制方法參照文獻[8-10]。

1.2? 方法

1.2.1? 菌株分離? 在擔子果表面用浸濕無菌水的濕棉花輕輕擦拭，用滅菌手術刀切去表層，從新鮮露出的部分切取小塊組織移到PDA平板上培養(yǎng)，對生長出來的菌落進行純化，從多個生長形態(tài)相同的菌株中選取其中長勢較好的1株編號為GSJF001，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? 接種體制備? 從GSJF001菌落上挑取適量菌絲塊放置于袋裝木屑培養(yǎng)基內(nèi)，用報紙包裹放置于適宜溫度下培養(yǎng)30 d左右，待整個培養(yǎng)基布滿菌絲，用于致病性測定。

1.2.3? 致病性測定? 對枸樹幼苗的基部莖干表面噴灑70%酒精進行消毒，待表面干燥，用滅菌手術刀削去莖干表皮引起輕微傷口，將布滿病原菌菌絲的接種體緊貼傷口處，用保鮮膜進行捆綁固定，并用無菌水浸過的濕棉花進行保濕，相同操作接空白的接種體作為對照，每處理重復5次。每隔1周觀察枸樹長勢，并拍照。

1.2.4? 擔子果誘導? 從GSJF001菌落取少量菌絲塊置于瓶裝木屑培養(yǎng)基中，于常溫條件下培養(yǎng)，定期觀察菌絲生長情況。

1.2.5? 菌株鑒定? 依據(jù)文獻[11]對病原菌的擔子果進行表觀形態(tài)鑒定，用攝影生物顯微鏡對擔子果的顯微結構進行觀察、測量并拍攝圖片。將GSJF001菌株培養(yǎng)5 d后，提取其總DNA。采用通用引物ITS、小亞基（SSU）、大亞基（LSU）擴增基因序列（表1）。擴增產(chǎn)物純化、回收后，送鉑尚生物技術（上海）有限公司測序。將得到的有關序列在NCBI數(shù)據(jù)庫上進行比對，并提交，下載保存相關序列和登錄號（表2）。利用Sequence Matrix軟件進行序列拼接，使用MEGA 6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6? GSJF001菌株生物學特性測定? 在超凈工作臺上，用無菌打孔器（直徑5 mm）在生長5 d的病原菌菌落邊緣打取菌餅，將菌餅接種到不同處理條件的平板上，培養(yǎng)5 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

（1）不同溫度條件：將菌餅置于PDA平板上，分別置于15、20、25、28、30、32、35、40 ℃共8個溫度梯度下黑暗條件下培養(yǎng)。

（2）不同光照條件：將菌餅置于PDA平板上，分別置于黑暗、12 h光暗交替、完全光照3種不同光照條件下，28 ℃培養(yǎng)。

（3）不同pH條件：用1 mol/L HCL和1 mol/L NaOH將PDA培養(yǎng)基的pH分別調至2、3、4、5、6、7、8、9、10共9個梯度，制成平板后接入菌餅，于28 ℃恒溫黑暗條件下培養(yǎng)。

（4）不同培養(yǎng)基條件：將菌餅分別置于PDA、PSA、CA、OMA、CMA、Richards和枸樹枝條浸汁培養(yǎng)基下，于28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013和SAS 8.1軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和差異顯著性分析。

2? 結果與分析

2.1? 田間發(fā)病癥狀

枸樹發(fā)病初期，樹冠上的部分葉片失綠發(fā)黃，萎垂，脫落，繼而整株葉片失水萎蔫，樹冠稀疏，后期部分枝條在葉片脫落后枯死，病株生長不良，重病株整株枯死。病樹下部莖干和莖基部側面長出檐狀的褐色或黑褐色擔子果，內(nèi)部木質部組織出現(xiàn)白色腐朽，有時可見擔子果上表面覆蓋有一層黃褐色泥層狀的擔孢子粉（圖1）。

2.2? 致病性測定

接種GSJF001菌株50 d后，枸樹苗葉片失綠發(fā)黃，萎垂，長勢減弱，接種部位布滿白色菌絲（圖2A，圖2B），并長出形態(tài)相同的擔子果（圖2C，圖2D），對照株傷口愈合，內(nèi)部組織正常，長勢良好（圖2E）。從發(fā)病木質部再分離獲得與GSJF001相同的菌株，表明菌株GSJF001為致病菌。將GSJF001接種至瓶裝木屑培養(yǎng)基，5個月后長出的擔子果與從病樹采集到的擔子果形態(tài)特征相同（圖2F）。

2.3? 病原菌鑒定

2.3.1? 形態(tài)鑒定? 在PDA培養(yǎng)基上，GSJF001菌株的菌落呈現(xiàn)白色，菌絲為致密的絨毛狀（圖3A）。

擔子果一年到多年生，（10～12）cm×（22～24）cm，厚約3.5 cm，半圓形或扇形，有明顯的同心環(huán)棱或無，木栓質，無柄，無漆樣光澤，正面為褐色，反面灰白色，菌肉呈現(xiàn)肉桂色（圖3B，圖3C）。新鮮孢子為南瓜子形，雙層壁，褐色或淡褐色，大小為（5.3～6.6）?m×（8.5～11.3）?m（平均6.0 ?m× 10.0 ?m），頂端無色透明，擔孢子中央有一個較大的油滴;老熟擔孢子小端平截，無色部分消失，大小為（5.2～6.6）?m×（7.3～9.0）?m（平均6.1 ?m×8.3 ?m），雙層壁明顯，顏色略深（圖3D）。纏繞菌絲淺黃褐色，多分枝，大約呈直角，直徑2～3 ?m（圖3F）;生殖菌絲透明，薄壁，直徑3～6 ?m;骨架菌絲淺褐色，具樹狀分支直徑3～5 ?m（圖3G）。

2.3.2? 分子鑒定? 測序得到GSJF001菌株的rDNA-ITS序列為629 bp（登錄號：MW193047），在NCBI上進行BLAST比對，與登錄號為MN696209.1的G. australe相似性達99.68%;rDNA-SSU序列為1000 bp（登錄號：MW227479），與登錄號為MN747807.1的G. australe相似性達99%;得到rDNA-LSU序列593 bp（登錄號：MW227480.1），BLAST比對結果與登錄號為MN689633.1的G. australe相似性達99.31%。將3種序列進行拼接并聯(lián)合構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果表明GSJF001與G. australe聚為一類（圖4），結合形態(tài)學分析，菌株GSJF001被鑒定為南方靈芝（Ganoderma australe）。

2.4? 不同溫度、pH、光照條件對GSJF001菌株菌落生長的影響

溫度對GSJF001菌株生長的影響差異明顯，溫度條件在25～32 ℃時菌株生長狀態(tài)較好，在溫度28 ℃條件時生長最快，40 ℃時不生長。菌株GSJF001在pH為2和10時均不生長，pH為6.0時最適宜菌株的生長。菌株對光照條件較為敏感，在完全光照的條件下生長速度最慢，在12小時光暗交替條件下由于受光照的影響其生長速度也較黑暗條件下慢，在28 ℃全黑暗、pH為5的條件下最適宜GSJF001菌株生長。

2.5? 不同培養(yǎng)基對GSJF001菌株菌落生長的影響

GSJ001菌株在7種不同處理條件的培養(yǎng)基上菌絲生長速度和形態(tài)特征差異明顯，在PDA和CA平板培養(yǎng)基上生長最快，但在CA培養(yǎng)基上菌落菌絲不如PDA上濃密，故菌株最適生長培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基（表3）。

3? 討論

有關枸樹病害的研究報道主要包括細菌、真菌及病毒引起的葉部病害[4-7]，尚無枸樹莖腐病的報道。本研究對引起海南省儋州軍屯的枸樹干基腐朽病的病原菌進行形態(tài)學和分子生物學鑒定，結果表明該病原菌為南方靈芝[Ganoderma australe （Fr.） Pat.]，這是南方靈芝引起枸樹莖腐病的首次發(fā)現(xiàn)。南方靈芝是靈芝科靈芝屬的一種擔子菌，也是一種病原木腐真菌，它可以侵染許多闊葉樹的樹干和莖基部，引起白色腐爛，在嚴重的情況下，它可以導致樹木死亡。南方靈芝分布較廣泛，主要分布在華中、華東和華南地區(qū)[15]。國內(nèi)外關于南方靈芝的研究較多的是南方靈芝子實體的次生代謝產(chǎn)物和生物降解方面[16-18]，胡真臻等[19]和王曉宇等[20]研究報道了由南方靈芝引起的橡膠樹和油梨莖腐病。陳禮浪等[21]通過對海南木麻黃木腐菌調查，發(fā)現(xiàn)了包括南方靈芝在內(nèi)的6種病原靈芝木腐菌，包括南方靈芝。Ayin等[22]發(fā)現(xiàn)南方靈芝是引起關島木麻黃長勢下降的病原菌，但并未進行科赫氏法則驗證。Glen等[23]對馬占相思和其他熱帶樹木上根腐病相關的擔子果進行形態(tài)學特征和DNA序列鑒定，發(fā)現(xiàn)了多種病原靈芝菌，其中包括南方靈芝。

本文對枸樹莖腐病病原菌的生物學特性進行了研究，結果表明，該病原菌在25～32 ℃時生長狀態(tài)較好，28 ℃為病原菌最適培養(yǎng)溫度，黑暗條件下最有利于病原菌的生長，最適生長的pH為6.0，在7種不同培養(yǎng)基中菌絲生長狀態(tài)有所不同，在PDA、CA和PSA三種平板上生長狀態(tài)較好，且在PDA平板上菌絲生長狀態(tài)最好，生長速度最快，菌絲最為致密，這與王曉宇等[20]對南方靈芝生物學特性的研究基本相同。本研究中南方靈芝病原菌所導致枸樹發(fā)生莖腐病的癥狀與先前報道的南方靈芝引起的莖腐病大致相同，發(fā)病時都表現(xiàn)為樹冠稀疏，根莖部組織部出現(xiàn)白色腐朽，多雨季節(jié)長出擔子果，較為嚴重時，樹木死亡。

該病的防治應當以預防為主，并進行綜合防治。清除田間雜樹樁，定期檢查，及時清溝排除積水，對風害、寒害后受傷的樹木進行防腐處理，防止傷口受靈芝菌的侵染，對樹木基部莖干涂刷保護劑進行保護。一但發(fā)現(xiàn)病死樹要及時砍除病樹及挖除病根并燒毀。

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責任編輯：謝龍蓮