甘肅不同區(qū)域黨參多糖含量的提取方法與生物活性研究

徐美蓉 李曉蓉 丁文姣 陶海霞 漆永紅 李婷

摘要：通過正交試驗優(yōu)化了黨參中醇溶性多糖的提取工藝，并對其生物活性進行了研究。最佳提取條件固液比為1∶20，提取溫度為65 ℃，提取時間為4.5 h，為超聲波輔助提取，提取次數(shù)為2次，在這些條件下，黨參多糖的產(chǎn)率為26.25±1.02%。分析表明，黨參多糖中，總糖、蛋白質(zhì)、糖醛酸含量分別為805、31～66、2.1 g/kg。體外抗氧化實驗結果表明，在濃度為2 mg/mL時，黨參多糖對ABTS+、DPPH、和HO-具有良好的清除作用。對不同區(qū)域黨參多糖進行含量比較，認為降水量充足、冷涼的氣候、較高的海拔有利于糖分積累。

關鍵詞：黨參多糖;提取工藝;優(yōu)化;生物活性

中圖分類號：S567.5? ? ?文獻標志碼：A? ? ? 文章編號：1001-1463（2021）11-0004-08

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2021.11.002

Extraction Method and Biological Activity of Polysaccharides from Codonopsis pilosula in Different Regions of Gansu

XU Meirong 1， 2， LI Xiaorong 1， 2， DING Wenjiao 1， 2， TAO Haixia 1， 2， QI Yonghong? 3， LI Ting 1， 2

（1. Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China; 2. Animal Husbandary， Pasture and Green Agriculture Institute， Gansu Academy of Agricultrual Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China; 3. Institute of Plant Protection， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：The extraction process of alcohol-soluble polysaccharide on Codonopsis pilosula was optimized by orthogonal tests， and its biological activity was studied. The optimal extraction conditions were the ratio of solid-to-liquid was 1∶20 g/mL， temperature 65 ℃， extraction time 4.5 h， and ultrasonic assisted extraction cofactor and extraction number was two times， polysaccharide yield reached 26.25±1.02%. Chemical composition analysis showed that the total sugar， protein and glyuronate content of Codonopsis pilosula polysaccharide were 805 g/kg， 31～66 g/kg and 2.1 g/kg， respectively. In vitro antioxidant assays demonstrated that Codonopsis pilosula polysaccharide had good clearance on ABTS+， DPPH and HO- at a concentration of 2 mg/mL. By comparing the content of codonopsis pilotica polysaccharide in different regions， sufficient rainfall， cold climate and high altitude were conducive to polysaccharide accumulation.

Key words：Codonopsis pilosula polysaccharide;Extraction process;Optimization;Biological activity

黨參[Codonopsis pilosula（Franch.） Nannf.]適宜在土層深厚、質(zhì)地疏松、肥沃的涼爽濕潤環(huán)境中種植，主產(chǎn)于甘肅、山西、陜西、四川、湖北等省[1 ]，有潞黨、臺黨、鳳黨、紋黨、條黨及東黨等[2 - 3 ]。除臨床上使用于中藥飲片外，民間還常用于保健，用來燉肉、煲湯。作為藥食同源的中藥材，黨參所含的成分主要有多糖、皂苷、甾醇、三萜、生物堿、倍半萜及香豆素類等，其中多糖含量最多[2 - 8 ]。多糖通過提高抗氧化酶活性或清除有機體中的自由基從而表現(xiàn)出抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性的功能[9 - 11 ]，因此人們越來越關注天然植物多糖的提取和優(yōu)化，以獲得更高的產(chǎn)量和更強的生物活性，如連續(xù)提取[12 - 13 ]、纖維素酶輔助提取和超聲—微波協(xié)同提取[12 ] 。目前普遍采用的多糖提取方法主要是水提和乙醇沉淀[14 ]，但這種方法會損失部分醇溶性多糖。

黨參在甘肅屬于大宗中藥材。我們采用岷縣、渭源縣、西和縣3個不同區(qū)域、不同年間所產(chǎn)的黨參樣品，從中提取和純化醇溶性多糖（黨參多糖），并用單個條件優(yōu)化提取過程試驗和正交試驗設計，進行了黨參多糖在體外的抗菌和抗氧化活性的研究，以期為其實際應用提供參考。

1? ?材料和方法

1.1? ?材料

供試黨參采自甘肅省岷縣麻子川鎮(zhèn)、渭源縣會川鎮(zhèn)、西和縣洛峪鎮(zhèn)。抗壞血酸（Vc）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）購自Sigma-Aldrich（St.Louis，MO USA）。其他試劑均為分析純。

1.2? ?黨參多糖（CDP）的制備

將黨參低溫抽真空干燥并粉碎獲得均勻樣品。每種預處理樣品（5.0 g）用指定的固液比，提取溫度和提取時間（表1）。提取后，使用真空旋轉蒸發(fā)器在60 ℃濃縮上清液，并在4 ℃下加入4倍體積乙醇沉淀8 h以上，棄去沉淀物，除去乙醇收集上清液。經(jīng)透析（截流分子量，MWCO，600 Da）、超濾（MWCO，10 kDa）后的液體用真空冷凍干燥器凍干以獲得黨參粗多糖。黨參多糖產(chǎn)率計算公式如下：

CDP =（M1/M2）×100%

式中，CDP為多糖產(chǎn)率，M1為黨參多糖重量（g），M2為黨參稱樣量（g）。

1.3? ?單因素試驗設計

固液比、提取時間、提取溫度用黨參預處理粉末進行黨參多糖產(chǎn)量和時間單因素試驗設計。每個因素都為當其他因素保持不變時進行優(yōu)化。測定這些因子的初始常數(shù)值為固液比為1∶20（g/mL）、提取時間為3.0 h、提取溫度為70 ℃，提取次數(shù)為3次。每個試驗做3個平行。

1.4? ?黨參多糖提取的優(yōu)化

使用正交L9（4）3測試設計研究黨參多糖的最佳提取條件實驗。在目前的研究優(yōu)化方案中增加了輔助因子，包括微波輔助、熱水和超聲波輔助提取。因此，提取實驗分為4個因子和3個等級（表1），即固液比，提取溫度，提取時間和輔助因子。黨參多糖的產(chǎn)率是因變量。

1.5? ?黨參多糖的化學成分分析

用以葡萄糖為標準的苯酚-硫酸法測定總糖含量，用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量，用咔唑-硫酸法測定糖醛酸的含量[15 - 18 ]。

1.6? ?體外抗氧化活性

黨參多糖對DPPH自由基的清除活性根據(jù)張培等[19 ]的報告進行評估。根據(jù)陳林? 等[20 ]的方法，ABTS可用作評估黨參多糖抗氧化活性。通過Fen-ton反應對羥自由基清除活性進行評估[21 ]。將1.2制備的黨參多糖分別配制成濃度為2、4、6、8、10 mg/mL溶液，備用。

1.6.1? ?清除DPPH自由基能力的測定? ?稱取一定量的DPPH，用無水乙醇配制成0.04 mg/mL的DPPH溶液。分別取2 mL不同濃度（2，4，6，8 mg/mL）的多糖溶液，加入2 mL DPPH溶液，混合均勻。室溫放置30 min后，5 000 r/min離心10 min。取上清液于517 nm處測吸光值。用Vc作為陽性對照。樣品對DPPH自由基的清除率用以下公式計算：

DPPH清除率=[1-（A1-A2）/A0]×100%

式中，A0為2 mL無水乙醇+2 mL DPPH溶液的吸光值;A1為2 mL多糖溶液+2 mL DPPH溶液的吸光值;A2為2 mL多糖溶液+ 2 mL無水乙醇的吸光值。

1.6.2? ?清除ABTS自由基能力的測定? ?將 7 mmol/L ABTS溶液與 4.8 mmol/L 亞硫酸鉀溶液等體積混合，在室溫下避光放置 12～16 h，即得 ABTS 自由基儲備液。把ABTS自由基儲備液稀釋到734 nm 處的吸光度（A734）為 0.700±0.001，作為工作液。濃度為2、4、6、8、10 mg/mL多糖溶液分別稀釋為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，在10 mL 具塞試管中分別吸取稀釋后的粗多糖溶液 0.2 mL， 加入 3.8 mL ABTS 工作液， 搖勻后于室溫靜置 6 min，然后測定溶液的 A734值。通過下式計算粗多糖樣品對 ABTS 自由基的清除率，繪制 ABTS 自由基清除率（Y）與樣品質(zhì)量濃度（X）的關系曲線.

Y=[1-（B1-B2）/B0]X×100%

式中，B1為加入粗多糖溶液時的吸光度;B2 為等體積的蒸餾水代替 ABTS 溶液時的吸光度;B0為等體積的蒸餾水代替粗多糖溶液時的吸光度。

1.6.3? ?總還原能力的測定? ?在10? mL具塞試管中加入 0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 6.6）1.0 mL、1%（質(zhì)量分數(shù)）鐵氰化鉀溶液1.0 mL、分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的粗多糖溶液 0.25 mL， 混勻后在 50 ℃下反應 20 min，再加入10%（質(zhì)量分數(shù)）三氯乙酸溶液 1.0 mL， 振蕩混勻，4 000 r/min 離心 10 min。取上清 2.5 mL，再加入 2.5 mL 蒸餾水和 0.1%（質(zhì)量分數(shù)）氯化鐵溶液 0.5 mL，靜置 10 min， 待溶液由黃色變?yōu)樗{色后測定 700 nm 處的吸光度（A700）[22 ]?？瞻捉M以等體積蒸餾水代替粗多糖溶液。

利用 線 性 回 歸 方 程 y=0. 054x+0.044（R2=0.997）計算在上述測定方法下 A700= 0.485 時對應的樣品質(zhì)量濃度，以此表示還原能力[19， 23 ]。

1.6.4? ?對 O2-清除能力的測定? ?參照陳林? 等[20 ]的方法并作一定調(diào)整。分別準確吸取1.0 mL不同濃度的多糖溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL），加入9 mmol/L硫酸亞鐵溶液和水楊酸-乙醇溶液各1.0 mL，再加入8.8 mmol/L過氧化氫（H2O2）溶液1.0 mL，混勻后在37 ℃下反應1 h，于510 nm處測定吸光度。通過以下公式計算粗多糖樣品對羥自由基的清除率， 繪制羥自由基清除率 （Y） 與樣品質(zhì)量濃度（X） 的關系曲線。

Y=[1-（A1-A2）/A0]X×100%

式中：A0為樣品空白組吸光值;A1為樣品組吸光值;A2為對照組吸光值。

1.7? ?統(tǒng)計分析

所有值均表示為三個取樣地平均值±標準偏差（±標準差）。 用單因素方差分析（ANOVA）分析差異的顯著性。 通過t檢驗進行比較，置信水平P < 0.01為極顯著。

1.8? ?甘肅不同地區(qū)黨參多糖含量的比較

將2017 — 2019年采自岷縣麻子川鎮(zhèn)、渭源縣會川鎮(zhèn)、西和縣洛峪鎮(zhèn)的黨參粉末各稱取1.000 g，加入已編號的具塞試管中，按照正交試驗篩選出的提取工藝提取黨參多糖，進行含量測定和數(shù)據(jù)分析。

2? ?結果與分析

2.1? ?單因素實驗分析

試驗對黨參多糖得率的固液比、提取時間、提取溫度和提取次數(shù)等關鍵參數(shù)進行優(yōu)化分析。如圖1 A所示，固液比對黨參多糖得率的影響為1∶5～1∶30（g/mL），提取時間為3.0 h，提取溫度為70 ℃、提取次數(shù)為2次時，固液比從1∶5增加到1∶15，黨參多糖的提取率顯著提高，但從1∶15增加到1∶30時，提取率逐漸降低。這可以解釋為較大的固液比有利于更多目標組分浸出到水中，可以提高提取率。然而，大量的提取溶劑會導致能量浪費，工作量增加和多糖的損失。因此，選擇1∶15為最佳固液比，用于下一步試驗。

提取溫度是影響多糖提取率的重要因素之一[15 ]。設定固液比為1∶15 g/mL，提取時間3.0 h、提取次數(shù)2次的條件下，研究了提取溫度從50 ℃升高到90 ℃時對黨參多糖產(chǎn)率的影響。圖1 B表明，當提取溫度從50 ℃升高到70 ℃時，黨參多糖的產(chǎn)率迅速增加，而在70 ℃以上時黨參多糖的產(chǎn)率開始下降。有研究證明，高提取溫度可以提高多糖的溶解度和加速水溶性多糖的質(zhì)量傳遞，而過高的溫度可能導致多糖的氧化和熱降解，也是降低黨參多糖產(chǎn)量的主要因素。因此，試驗確定的最佳提取溫度為70 ℃。

提取時間是影響多糖提取率的另一個參數(shù)。在固液比為1∶15 g/mL、提取溫度70 ℃、提取次數(shù)2次的條件下，研究了不同提取時間對多糖產(chǎn)率的影響。如圖1 C所示，黨參多糖的產(chǎn)量在4.0 h時達到峰值，然后隨著提取時間的延長而降低。這是因為過度延長的提取時間會導致多糖的熱不穩(wěn)定或水解，這會降低多糖的產(chǎn)率[24 ]。因此，選擇4.0 h作為隨后黨參多糖優(yōu)化的最佳提取時間。

在固液比為1∶15 g/mL，提取溫度為70 ℃和提取時間3.0 h的條件下，測試了不同提取次數(shù)的多糖提取率，如圖1 D所示。隨著提取次數(shù)的增加，黨參多糖的提取率急劇增加，然后趨于平緩?？紤]提取率和試劑損耗，選擇提取2次為最佳提取次數(shù)。

2.2? ?正交試驗優(yōu)化黨參多糖萃取分析

熱水提取是最基本和廣泛使用的多糖提取方法。微波可以快速提高萃取溫度，提供更高的離子運動，這可能會顯著影響萃取效率，因此高效率的微波輔助提取也已被用于從各種植物材料中提取多糖[25 ]。超聲波輔助萃取利用空化氣泡的破裂會導致植物細胞壁的破壞，從而加速物質(zhì)從植物溶解到液體溶液中。與傳統(tǒng)的提取方法相比，可以在相同的提取時間和能量消耗下獲得更多的化合物，已被廣泛應用于從植物材料中提取制備各種生物活性化合物[10 ]。

黨參多糖提取的優(yōu)化結果見表2，黨參多糖的產(chǎn)率范圍為16.55%（A3B3C2D1）至25.65%（A1B3C3D3）。ki是每個因子的i水平下的測試結果的平均值，R是ki的范圍。R值與該因子對黨參多糖產(chǎn)率的影響呈正相關，可以看出固液比對黨參多糖提取結果的影響最大。最大值ki表明i是提取條件的最佳水平。在本研究中，黨參多糖提取的最佳組合為A2B3C3D3（固液比為1∶20 g/mL）、提取溫度75 ℃、提取時間4.5 h、輔助因子為超聲輔助提取的），在這些條件下，得出黨參多糖的產(chǎn)率為（26.25±1.02）%（N=3），高于A1B3C3D3的25.65%。

2.3? ?正交結果的方差分析

從方差分析結果可知（表3），提取過程中重要的因素是輔助因素、提取溫度、提取時間，固液比在黨參多糖上具有非顯著的相互作用，這與以前的數(shù)據(jù)一致。

2.4? ?黨參多糖的理化特性

純化后，黨參多糖中總糖、蛋白質(zhì)、糖醛酸的含量分別為805、31～66、2.1 g/kg，表明黨參多糖是含有少量蛋白質(zhì)和糖醛酸的中性多糖。

2.5? ?黨參多糖的抗氧化活性

從試驗結果可知，2 mg/mL的黨參多糖對ABTS+、DPPH、HO-的清除率分別為61.2%、90.3%、49.2%，而Vc作為陽性對照，在相同濃度下的ABTS+、DPPH、HO-清除率分別為99.8%、98.7%、83.2%。表明黨參多糖在體外具有優(yōu)異的抗氧化活性，并可在未來作為自由基抑制劑或清除劑。

DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，一般用于評估各種生物活性化合物的抗氧化活性[26 ]，以及ABTS自由基[19 ]?；钚匝酰≧OS）包括超氧陰離子和羥基自由基衍生自氧化代謝，主要產(chǎn)生于線粒體[19 ]。ROS通過在正常情況下參與各種信號轉導可以調(diào)節(jié)細胞生長，增殖和分化等，但ROS的過量產(chǎn)生會導致氧化應激并引起各種疾病[27 ]。而抗氧化劑在清除自由基和防止由它們引起的損害方面發(fā)揮重要作用，目前需要進行廣泛研究。

2.6? ?甘肅省不同產(chǎn)地黨參多糖的含量比較

從表4可知，3個不同產(chǎn)地黨參多糖含量從大到小依次為岷縣麻子川鎮(zhèn)、渭源縣會川鎮(zhèn)、西和縣洛峪鎮(zhèn);取樣時間為2017、2018、2019年。其中2017年降水較多，全年不同產(chǎn)地降水量為400～600 mm，2018、2019年各地降水量均少于2017年。

從表4可知，2017 — 2019年間，3個產(chǎn)地的黨參多糖含量差異較大，2017年產(chǎn)自岷縣麻子川的黨參多糖含量最高，為365 g/kg，2018年西和縣洛峪鎮(zhèn)最低，為287 g/kg。在3 a平均降水量下，可明顯看到岷縣麻子川的黨參多糖含量相比其他地區(qū)較高，都在330 g/kg以上，渭源縣會川鎮(zhèn)次之，西和縣洛峪鎮(zhèn)相對較低。這可能是由于光照、土壤、降水量以及海拔等條件不同造成的。渭源縣會川鎮(zhèn)、岷縣麻子川鎮(zhèn)氣候條件相對西和縣洛峪鎮(zhèn)冷涼，且土壤含有豐富的礦物質(zhì)，降水量足，冷涼的氣候及較高的海拔可能有利于糖分積累[28 - 31 ]。2017 — 2019年，降水量充足的年份多糖含量比降水量少的年份偏高。

3? ?結論

本研究通過單因素試驗和正交試驗設計優(yōu)化黨參多糖提取工藝，并對黨參多糖理化特性及抗氧化活性進行了研究。 黨參多糖提取的最優(yōu)試驗條件為固液比為1∶20 g/mL，提取溫度為75 ℃，提取時間為4.5 h，超聲輔助提取的輔助因子和提取次數(shù)為2次。在這些條件下，黨參多糖的產(chǎn)率為26.25±1.02%?；瘜W成分分析表明，黨參多糖中總糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸含量分別為805、31～66、2.1 g/kg。體外抗氧化試驗結果表明，在濃度為2 mg/mL時，黨參多糖對ABTS+、DPPH、HO-的清除率分別為61.2%、90.3%、49.2%，具有良好的清除作用。說明黨參多糖可以作為食品和醫(yī)藥行業(yè)的抗腫瘤和抗氧化劑補充劑。

研究還表明，土壤含有豐富的礦物質(zhì)、降水量充足、冷涼的氣候及較高的海拔可能有利于黨參的糖分積累。

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（本文責編：陳? ?珩）

收稿日期：2021 - 09 - 08

基金項目：國家重點研發(fā)項目（2018YFD0201100）;甘肅省重點人才項目（2019RCXM072）;甘肅省農(nóng)業(yè)科學院重點研發(fā)計劃（2020GAAS30、2020 GAAS25）。

作者簡介：徐美蓉（1978 — ），女，甘肅臨夏人，實驗師，碩士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測研究工作。Email：547101748qq.com。

通信作者：李曉蓉（1964 — ），女，甘肅景泰人，副研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測研究工作。Email：lxr870906@sina.com。