枯萎病拮抗菌JM-3對草莓連作土壤酶活性及微生物多樣性的影響

姜莉莉 武沖 武海斌 宮慶濤 孫瑞紅

摘要：前期分離得到1株草莓枯萎病高效拮抗菌JM-3，以其制備的固體菌劑處理草莓連作土壤，采用生理生化手段評價(jià)其對土壤酶活性的影響，同時(shí)采用高通量測序技術(shù)分析其對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的調(diào)控規(guī)律。結(jié)果表明，在盛果期，拮抗菌JM-3處理可提高草莓連作土壤的纖維素酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性。土壤微生物多樣性分析發(fā)現(xiàn)，拮抗菌JM-3處理的盛果期毛殼屬（Chaetomium）和腐質(zhì)酶屬（Humicola）相對豐度較高，表明其可在一定程度上提高土壤有益菌的含量。PCA結(jié)果表明，在盛果期和末果期，拮抗菌JM-3處理與多菌靈處理之間的距離較近，表明其群落結(jié)構(gòu)相似度較高。

關(guān)鍵詞：草莓;連作;拮抗菌;土壤酶;微生物多樣性

中圖分類號： S182;S188+.3;S668.406? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）22-0236-05

收稿日期：2021-03-19

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金（編號：ZR2019PC013）。

作者簡介：姜莉莉（1986—），女，山東煙臺人，博士，助理研究員，主要從事果樹植保研究。E-mail：j--lili@163.com。

通信作者：孫瑞紅，博士，研究員，主要從事果樹植保研究。E-mail：srhruihong@126.com。

草莓（Fragaria×ananassa Duch.）為薔薇科草莓屬多年生草本植物，其果實(shí)飽滿多汁、香氣宜人，深受消費(fèi)者喜愛，素有“水果皇后”的美譽(yù)[1]。近年來，隨著人民生活水平的提高，市場對鮮食草莓的需求量逐漸增大。在規(guī)?；a(chǎn)地區(qū)，由于輪作、倒茬困難，重茬普遍，草莓枯萎病等土傳性病害發(fā)生日益嚴(yán)重[2]。

草莓枯萎病是由半知菌亞門瘤座菌科鐮孢屬尖孢鐮刀菌草莓?；停‵usarium oxysporum f. sp. fragariae）侵染引起，它從根部侵染草莓維管束組織，阻礙養(yǎng)分物質(zhì)輸導(dǎo)，導(dǎo)致植株萎蔫死亡[3]。目前，對于該病害的防治仍以化學(xué)藥劑為主，而長期頻繁施用化學(xué)殺菌劑具有較高的環(huán)境生態(tài)代價(jià)和抗藥性風(fēng)險(xiǎn)[4]。生防菌防治植物土傳病害，無藥劑殘留風(fēng)險(xiǎn)，對環(huán)境友好，且能活化土壤，有助于作物健壯栽培[5]，已成為國內(nèi)外科研人員的研究熱點(diǎn)。筆者前期從山東省泰安市草莓枯萎病發(fā)生嚴(yán)重的設(shè)施草莓根際土壤中分離得到1株高效拮抗菌 JM-3，授權(quán)專利號為ZL201810272145.5，它對草莓枯萎病菌的平板對峙抑制率為57.42%，以其制備的固體菌劑對草莓枯萎病的90 d田間防效為80.00%，且可提高草莓果實(shí)的糖酸比，有助于提升草莓果實(shí)品質(zhì)，但其修復(fù)草莓連作土壤的生態(tài)機(jī)理尚未進(jìn)行系統(tǒng)研究。

微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中作用巨大，生防菌的大量投入必將對土壤酶活性、微生物多樣性及相對豐度等指標(biāo)產(chǎn)生影響[6]。生防菌與土著微生物的相互作用，對其防控效果的發(fā)揮也至關(guān)重要[7]。本研究通過生理生化手段評價(jià)枯萎病拮抗菌JM-3制劑對土壤酶活性的影響;采用高通量測序技術(shù)，系統(tǒng)分析該生防菌制劑處理草莓根際不同時(shí)間對草莓連作根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，探索該生防菌緩解草莓連作障礙的作用機(jī)制，對推動(dòng)草莓產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)取樣地位于山東省泰安市岱岳區(qū)房村鎮(zhèn)三棵樹草莓采摘園（35°58′123″N，117°12′13″E），屬溫帶氣候，全年平均氣溫12.8 ℃，降水量697 mm，日照時(shí)數(shù)2 527.1 h。土壤為棕壤土，連續(xù)種植草莓4年，土傳病害發(fā)生較重，土壤養(yǎng)分及理化性質(zhì)如表1所示。

表1 試驗(yàn)區(qū)土壤理化性質(zhì)

全氮含量（%）全磷含量（%）全鉀含量（%）堿解氮含量（mg/kg）硝態(tài)氮含量（mg/kg）速效磷含量（mg/kg）速效鉀含量（mg/kg）有機(jī)質(zhì)含量（g/kg）pH值

0.1370.0820.64011.1298.4101.1238.916.346.81

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2019年8月27日進(jìn)行土壤處理，共設(shè)3個(gè)處理：（1）以黃腐酸鉀、硅藻土等載體制備菌株JM-3菌體濃度為2×108 CFU/g固體制劑，按20 g/株拌土處理;（2）50%多菌靈可濕性粉劑1000倍稀釋液，按20 mL/株灌根處理;（3）空白對照，不做任何處理。每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)小區(qū)面積50 m2。隨機(jī)區(qū)組排列，處理間設(shè)空白保護(hù)行。

移栽3葉1心期章姬草莓幼苗，起壟、覆黑膜栽培，每壟2行，壟高40 cm，壟頂寬60 cm，壟底寬90 cm，壟溝寬20 cm，株距15 cm，定植密度12萬株/hm2，實(shí)施常規(guī)栽培管理。

1.3 樣品采集

分別于11月27日（初果期）、3月7日（盛果期）和5月7日（末果期）采集土壤。每個(gè)處理選取20個(gè)點(diǎn)，除去表層土壤后，以鉆土器打取5～15 cm土層土壤樣品，充分混勻。土樣過1 mm孔徑篩子后，分成2份。其中1份以干冰保存，用于高通量測定土壤微生物多樣性;另1份于4 ℃保存，用于測定土壤酶活性。

1.4 樣品測定與分析

1.4.1 土壤酶活性測定 土壤脲酶活性測定采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法，蔗糖酶活性測定采用3，5-二硝基水楊酸法[8]，酸性磷酸酶活性測定采用磷酸苯二鈉比色法[9]，纖維素酶活性測定采用蘇州格銳思土壤纖維素酶試劑盒（G0308F）。

1.4.2 土壤微生物多樣性測定 高通量測序分析由北京諾禾致源生物信息科技有限公司代理完成。采用CTAB法提取土壤基因組DNA，以瓊脂糖凝膠電泳檢測純度和濃度，并稀釋至1 ng/μL。分別采用帶Barcode 的16S V4區(qū)515F、806R和18S V4區(qū)528F、706R特異性引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，根據(jù)濃度等量混樣，以1×TAE 濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化，回收目的條帶。構(gòu)建文庫，經(jīng)過Qubit 定量和文庫檢測合格后，使用Thermofisher的Ion S5TMXL進(jìn)行上機(jī)測序。

剪切掉低質(zhì)量部分reads，拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列，去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)。利用Uparse軟件（v7.0.1001）進(jìn)行聚類分析，依據(jù)算法原則篩選OTUs代表序列。對OTUs序列進(jìn)行物種注釋，并分別在各個(gè)分類水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。以各樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理，基于此進(jìn)行后續(xù)的α-多樣性分析和β-多樣性分析。使用Qiime軟件（v1.9.1）計(jì)算Observed-otus、Chao1、Shannon、Simpson、ACE、Goods-coverage、PD_whole_tree 指數(shù)，使用R軟件（v2.15.3）繪制稀釋曲線，并進(jìn)行 α-多樣性指數(shù)組間差異分析。使用R軟件（2.15.3）繪制PCA圖。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL 2010和SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌JM-3對草莓連作土壤酶活性的影響

由圖1可知，對于土壤脲酶，在初果期、盛果期和末果期，拮抗菌JM-3處理的酶活性均略高于多菌靈藥劑處理和空白對照。對于纖維素酶，在盛果期，拮抗菌JM-3處理的酶活性遠(yuǎn)高于多菌靈處理和空白對照，末果期活性略低。對于酸性磷酸酶，在盛果期和末果期，拮抗菌JM-3處理的酶活性均高于藥劑處理和空白對照。對于蔗糖酶，在初果期和盛果期，拮抗菌JM-3處理的酶活性高于藥劑對照和空白對照。

2.2 拮抗菌JM-3對草莓連作土壤真菌多樣性的影響

由圖2可知，多菌靈處理的初果期曲霉屬（Aspergillus）相對豐度較高，盛果期根霉屬（Rhizopus）相對豐度較高，盛果期和末果期毛殼屬（Chaetomium）相對豐度較高。拮抗菌JM-3處理的初果期新赤殼屬（Neocosmospora）相對豐度較高，盛果期毛殼屬和腐質(zhì)酶屬（Humicola）相對豐度較高，末果期新赤殼屬和漆斑菌屬（Myrothecium）相對豐度較高。對照區(qū)盛果期新赤殼屬和漆斑菌屬相對豐度較高，末果期曲霉屬相對豐度較高。

2.3 拮抗菌JM-3對草莓連作土壤細(xì)菌多樣性的影響

由圖3可知，多菌靈處理的初果期酸桿菌（Acidibacter）相對豐度較高，盛果期鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）相對豐度較高。拮抗菌JM-3處理的初果期藍(lán)藻細(xì)菌（Unidentified_Cyanobacteria）相對豐度比較高，盛果期溶桿菌屬（Lysobacter）相對豐度較高，末果期鞘脂單胞菌屬相對豐度較高。對照區(qū)盛果期單胞菌屬（Arenimonas）和溶桿菌屬相對豐度較高，末果期酸桿菌相對豐度較高。

2.4 不同處理草莓連作土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的PCA分析

由圖4可見，在初果期，各處理間的真菌群落PCA 距離較遠(yuǎn)，其中CK與拮抗菌JM-3和多菌靈處理的距離更遠(yuǎn)，表明處理間的真菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。在盛果期和末果期， 各處理的真菌群落PCA

距離較近，其中拮抗菌JM-3處理與多菌靈處理之間的真菌群落距離較近，可以推測該拮抗菌對土壤真菌具有一定的抑制作用。

2.5 不同處理草莓連作土壤細(xì)菌菌群落結(jié)構(gòu)的PCA分析

由圖5可見，初果期各處理的細(xì)菌群落與盛果期和末果期的PCA距離較遠(yuǎn)，表明初果期的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與盛果期和末果期差距較大。盛果期和末果期的CK處理細(xì)菌PCA距離較近，表明草莓連作土壤在中后期的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化不大。

3 討論與結(jié)論

土壤酶由植物根系分泌和微生物代謝產(chǎn)生，參與土壤生物化學(xué)反應(yīng)過程和養(yǎng)分循環(huán)，是土壤中具有催化能力的一類生物活性物質(zhì)，也是影響土壤微生態(tài)環(huán)境的重要因素[10]。土壤酶是衡量土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的敏感指標(biāo)。生防制劑或化學(xué)藥劑的大量投入，必將對土壤酶活性產(chǎn)生影響。土壤脲酶催化酰胺化合物水解， 產(chǎn)生的氨是植物生長所需的重

要氮素來源。酸性磷酸酶催化土壤中的有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為植物可直接吸收的無機(jī)磷[11]。蔗糖酶又稱轉(zhuǎn)化酶，參與有機(jī)質(zhì)代謝過程，為植株生長提供能源[12]。纖維素酶可催化降解土壤纖維素，促進(jìn)土壤能量轉(zhuǎn)化[13]。劉麗等報(bào)道，接種根瘤菌和促生菌，可顯著提高大豆成熟期土壤的脲酶和蔗糖酶活性[14]。范琳娟等報(bào)道，以棉隆熏蒸處理草莓重茬土壤，土壤脲酶和磷酸酶活性分別降低201.00%和27.48%，并引起土壤肥力降低[15]。田給林等報(bào)道，草莓連作土壤滅菌后施用蚯蚓糞，可提高土壤脲酶活性，是緩解草莓連作土壤滅菌對草莓植株生長發(fā)育影響的有效措施[16]。曹丹等報(bào)道，生物有機(jī)肥可顯著提高草莓連作土壤脲酶、酸性磷酸酶和過氧化氫酶的活性[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在盛果期，拮抗菌 JM-3 處理可提高草莓連作土壤的纖維素酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性，在初果期和末果期影響不明顯，推測拮抗菌JM-3可促進(jìn)草莓連作土壤的能量和有機(jī)磷轉(zhuǎn)化。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成，促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)的分解和養(yǎng)分的吸收、轉(zhuǎn)化[18]。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡是造成草莓連作障礙的主要原因[15]。深入研究拮抗菌JM-3土壤處理后與土著微生物的互作關(guān)系，對于揭示該生防菌緩解草莓連作障礙的作用機(jī)制、開發(fā)新型生防制劑以及保障草莓可持續(xù)綠色生產(chǎn)等具有重要科學(xué)意義。曹坳程等報(bào)道，草莓田多年施用氯化苦熏蒸會導(dǎo)致細(xì)菌多樣性顯著下降，而真菌多樣性不受影響[19]。王廷峰等報(bào)道，玉米套作及秸稈還田處理后，草莓連作土壤微生物結(jié)構(gòu)由“真菌型”轉(zhuǎn)變?yōu)椤凹?xì)菌型”，增強(qiáng)了抵御病蟲害侵染的能力[20]。馬麗等報(bào)道，施用生物炭能夠增加連作草莓根際土壤微生物含量，促進(jìn)草莓根系生長[21]。陳哲等報(bào)道，以敵磺鈉和微生物肥料共同處理草莓連作土壤，可降低真菌多樣性，提高細(xì)菌多樣性及有益菌屬的豐度[22]。本研究以拮抗菌JM-3固體制劑處理草莓連作土壤，采用高通量測序分析發(fā)現(xiàn)，對于真菌而言，拮抗菌JM-3處理的初果期新赤殼屬（Neocosmospora）相對豐度較高，盛果期毛殼屬（Chaetomium）和腐質(zhì)酶屬（Humicola）相對豐度較高，末果期新赤殼屬和漆斑菌屬（Myrothecium）相對豐度較高，可見其可在一定程度上提高盛果期草莓連作土壤的有益菌含量。對于細(xì)菌而言，拮抗菌JM-3處理的盛果期溶桿菌屬（Lysobacter）相對豐度較高，末果期鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）相對豐度較高。主成分分析（PCA）結(jié)果表明，對于真菌，在盛果期和末果期，拮抗菌JM-3處理與多菌靈處理之間的真菌群落距離較近，推測該拮抗菌對土壤真菌具有一定的抑制作用;對于細(xì)菌，初果期的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與盛果期和末果期差距較大。盛果期和末果期的空白對照處理細(xì)菌群落PCA距離較近，表明草莓連作土壤在中后期的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化不大。

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