多黏類芽孢桿菌SWS-15玉米促生效果測定及其廢水發(fā)酵條件優(yōu)化

牛永艷 朱瑞清 毛婷 穆永松 白慧慧 王治業(yè)

摘要：多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）是一類具有植物促生效果和廣譜抗菌性的細菌。為篩選促生效果明顯的多黏類芽孢桿菌并實現(xiàn)菌劑制備，從好氧污泥中分離出1株多黏類芽孢桿菌SWS-15，通過玉米苗盤試驗驗證其促生效果，并應(yīng)用Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化利用粉絲廠廢水發(fā)酵多黏類芽孢桿菌菌劑的條件。結(jié)果表明，菌株SWS-15發(fā)酵液中存在玉米素、赤霉素、生長素等促進植物生物的調(diào)節(jié)激素，多黏類芽孢桿菌SWS-15處理組的玉米株高和冠徑相對于空白組均顯著提高。響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果表明，在粉絲廠廢水濃度為63.42%，初始pH值為 7.85，溫度為36.05? ℃時發(fā)酵24 h，可獲得SWS-15菌劑的最大活菌數(shù)6.6×109 CFU/mL。因此，多黏類芽孢桿菌SWS-15發(fā)酵菌劑不僅可以有效促進玉米苗期生長，而且使粉絲廠廢水實現(xiàn)資源化利用，具有開發(fā)應(yīng)用的前景。

關(guān)鍵詞：多黏類芽孢桿菌;玉米;促生;廢水發(fā)酵;發(fā)酵條件優(yōu)化;廢水利用

中圖分類號： S513.06? 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）22-0204-06

收稿日期：2021-07-05

基金項目：甘肅省科學(xué)院應(yīng)用研究與開發(fā)項目（編號：2018JK-04）;甘肅省科學(xué)院創(chuàng)新團隊項目（編號：2019CX004-1）。

作者簡介：牛永艷（1991—），女，甘肅武威人，碩士，助理研究員，從事環(huán)境微生物修復(fù)、農(nóng)牧廢棄物生物處理等研究。E-mail：niuyy2014@lzu.edu.cn。

通信作者：王治業(yè)，碩士，研究員，從事微生物資源整理、整合，功能性微生物菌劑及農(nóng)牧廢棄物資源處理利用等研究。E-mail：zhiye_wang@sina.com。

近年來，多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）因其植物促生作用以及生物防治作用備受關(guān)注[1-2]。多黏類芽孢桿菌主要通過產(chǎn)生植物促進激素，促進植物根尖吸收養(yǎng)分，促進光合作用等機制促進植物生長，并在玉米、生菜、甜菜及菜豆等農(nóng)作物上證明了其顯著的促生效果[1，3]。李銘東等研究證明，30 kg/hm2的多黏類芽孢桿菌菌劑與化肥共同施用比單獨施用化肥的玉米增產(chǎn)17.68%[4]。除此之外，多黏類芽孢桿菌在番茄[5-6]、黃瓜[7]、生菜[3]和辣椒[8-9]等作物的種植過程中還具有廣譜抑菌性[6]，對細菌性、真菌性以及線蟲等植物病害均有防治效果。因此，高品質(zhì)、低成本的多黏類芽孢桿菌菌劑發(fā)酵工藝表現(xiàn)出廣大的市場需求和應(yīng)用前景。

甘肅省張掖市銀河粉絲廠年產(chǎn)5 000 t粉絲、1 000 t 淀粉，同時也產(chǎn)生了大量含有淀粉和蛋白質(zhì)的廢水，造成了嚴重的水體污染和資源浪費。目前，對于粉絲廠的廢水資源化利用主要集中在蛋白質(zhì)的提取回收方面，而忽略了水資源的利用[10-11]。本研究分離鑒定出1株多黏類芽孢桿菌，驗證其植物促生效果，同時以粉絲廠廢水為底物進行多黏類芽孢桿菌菌劑的發(fā)酵，對發(fā)酵參數(shù)進行優(yōu)化。菌劑發(fā)酵不僅以廢水蛋白質(zhì)為微生物生長氮源，而且將水資源用于農(nóng)業(yè)灌溉，實現(xiàn)了粉絲廠廢水的全面利用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株來源為污水處理廠好氧污泥;粉絲廢水由甘肅省張掖市銀河粉絲廠提供。

1.2 菌株分離鑒定

取 1 g 好氧污泥于 100 mL 的無菌生理鹽水中，180 r/min振蕩30 min，使之充分混勻。取上清液100 μL接種到營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基上，在30 ℃培養(yǎng)1～2 d。當(dāng)培養(yǎng)基上長出菌落時，用接種環(huán)挑取長勢較好的單菌落進行劃線，繼續(xù)在30 ℃培養(yǎng)1～2 d，重復(fù)這一步驟直到得到單菌落。挑取單菌落接種到 5 mL 營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)2 d，取1 mL菌液與1 mL 50%甘油混合于-80 ℃凍存，剩余菌液用BIO MPure 細菌DNA提取試劑（加拿大）提取總DNA，送北京奧科進行16S rRNA測序，將測序結(jié)果在NCBI 的 Blast 軟件上進行相似性比對，并運用MEGA 5.1軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹[12]。

1.3 菌株發(fā)酵液植物激素測定

測定促進植物生長的玉米素（ZA） 、赤霉素（GA3） 、吲哚-3-乙酸（IAA）等植物激素的含量，以及抑制植物生長的植物激素脫落酸的含量[13-14]。菌株接種到100 mL營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48 h后，精確稱取0.2 g樣品，加入 2 mL預(yù)冷的 80%甲醇，勻漿，保鮮膜密封后于 4 ℃冷浸過夜，4 ℃ 5 000 r/min 離心 10 min，取上清液，殘渣繼續(xù)用 80%甲醇萃取，振蕩，超聲 2 次合并上清液，4 ℃氮吹至水相。加入 2 mL石油醚脫色 3 次，水相用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，4 ℃氮吹至干，加入pH值為3.5的乙酸溶液，過 C18 小柱凈化，用甲醇洗脫，收集洗脫液 4 ℃減壓至干燥，用流動相溶解定容、過 0.22 μL 濾膜，待測。檢測儀器為高效液相色譜儀（HPLC）;測試色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm;5 μL） 進樣量為10 μL;波長為254 nm;流速為1.0 mL/min;流動相為甲醇 ∶乙酸水溶液（pH值為3.6）=20 ∶80 （體積比）。

1.4 菌株對玉米種子發(fā)芽指數(shù)影響的測定

菌株SWS-15發(fā)酵48 h后，取10 mL發(fā)酵液，置于250 mL錐形瓶中，用去離子水稀釋10倍、50倍、100倍3個濃度梯度，搖勻，靜置 0.5 h 后，取上清液于預(yù)先安裝好濾紙的過濾裝置上過濾，收集過濾后的浸提液備用。試驗以蒸餾水為參比溶液。在9 cm培養(yǎng)皿中墊上2張濾紙，均勻放入10粒大小基本一致、飽滿的玉米種子，加入浸提液5 mL，蓋上皿蓋，在25 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計發(fā)芽率和測量根長[12-13]。試驗以報道中具有玉米促生效果的解淀粉芽孢桿菌[14]發(fā)酵液為參照，以空白培養(yǎng)基為對照組（CK-培養(yǎng)基）。

種子發(fā)芽指數(shù)（GI）計算公式：GI=A1×B1A2×B2×100%。

式中：A1表示菌株SWS-15發(fā)酵液培養(yǎng)種子的發(fā)芽率，%;B1表示菌株SWS-15發(fā)酵液培養(yǎng)種子的平均根長，mm;A2表示蒸餾水培養(yǎng)種子的發(fā)芽率，%;B2表示蒸餾水培養(yǎng)種子的平均根長，mm。

1.5 玉米苗盤試驗

將多黏類芽孢桿菌按1%接種于營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48 h后用無菌水調(diào)節(jié)菌懸液濃度為1×108 CFU/mL（D600 nm約為0.5），放4 ℃冰箱備用。采用灌根方式進行接種，接種量為10 mL/株。將采集的土壤干燥過篩，隨后將處理好的土壤分成2份，A組不做處理，B組加入6%生物炭和10%有機肥混勻，分別裝入72孔的育苗盤中。苗盤試驗共根據(jù)施肥不同分為6組處理，分別為A-CK1：土+水 5 mL;A-CK2：土+培養(yǎng)基5 mL;A-T：土+SWS-15菌液5 mL;B-CK1：土+6% 生物炭+10%有機肥+水5 mL;B-CK2：土+6% 生物炭+10%有機肥+培養(yǎng)基5 mL;B-T：土+6% 生物炭+10%有機肥+SWS-15菌液5 mL）。每個處理均有3個平行，每個平行中種18株玉米，玉米品種為金嶺67。玉米苗盤試驗于2020年5月1—30日在甘肅省張掖市民樂縣進行。5月1日種植，整個試驗期間所有苗盤無差別對待，并始終保持土壤濕潤，6 d后（2020年5月7日）統(tǒng)計出苗率，29 d后（2020年5月30）用卷尺測量株高和冠徑。

1.6 粉絲廠廢水理化參數(shù)測定

廢水的重鉻酸鹽指數(shù)（CODCr）按照HJ 828—2017《水質(zhì) 化學(xué)需氧量的測定 重鉻酸鹽法》用重鉻酸鉀法測定;總磷按照GB 11893—1989《水質(zhì) 總磷的測定 鉬酸氨分光光度法》檢測;總氮按照HJ 636—2012《水質(zhì) 總氮的測定 堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法》檢測;廢水中鉀按照HJ 776—2015《水質(zhì) 32種元素的測定 電感耦合等離子體發(fā)射光譜法》檢測，pH值用pH計直接測量。

1.7 單因素試驗

試驗設(shè)計主要考察廢水濃度、初始pH值以及溫度對粉絲廠廢水發(fā)酵多黏類芽孢桿菌的影響。取新鮮的粉絲廠廢水按體積比梯度稀釋（100%、80%、60%、40%、20%）后調(diào)節(jié)pH值為7.0，100 mL裝入250 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min，按1%接種多黏類芽孢桿菌，30 ℃培養(yǎng)24 h后測定活菌數(shù)，從而確定利于多黏類芽孢桿菌生長的廢水濃度。初始pH值梯度設(shè)定為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，將100 mL 50%的廢水按試驗設(shè)計調(diào)節(jié)pH值后裝入250 mL的錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min，按1%接種多黏類芽孢桿菌，30 ℃培養(yǎng)24 h后測定活菌數(shù)。多黏類芽孢桿菌按1%接種到100 mL，121 ℃滅菌20 min 后的50%的廢水中，分別按發(fā)酵溫度梯度（24、28、32、36、40 ℃）培養(yǎng)24 h后測定活菌數(shù)。

1.8 菌株Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，將廢水濃度、初始pH值以及溫度設(shè)為X，將多黏類芽孢桿菌活菌數(shù)設(shè)為Y，利用Design-Expert軟件中Box-Behnken 模型進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，各因素的水平如表1所示。

1.9 數(shù)據(jù)分析

利用軟件SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)顯著性分析，利用OriginPro 9.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株SWS-15的鑒定

從污水處理廠污泥中純化獲了15株細菌，通過 16S rRNA基因比對后，鑒定得到1株類芽孢桿菌屬細菌（SWS-15），與Paenibacillus polymyxa strain YC0573? 16S rRNA 基因序列相似度高達 96%（圖1）。MEGA 5.1 軟件系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，該菌株的遺傳進化與多黏類芽孢桿菌最近。菌株 SWS-15 在營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基上前期形成規(guī)則的半透明圓形菌落，后期菌落頂部逐漸凸起變白，挑起有黏性。

2.2 多黏類芽孢桿菌SWS-15對玉米的促生效果

2.2.1 多黏類芽孢桿菌SWS-15發(fā)酵液植物調(diào)節(jié)激素檢測結(jié)果

應(yīng)用HPLC方法測定菌株SWS-15發(fā)酵液，菌株SWS-15的發(fā)酵液中玉米素（ZA），赤霉素（GA3）、吲哚-3-乙酸（IAA）均被檢出，未檢出脫落酸（ABA），證明菌株SWS-15不僅能產(chǎn)生ZA和GA3，而且可以產(chǎn)生IAA，但沒有檢測出抑制生長的植物激素脫落酸。具體的定量結(jié)果如表2所示，菌株SWS-15產(chǎn)赤霉素的量相對于ZA、IAA較高。

2.2.2 多黏類芽孢桿菌SWS-15對玉米發(fā)芽指數(shù)的影響

由表3可知，SWS-15菌株發(fā)酵液在3個稀釋梯度下玉米主根發(fā)芽指數(shù)較對照組和解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液高。其中，稀釋100倍后的SWS-15菌株發(fā)酵液玉米主根發(fā)芽指數(shù)為283.1%，比解淀粉芽孢桿菌的主根發(fā)芽指數(shù)188.6%高出94.5%，比對照組高出117.2%。在同等條件下，SWS-15菌株發(fā)酵液玉米主根加側(cè)根發(fā)芽指數(shù)為369.6%，比解淀粉芽孢桿菌的199.4%高出170.2%，比對照組高出219.7%。因此，可以看出SWS-15菌株對玉米種子發(fā)芽指數(shù)影響明顯。同時，隨著稀釋倍數(shù)的增加，發(fā)芽指數(shù)具有增加的趨勢，這一結(jié)果為多黏類芽孢桿菌菌劑的使用劑量提供了參考。

2.2.3 多黏類芽孢桿菌SWS-15對玉米出苗率、苗高及冠徑的影響

由圖2-A可知，A-CK1組出苗率為79.6%，A-T組出苗率為100%，多黏類芽孢桿菌對玉米出苗率影響顯著。B-CK1和B-T組出苗率均為100%，沒有差異。由圖2-B和圖 2-C 可知，與不施菌液的CK1、CK2相比，SWS-15菌液處理后的玉米株高和冠徑均顯著提高。在土壤中加入生物炭和有機肥后玉米的長勢反而沒有不加的處理組好，A-T組玉米的苗高和冠徑均顯著高于B-T組，說明肥料對玉米的苗期生長階段影響甚微。

2.3 粉絲廠廢水理化特性及廢水濃度、pH值、溫度對菌體生長的影響

銀河粉絲廠在利用豌豆生產(chǎn)淀粉的過程中產(chǎn)生大量的廢水，取豆水池上清液檢測其基本理化特性。由表4可知，廢水呈酸性，平均pH 值為4.63，CODCr高達13 847 mg/L， 同時， 還含有豐富的氮磷鉀。廢水濃度、初始 pH值及溫度對菌株SWS-15生長的影響如圖 3 所示。由圖3-A可知，在培養(yǎng)24 h后，菌株SWS-15的活菌數(shù)隨著廢水濃度的增加先上升后降低，廢水濃度高于 60%時，菌株SWS-

15的活菌數(shù)達到最大值為6.28×109 CFU/mL。由圖3-B可知，pH值為8.0時，菌株SWS-15的長勢最好，活菌數(shù)達到6.33×109 CFU/mL。由圖3-C可知，培養(yǎng)菌株SWS-15的最適溫度為36 ℃。

2.4 廢水發(fā)酵最優(yōu)條件的響應(yīng)面結(jié)果

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，以多黏類芽孢桿菌SWS-15活菌數(shù)為Y，以廢水濃度（A）、初始pH值（B）及溫度（C）為考察因素，將所得試驗數(shù)據(jù)采用? Design-Expert? V8.0.6? 軟件進行多元回歸擬合的二次多向回歸方程為Y=6.52+0.23A-0.29B+0.21C-0.15AB-0.050AC-0.03BC-0.67A2-1.05B2-0.30C2。由表5可知，模型P值<0.01，表明響應(yīng)面回歸模型達到了極顯著水平。失擬項F值為5.119，P值為0.074 3，P值>0.05，失擬項不顯著，模型的確定系數(shù)R2=0.985 2。由回歸模型和方差分析結(jié)果可知，方程一次項和二次項對SWS-15菌株活菌數(shù)的影響達到極顯著水平;交互項AB、AC、BC對活菌數(shù)的影響不顯著。失擬項P>0.05，說明模型與試驗數(shù)據(jù)之間擬合度好，可用此模型預(yù)測多黏芽孢桿菌的生長情況。根據(jù)F值大小可以判斷出各個因素對活菌數(shù)的影響主次順序為初始 pH值>廢水濃度>溫度。

圖4直觀地解釋各個變量和變量之間對多黏芽孢桿菌活菌數(shù)的影響。根據(jù) Design-Expert 軟件對建立的回歸方程進行參數(shù)優(yōu)化分析，可以得出在廢水濃度、初始pH值及溫度在理論上分別取63.42%、7.85、36.05 ℃時，可得理論上的最大活菌數(shù)6.60×109 CFU/mL。

3 討論與結(jié)論

本研究分離鑒定出1株多黏類芽孢桿菌SWS-15，菌落有黏稠性，與報道[18]相符，16S rRNA 基因序列與Paenibacillus polymyxa strain YC0573 同源性達96%，初步鑒定該菌屬于類芽孢菌屬（Paenibacillus）。HPLC檢測結(jié)果表明，菌株SWS-15發(fā)酵液中檢測出玉米素、赤霉素以及生長素等促進植物生產(chǎn)的激素。目前報道中發(fā)現(xiàn)，多黏類芽孢桿菌菌株 CF05能產(chǎn)生IAA[19]，但能同時產(chǎn)生多種植物促生激素的多黏類芽孢桿菌鮮有報道。玉米種子發(fā)芽指數(shù)結(jié)果表明，多黏類芽孢桿菌SWS-15發(fā)酵液對玉米發(fā)芽指數(shù)影響明顯。同時，玉米苗盤試驗結(jié)果證明，多黏類芽孢桿菌SWS-15處理的玉米長勢比對照組好，多黏類芽孢桿菌處理的玉米苗高和冠徑均顯著提高。多黏類芽孢桿菌菌劑可在玉米種植時作為基肥使用，可提高苗期玉米長勢。響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果表明，利用粉絲廠廢水發(fā)酵多黏類芽孢桿菌SWS-15菌劑的最佳條件：廢水濃度為63.42%，初始pH值為7.85，溫度為36.05 ℃。在該條件下發(fā)酵24 h，可獲得最大的活菌數(shù)6.60×109 CFU/mL。

參考文獻：

[1]胡 瓊，任國平. 多黏類芽孢桿菌在植物生產(chǎn)中的應(yīng)用及作用機制[J]. 北方園藝，2020（24）：137-144.

[2]Weselowski B，Nathoo N，Eastman A W，et al. Isolation，identification and characterization of Paenibacillus polymyxa CR1 with potentials for biopesticide，biofertilization，biomass degradation and biofuel production[J]. BMC Microbiology，2016，16（1）：244.

[3]陳敏潔，姜曉茹，李亞飛，等. 多黏類芽孢桿菌與化肥不同配施處理對生菜生長和品質(zhì)的影響[J]. 河南師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2019，47（3）：92-98.

[4]李銘東，吳成生，沈 彤，等. 多黏類芽孢桿菌菌劑在玉米上的應(yīng)用效果[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，49（3）：141-143.

[5]陳雪麗，王光華，金 劍，等. 多黏類芽孢桿菌BRF-1和枯草芽孢桿菌BRF-2對黃瓜和番茄枯萎病的防治效果[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，16（2）：446-450.

[6]曾 立，程萬里，余 豪，等. 多黏類芽孢桿菌KM2501-1發(fā)酵液對番茄根結(jié)線蟲的防治效果[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2020，26（5）：1046-1050.

[7]羅雨晴，盛 浩，袁 紅，等. 多黏類芽孢桿菌LRS-1誘導(dǎo)黃瓜抗疫霉病的苯丙烷類代謝基因表達與調(diào)控研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2020，33（10）：2262-2266.

[8]申順善，張 濤，王 娟，等. 多黏類芽孢桿菌HK18-8對辣椒炭疽病菌的抑制作用及其定殖能力[J]. 園藝學(xué)報，2019，46（3）：499-507.

[9]張 亮，盛 浩，袁 紅，等. 多黏類芽孢桿菌LRS-1對辣椒疫霉病害根際土壤細菌多樣性的影響[J]. 土壤通報，2020，51（2）：358-364.

[10]師偉偉，華欲飛. 豌豆粉絲廠廢水中蛋白質(zhì)的提取和性質(zhì)研究[J]. 食品工業(yè)科技，2014，35（1）：120-124.

[11]周 悅，秦人偉. 粉絲廢水回收飼料蛋白粉[J]. 飼料工業(yè)，1991，12（10）：9.

[12]Kumar S，Stecher G，Tamura K. MEGA7：molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J]. Molecular Biology and Evolution，2016，33（7）：1870-1874.

[13]舒健虹，王子苑，劉曉霞，等. 不同促生菌培養(yǎng)發(fā)酵分泌的激素和有機酸含量[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（2）：61-64.

[14]Bago A，Cano C，Toussaint J P，et al. Interactions between the arbuscular mycorrhizal （AM） fungus Glomus intraradices and nontransformed tomato roots of either wild-type or AM-defective phenotypes in monoxenic cultures[J]. Mycorrhiza，2006，16（6）：429-436.

[15]李少明，鄧文祥，郭亞妮，等. 微生物菌劑對煙末堆肥理化性狀及種子發(fā)芽指數(shù)的影響[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，22（5）：706-709，713.

[16]黃光群，黃 晶，張 陽，等. 沼渣好氧堆肥種子發(fā)芽指數(shù)快速預(yù)測可行性分析[J]. 農(nóng)業(yè)機械學(xué)報，2016，47（5）：177-182.

[17]王華笑. 解淀粉芽孢桿菌YM6對鹽脅迫下玉米促生作用及機理研究[D]. 銀川：北方民族大學(xué)，2020.

[18]郭芳芳，謝 鎮(zhèn)，盧 鵬，等. 一株多黏類芽孢桿菌的鑒定及其生防促生效果初步測定[J]. 中國生物防治學(xué)報，2014，30（4）：489-496.

[19]金莉萍. 多黏類芽孢桿菌生防促生機制研究及發(fā)酵條件的優(yōu)化[D]. 杭州：浙江農(nóng)林大學(xué)，2016.