離子對反相液相色譜-原子熒光光譜法測定畜禽肉中5種硒形態(tài)含量

魏益華，黃青青，張金艷*，邱素艷, 3，涂田華，袁林峰，戴廷燦，張標金，李偉紅，嚴 寒

1. 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標準研究所，江西 南昌 330200 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，天津 300191 3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室(南昌)，江西 南昌 330200

引 言

硒(Se)是人體必需的一種微量元素，為谷胱甘肽過氧化物酶和硒-P蛋白的重要組成部分，在體內(nèi)起著平衡氧化還原氛圍的作用。研究表明，威脅人類健康和生命的40多種疾病，如癌癥、心血管病、肝病、白內(nèi)障、胰臟疾病、糖尿病和生殖系統(tǒng)疾病等都與人體缺硒有關(guān)[1]。然而，硒適量有益身體健康，過量則有害健康。硒攝入量在缺乏和毒性之間范圍很窄，其推薦攝入量和最高安全攝入量上限分別為成人每天50～200和400 μg[2]。

食物中硒的營養(yǎng)價值不僅取決于總含量，更取決于其形態(tài)種類，不同化學(xué)形態(tài)的硒在人體的吸收、生物效應(yīng)、毒性及防癌作用不同[3]。食物中的硒來源按其存在的形態(tài)，可分為有機硒和無機硒，有機硒主要形態(tài)有硒代氨基酸、硒代蛋氨酸、硒蛋白和硒多糖等，有機硒易被人體吸收利用，安全性高； 無機硒主要形態(tài)有硒酸鹽和亞硒酸鹽，無機硒毒性較大，生物利用率差，故開展食品中硒形態(tài)分析具有重要意義。

目前，硒形態(tài)分析方法有： 氣相色譜-質(zhì)譜法[4]，液相色譜-質(zhì)譜法[5]，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6]，液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法[7-8]和液相色譜-原子熒光光譜法[9-10]。與其他方法相比，液相色譜-原子熒光光譜法具有儀器購置和運行成本低，光譜干擾少，線性范圍寬和檢出限較低等諸多優(yōu)點，其元素形態(tài)分析應(yīng)用越來越多。液相色譜分離硒形態(tài)主要方法為離子交換液相色譜法和離子對反相液相色譜法，其中己烷磺酸鈉[8]，氫氧化四甲基銨[11]、三氟乙酸[12]、五氟丙酸[13]和七氟丁酸[14]等離子對試劑用于硒形態(tài)分析研究報道較多，而四丁基溴化銨用于硒形態(tài)分析研究報道相對較少。

食品中硒形態(tài)分析研究對象主要集中于稻谷[15]，大豆[6]、蔬菜[5]、水果[16]和飼料[17]等植物性樣品。動物性樣品硒形態(tài)分析研究極為少見[8, 18]，其測定方法均為液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法，且樣品需冷凍干燥。本研究擬采用液相色譜-原子熒光光譜法對畜禽鮮肉樣品中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒酸根和硒酸根等5 種硒形態(tài)進行測定，以期為畜禽肉類樣品中硒形態(tài)分析與研究提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

高效液相色譜(SA 20)-原子熒光光譜儀(AFS 9320，吉天儀器公司)，臺式高速冷凍離心機(CR21N，日立)，pH計(S2，梅特勒)，微波消解儀(Xpress，CEM)，微控數(shù)顯電熱板(EG 37C，萊伯泰科)，Milli-Q5超純水系統(tǒng)。

硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸標準物質(zhì)(純度均為98%，百靈威公司)； 亞硒酸根(GBW10032)和硒酸根(GBW10033)標準溶液均購于中國計量科學(xué)研究院； 胰蛋白酶(≥2 500 units·mg-1，百靈威)，蛋白酶XIV(≥3.5 units·mg-1，鏈霉蛋白酶，Sigma-Aldrich)； 磷酸氫二銨(ACS)，四丁基溴化銨(離子對色譜級)，甲醇和甲酸(HPLC)，氫氧化鉀、碘化鉀、鹽酸和硝酸(均為GR)，硼氫化鉀、碘乙酰胺、高氯酸和鐵氰化鉀(均為AR)均購置于阿拉丁公司。超濾管(Amicon?Ultra-15，3KDa，密理博公司)。

1.2 樣品硒形態(tài)前處理及液相色譜-原子熒光光譜儀測試條件

1.2.1 硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的提取與凈化

取一定量的畜禽肉鮮樣充分粉碎混勻。稱取2.0 g(精確至0.001 g)樣品于50 mL離心管中，加入40 mg胰蛋白酶、40 mg蛋白酶XIV和10 mL 30 mmol·L-1磷酸氫二銨溶液(pH 8.0)，渦旋混勻，于恒溫水浴振蕩器上55 ℃、200 r·min-1條件下震蕩提取 20 h，10 000 r·min-1離心10 min，提取液經(jīng)濾紙過濾再轉(zhuǎn)移至超濾離心管，于5 000 r·min-1離心10 min，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，用液相色譜-原子熒光光譜儀測定樣品溶液中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸含量。

1.2.2 硒酸根和亞硒酸根的提取與凈化

取一定量的畜禽肉鮮樣充分粉碎混勻。稱取樣品2.0 g (精確至0.001 g)樣品，置于50 mL離心管中，加入10 mL磷酸氫二銨緩沖液和20 μL 0.5 mol·L-1碘乙酰胺，渦旋混勻，于恒溫水浴鍋上55 ℃、200 r·min-1條件下震蕩提取 20 h，10 000 r·min-1離心10 min，提取液經(jīng)濾紙過濾再轉(zhuǎn)移至超濾離心管，于5 000 r·min-1離心10 min，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，用液相色譜-原子熒光光譜儀測定樣品溶液中硒酸根和亞硒酸根含量。

液相色譜-原子熒光光譜儀條件： (1)液相色譜： 采用C18反相色譜柱(4.6×250 mm，5 μm，Inertsil ODS-3，GL Science)，以30 mmol·L-1磷酸氫二銨、0.5 mmol·L-1四丁基溴化銨和5%(V/V)甲醇為流動相，用20%(V/V)甲酸調(diào)節(jié)流動相溶液pH為 6.0，流動相流速為0.8 mL·min-1，進樣量為100 μL； (2)在線紫外消解系統(tǒng)： 在線紫外燈消解，還原劑為0.5%(m/v)氫氧化鉀+0.2 %(m/v)碘化鉀； (3)原子熒光光譜： 0.5%(m/v)氫氧化鉀+2.5%(m/v)硼氫化鉀，載流為10%(V/V)鹽酸溶液，硒空心陰極燈主、輔極電流和電壓分別為100 mA，50 mA和310 V，載氣和屏蔽氣流速350和750 mL·min-1。

1.3 樣品總硒前處理及原子熒光光譜儀分析測試條件

采用《GB 5009.93—2017》中氫化物原子熒光光譜法對樣品中總硒進行測定[19]。取一定量的雞肉鮮樣充分勻漿，稱取2.0 g(精確至0.001 g)樣品于錐形瓶中，加入9 mL硝酸和1 mL高氯酸，置于電熱板上于160 ℃消解4 h，再升溫至260 ℃趕酸至白煙冒盡，冷卻后加入10 mL(V/V)鹽酸溶液于95 ℃加熱5 min以還原六價硒成四價硒，消解液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加入2.5 mL 10%(m/v)鐵氰化鉀溶液，用水定容至刻度。

原子熒光光譜條件： 還原劑為0.5%(m/v)氫氧化鉀+2.5%(m/v)硼氫化鉀，載流為10%(V/V)HCl，硒空心陰極燈主、輔極電流和電壓分別為100 mA，50 mA和300 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器分析測試條件的選擇與優(yōu)化

首先，考察了離子對液相色譜法(IP-RP-HPLC)和陰離子交換液相色譜法(AE-HPLC)對硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)、硒酸根(Se(Ⅳ))和硒酸根(Se(Ⅵ))的分離度和靈敏度的影響。離子對液相色譜法采用Inertsil ODS-3 C18反相色譜柱，以30 mmol·L-1磷酸氫二銨、0.5 mmol·L-1四丁基溴化銨和5% (V/V)甲醇為流動相(pH 6.0)，流速為0.8 mL·min-1，柱溫30 ℃，見圖1； 陰離子交換液相色譜法采用Hamilton PRP-X100陰離子色譜柱，以40 mmol·L-1磷酸氫二銨和5% (V/V)甲醇為流動相(pH 6.0)，流動相流速為1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃。雖然此兩種方法均能成功分離5種硒形態(tài)，但陰離子交換液相色譜法的硒酸根保留時間明顯長于離子對液相色譜法的硒酸根保留時間，且其有機硒(尤其是硒代蛋氨酸靈敏度)較差，故本研究最終采用離子對液相色譜法分離5種硒形態(tài)。

圖1 IP-RP-HPLC(Inertsil ODS-3色譜柱)硒形態(tài)色譜圖Fig.1 Chromatogram of Se species with IP-RP-HPLC (Inertsil ODS-3)

同時，考察了不同流動相體系對硒形態(tài)分離的影響，共設(shè)3種流動相體系，(1) 磷酸鹽： 30 mmol·L-1磷酸氫二銨、0.5 mmol·L-1四丁基溴化銨和5%(V/V)甲醇(pH 6.0)； (2) 乙酸銨： 25 mmol·L-1乙酸銨、0.1 %(m/v)TFA和5% (V/V)甲醇為流動相(pH 6.0)； (3) 檸檬酸： 5 mmol·L-1檸檬酸(pH 4.5)。磷酸鹽和乙酸銨流動相體系均可較好的分離5種硒形態(tài)，分離度和靈敏度亦較佳，但乙酸銨流動相體系的硒酸根出峰時間相對較晚，檸檬酸流動相體系的硒代胱氨酸和甲基硒代半胱氨酸分離較差。

此外，還考察了磷酸鹽流動相體系中磷酸氫二銨濃度、四丁基溴化銨濃度、甲醇含量和色譜柱柱溫對硒形態(tài)保留時間和靈敏度的影響。實驗表明，磷酸氫二銨濃度、四丁基溴化銨濃度、甲醇含量和pH對硒酸根保留時間影響較大，而對有機硒保留時間影響較小。磷酸氫二銨濃度和甲醇含量的增加會明顯縮短硒酸根保留時間，而四丁基溴化銨濃度增加會明顯延長硒酸根保留時間。甲醇含量的增加可顯著提高硒形態(tài)靈敏度。色譜柱柱溫對硒形態(tài)保留時間和靈敏度幾乎無影響。

綜上所述，最終流動相體系為30 mmol·L-1磷酸氫二銨、0.5 mmol·L-1四丁基溴化銨，5% (V/V)甲醇含量(pH為6.0)，流速0.8 mL·min-1，5種硒形態(tài)Se分離度好，在10 min之內(nèi)可完成5種硒形態(tài)分析測試工作。

通過在線紫外燈輻射有機硒轉(zhuǎn)化成六價硒，還原劑碘化鉀將六價硒還原成四價硒，硼氫化鉀將四價硒在鹽酸介質(zhì)中還原成硒化氫。值得注意的是，即使在紫外消解系統(tǒng)和碘化鉀還原劑共同的作用下，離子對反相液相色譜-紫外-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測定硒形態(tài)，相同濃度的各種硒形態(tài)峰面積存在明顯差異，其峰面積從大至小一般為： 亞硒酸根>硒酸根>甲基硒代半胱氨酸>硒代胱氨酸>硒代蛋氨酸，其差異原因可能為在線紫外消解系統(tǒng)對各種硒形態(tài)轉(zhuǎn)化率不同所致。

本研究對還原劑碘化鉀、硼氫化鉀以及載流(鹽酸)濃度等進行優(yōu)化，以期達到較佳的靈敏度。結(jié)果表明，當?shù)饣洕舛葹?.2%，硼氫化鉀濃度為2.5%，鹽酸濃度為10%時，硒形態(tài)靈敏度較高。

2.2 樣品處理

2.2.1 蛋白酶種類與用量的選擇

首先，考察了不同蛋白酶對豬肉樣品中硒形態(tài)提取效果，共設(shè)5個蛋白酶處理，見圖2。除胃蛋白酶處理提取劑為0.1(V/V)%鹽酸(pH 3.0)，其他處理提取劑均為30 mmol·L-1磷酸氫二銨溶液(pH 8.0)，提取方式為水浴震蕩200 r·min-120 h。樣品提取率等于樣品各種硒形態(tài)含量之和除以樣品總硒含量之和。實驗表明，蛋白酶復(fù)合處理提取效果明顯高于單一蛋白酶處理，胰蛋白酶+蛋白酶XIV提取效果最佳，其次為蛋白酶XIV+脂肪酶，胃蛋白酶提取效果最差。故本實驗最終選擇胰蛋白酶+蛋白酶XIV對樣品中硒形態(tài)進行提取。其次，對胰蛋白酶+蛋白酶XIV用量進行了考察，共設(shè)5個處理，見圖3。實驗表明，40 mg胰蛋白酶+40 mg蛋白酶XIV、50 mg胰蛋白酶+50 mg蛋白酶XIV對樣品硒形態(tài)提取率較高，二者提取率無顯著差異。但由于蛋白酶價格較高，選取40 mg胰蛋白酶+40 mg蛋白酶XIV用量有利于降低試劑成本。

圖2 不同蛋白酶對樣品硒形態(tài)提取率的影響(n=3)Fig.2 Influences of extraction rates of Se species in samples with different proteases (n=3)

圖3 蛋白酶(胰蛋白酶、蛋白酶XIV)不同用量對樣品硒形態(tài)提取率的影響Fig.3 Influences of extraction rates of Se species in samples with different dosage of proteases (trypsin, protease XIV)

2.2.2 樣品提取方式及提取時間的選擇

首先，考察了水浴震蕩提取、水浴超聲提取和微波提取對樣品硒形態(tài)提取效果的影響。水浴震蕩提取條件為55 ℃水浴振蕩器上200 r·min-1提取24 h，超聲提取條件為37 ℃超聲30 min×4次(頻率為20 kHz)，微波提取條件為40 ℃微波30 min(微波功率為100 W)。從圖4可知，樣品硒形態(tài)提取率從大至小為： 水浴震蕩提取>水浴超聲提取>微波提取。同時進行添加回收試驗，添加硒形態(tài)種類為硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸以考察提取方式是否會破壞有機硒硒形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，水浴提取下有機硒形態(tài)未發(fā)生轉(zhuǎn)化，超聲提取時硒代胱氨酸峰附近出現(xiàn)未知物質(zhì)峰，估計為長時間超聲導(dǎo)致硒代胱氨酸形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)化所致，微波提取下有機硒硒形態(tài)未發(fā)生轉(zhuǎn)化，但其提取率較低。故本研究最終選用水浴震蕩提取方式對樣品中硒形態(tài)進行提取。其次，考察了水浴震蕩提取時間對樣品硒形態(tài)提取率的影響，共設(shè)6個處理。從圖5可知，當水浴震蕩提取時間≥20 h，樣品硒形態(tài)提取率較好，故最終水浴震蕩提取時間設(shè)為20 h。

圖4 不同提取方式對樣品硒形態(tài)提取率的影響(n=3)Fig.4 Influences of extraction rates of Se species in samples with different extraction means (n=3)

圖5 不同水浴提取時間對樣品硒形態(tài)提取率的影響(n=3)Fig.5 Influences of extraction rates of Se species in samples with different extraction times by water bath (n=3)

2.2.3 樣品提取劑的選擇

由于胰蛋白酶和蛋白酶XIV均為堿性蛋白酶，提取體系中pH值對酶活力影響較大。三(羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)和磷酸氫二銨[(NH4)2HPO4]均為常見緩沖液，用作提取劑可起穩(wěn)定pH作用，本實驗考察了不同提取劑及pH值對樣品硒形態(tài)提取率的影響，共設(shè)5個處理，(1)水、(2) 30 mmol·L-1Tris-HCl(pH 7.5)、(3) 30 mmol·L-1Tris-HCl(pH8.0)、(4) 30 mmol·L-1(NH4)2HPO4(pH7.5)和(5) 30 mmol·L-1(NH4)2HPO4(pH 8.0)。從圖6可知，樣品硒形態(tài)提取率從大至小順序為30 mmol·L-1(NH4)2HPO4(pH 8.0)>30 mmol·L-1Tris-HCl(pH8.0)>30 mmol·L-1(NH4)2HPO4(pH 7.5)>30 mmol·L-1Tris-HCl(pH 7.5)>水，故本方法采用30 mmol·L-1(NH4)2HPO4(pH 8.0)為樣品提取劑。

圖6 不同提取劑對樣品硒形態(tài)提取率的影響Fig.6 Influences of extraction rates of Se species in samples with different extraction reagents

2.2.4 樣品凈化方式的選擇

樣品經(jīng)蛋白酶水解后，溶液顏色較深，含有較多水溶性蛋白質(zhì)等雜質(zhì)會嚴重縮短色譜柱的使用使命，故本研究考察了不同凈化方式對樣品溶液顏色的影響以及對硒形態(tài)添加回收率的影響。共設(shè)4個處理，樣品提取液未凈化； 樣品提取液經(jīng)超濾管(3KD)離心凈化； C18基質(zhì)固相分散凈化，即提取前往樣品中加入0.2 g C18粉末，其他步驟相同； PSA基質(zhì)固相分散凈化，即提取前往樣品中加入0.2 g PSA粉末，其他步驟相同。實驗表明，樣品凈化后溶液顏色從深至淺依次為： 未凈化>C18>PSA≈超濾，4種凈化方式的有機硒硒形態(tài)添加回收率無明顯差異，但PSA會降低無機硒回收率，故本方法最終采用超濾對樣品溶液進行凈化。

2.2.5 碘乙酰胺的作用

在添加回收實驗過程中，本研究發(fā)現(xiàn)： 樣品經(jīng)蛋白酶水解，其亞硒酸根回收率非常低，通常為0%～5%，而其他4種硒形態(tài)回收率在80%～110%之間。即使樣品不加蛋白酶水解，只用水或磷酸氫二銨溶液提取，亞硒酸根回收率亦呈同樣結(jié)果，其原因可能為亞硒酸根吸附在樣品顆粒表面，未能解吸到樣品溶液中。通過本研究發(fā)現(xiàn)，樣品提取前加入碘乙酰胺溶液，亞硒酸根回收率顯著升至80%以上，其原因可能為碘乙酰胺破壞了蛋白結(jié)構(gòu)或其還原性使亞硒酸根解吸到樣品溶液中。

由于碘乙酰胺是一種氨基酸烷基化試劑，能與硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸等有機硒發(fā)生烷基化反應(yīng)。添加回收實驗亦證明，當?shù)庖阴０反嬖跁r，硒代蛋氨酸和硒代胱氨酸結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)化，其回收率明顯下降，故同時測定畜禽肉中5種硒形態(tài)，樣品提取步驟需要分成兩步，第一步為樣品中有機硒的提取，其提取需經(jīng)蛋白酶水解； 第二步為樣品中無機硒的提取，其提取僅需加入磷酸氫二銨溶液，無須酶解。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 樣品基體效應(yīng)的考察

通過往樣品提取液中添加一定量硒形態(tài)標準溶液以考察樣品基質(zhì)效應(yīng)(ME)。樣品基質(zhì)效應(yīng)=100%×(樣品添加濃度的熒光強度-樣品本底的熒光強度)/標準溶液濃度的熒光強度，假設(shè)80%≤樣品基質(zhì)效應(yīng)≤120%，則認為樣品的基質(zhì)效應(yīng)較小，用標準曲線法分析測試即可； 若樣品基質(zhì)效應(yīng)<80%或>120%，則認為樣品的基質(zhì)效應(yīng)較大，必須采用標準加入法。從表1可知，樣品中5種硒形態(tài)基質(zhì)效應(yīng)為83.7%～119%，表明其基體效應(yīng)較小，用普通標準曲線法定量即可。由于本研究采用的是離子對液相色譜法，樣品提取劑為30 mmol·L-1磷酸氫二銨(pH 8.0)，故標準溶液亦須用30 mmol·L-1磷酸氫二銨(pH 8.0)進行稀釋與定容。

表1 樣品的基質(zhì)效應(yīng)Table 1 Matrix effects of the 5 kinds of Se species in samples

2.3.2 添加回收率和精密度

通過添加回收率試驗以考察方法的添加回收率、批內(nèi)精密度和批間精密度，精密度用相對標準偏差(RSD)。添加回收試驗，共設(shè)置低、中、高3個濃度水平，每平行設(shè)6個重復(fù)，批內(nèi)精密度為同一批次的測量結(jié)果，批間精密度為不同批次(3次)的測量結(jié)果。從表2可知，本方法5種硒形態(tài)添加回收率為76.8%～109%，批內(nèi)精密度和批間精密度分別為2.7%～7.8%和3.5%～12.3%。

表2 豬肉中5種硒形態(tài)的加標回收率和精密度(n=6)Table 2 Standard recovery rates and precisions of 5 kinds of Se species in pork samples (n=6)

2.3.3 方法線性和檢出限

從表3可見，各種硒形態(tài)在5～200 μg·L-1范圍內(nèi)線性良好，其相關(guān)系數(shù)均大于0.999。以信噪比S/N=3為檢出限，5種硒形態(tài)檢出限為0.55～0.94 μg·L-1。與其他文獻相比，本方法靈敏度與HPLC-ICP-MS，HPLC-MS/MS靈敏度相近，高于HPLC-TR-HG-AFS靈敏度，且該方法測定硒形態(tài)種類較多[7, 16, 19]。

表3 5種硒形態(tài)的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 3 Linear range, linear equation, correlation coefficients and detection limits

測定畜禽肉樣品中總硒含量和硒形態(tài)含量，以觀察本方法對樣品中硒形態(tài)的提取率。提取率等于樣品各硒形態(tài)含量之和除以樣品總硒含量。從表4可知，本方法樣品硒形態(tài)提取率較高，富硒畜禽肉中主要形態(tài)為硒代蛋氨酸和硒代胱氨酸，未發(fā)現(xiàn)無機硒。

表4 樣品硒形態(tài)和總硒含量的測定(n=3)Table 4 Determination of Se species and total Se contents in samples(n=3)

3 結(jié) 論

建立了一種用離子對液相色譜-原子熒光光譜法測定硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒酸根和亞硒酸根5種硒形態(tài)含量的方法。畜禽肉類樣品無須冷凍干燥處理，鮮樣樣品中有機硒經(jīng)胰蛋白酶和蛋白酶XIV酶解水浴提取，無機硒經(jīng)碘乙酰胺溶液提取，以磷酸鹽體系為流動相，四丁基溴化銨為離子對試劑，經(jīng)C18反相色譜柱分離，10 min內(nèi)可以完全分離5種硒形態(tài)。本方法較為簡便、靈敏和準確，為畜禽肉類硒形態(tài)分析與研究提供了切實可行的分析方法和技術(shù)支撐。