全反射X射線熒光分析植物粉末樣品的制樣方法研究

賈文寶，唐馨如，張新磊，邵金發(fā)，熊根超，凌永生，黑大千，單 卿*

1. 南京航空航天大學材料科學與技術學院，核科學與技術系，江蘇 南京 211106 2. 北京師范大學核科學與技術學院，射線束技術教育部重點實驗室，北京 100875 3. 蘭州大學核科學與技術學院，甘肅 蘭州 730000

引 言

全反射X射線熒光(TXRF)是能量色散X射線熒光光譜法(EDXRF)的一種變體，由于其區(qū)別于XRF的幾何結構，當入射射線以小于全反射臨界角的角度入射時，入射射線被全部反射，使得在μg·kg-1和μg·L-1水平下具有更高的靈敏度和更高的檢測限[1]。全反射X射線熒光光譜分析技術是一種功能強大的分析工具，可直接分析固體、液體、粉末等各種各樣的樣品，測量時間短且所需的樣品量很少(幾μL或ng樣品)，操作流程簡便快捷、有較好的準確性，經濟環(huán)保。由于TXRF的優(yōu)秀檢測能力，其越來越多的被運用于不同的科學領域去檢測各種各樣的樣品，在國內外各個領域都有著廣泛應用，以解決常規(guī)或是更為復雜的分析問題，例如環(huán)境領域[2]、地質土壤研究領域[3]、食品安全[4-5]、生物研究[6]等等方面。

近年來，TXRF可作為一種分析植物性食品元素組成技術引起了人們的興趣[1, 5]，而對樣品進行準確定量的前提則是一種能夠保證樣品均勻性與重復性的制樣方法。與電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)，原子發(fā)射光譜法(AES)，火焰原子吸收光譜法(FAAS)等的光譜技術一樣，待測原樣很少能夠直接進行分析，在應用TXRF分析樣品之前也需要將樣品進行預處理，在針對植物樣品常規(guī)元素測定的過程中，有兩種常用的制樣方法——消解法與懸浮法。消解是最常用的技術，在2008年至2012年與TXRF分析相關的出版物中，其中有31%使用消解法來處理原始樣品，對于消解法，干灰化和濕消化方法是最廣泛使用的兩種程序[7]，消解通過化學處理完全破壞有機基質，但這兩種程序都很耗時，而且揮發(fā)會使得分析物的流失。而懸浮制樣法則不存在這些問題，只需將樣品研磨處理后分散于分散劑中即可，基于少量必要的樣品，經過充分的樣品研磨，懸浮制樣和內標定量，僅需要最少的樣品制備工作。懸浮制備樣品的方法大大簡化了制樣的程序、縮短了制樣時間，簡化了程序同時也會減少樣品的污染。但同時如何保證懸浮制樣法中懸浮于分散劑中粉末樣品的均勻性，從而獲得制樣重復性與回收率都滿足測量要求的測量樣品是懸浮制樣方法的關鍵問題，由于全反射的入射X射線束和反射X射線束之間相互作用產生了X射線駐波場，沉積在TXRF樣品載體(反射器)表面上的位于X射線駐波場中的固體顆粒的物理性質——沉積顆粒的大小即樣品粒徑則在TXRF測量的分析質量中起著重要作用，粒徑與分散劑就是影響測量結果誤差的重要因素。

隨著現代科技的飛速發(fā)展，現代儀器自動化程度越來越高，軟件愈發(fā)智能化，與其他痕量分析技術一樣，樣品的制備已成為分析誤差的主要來源。本實驗對粉末樣品制備成懸濁液的前處理方法進行研究，以茶葉樣品為分析對象，對茶葉粉末樣品的粒徑以及制備成懸濁液時的表面活性劑進行分析，量化標準探索優(yōu)化全反射X射線熒光分析植物粉末樣品的制樣方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

本實驗使用的全反射X射線熒光光譜儀為實驗室內自行設計的低功率全反射X射線熒光(LP-TXRF)光譜儀，使用X射線的連續(xù)譜作為激發(fā)源，該LP-TXRF光譜儀主要由X射線激發(fā)源、探測器、波導狹縫和樣品載體等組成，其中X射線激發(fā)源為一個微型低功率透射靶X射線管(Rh靶，12 W，MagPro，Moxtek公司，美國)，探測器單元相較于先前研究工作[2]，升級采用了探測器面積為30mm2的高計數率硅漂移探測器(AXAS-D-H30-CUBE，8 μm Be窗，FHWM=129 eV @5.9 keV，KETEK GmbH，德國)； 波導狹縫尺寸為10 mm×10 mm×0.03 mm； 樣品載體采用正方形石英光學反射體(30 mm×30 mm×3 mm，表面平整度為λ/20，λ@632.8 nm)。除此之外還用到了數顯加熱板(德國IKA HP-4，50～500 ℃)，量程分別為0.5～10，10～100和100～1 000 μL的移液器(Brand公司，德國)以及超聲振蕩器(300 W，KQ-300DE，昆山超聲儀器有限公司)，整個實驗測試在一個面積約10 m2的萬級潔凈工作間內進行。

使用S，P，K，Ca，Fe，Mn和Ga的單元素標準溶液(1 000 μg·mL-1，ICP標準，NIST，AccuStandard公司，美國)和超純水(光譜純，Fisher公司，CAS 7732-18-5，美國)制備元素濃度均為10 mg·L-1的多元素混合標準溶液，用于儀器刻度與校準。使用硅醇溶液(德國Serva公司)對石英反射體進行表面疏水化處理。利用非離子型表面活性劑Triton X-100(山東西亞化學工業(yè)有限公司)和去離子水制備稀釋劑，用于植物粉末樣品懸浮液的制備。

1.2 方法

用于實驗分析的茶葉樣品為收集自云南省臨滄市勐庫鎮(zhèn)品種為“糯伍”的普洱茶，取1 g茶葉樣品在研缽中進行研磨后分次過篩，分別得到粒徑在80～120，120～160，160～180，180～200，200～250，250～300，300～500目以及大于180目這八種粒徑范圍內的樣品粉末。稱取2份質量為20 mg粒徑范圍大于180目的樣品分裝于試管中，分別添加5 mL含有10 μg Ga的1% Triton X-100與去離子水作為分散劑，其中Ga作為內標元素[5]。其他7種樣品各稱取一份質量為20 mg的樣品裝于試管中，而后加入5 mL含有10 μg Ga的去離子水作為分散劑，其中Ga作為內標元素。

對于TXRF分析，震蕩樣品后取10 μL樣品沉積在石英玻璃反射器上，并在溫度為60 ℃的數字加熱板上蒸干5 min。冷卻后，反射鏡表面留下一層薄膜狀殘留物。測量在光管電壓為20 kV和電流為400 μA的條件下進行，測量時間為600 s。為了消除影響測量結果的陰影效應，每個樣品從0°，90°，180°和270°四個方向測量[8]。對于TXRF而言，元素定量可通過內標法進行量化，計算方法如式(1)[2, 8]

(1)

式(1)中，ci為分析物濃度，cIS為內標物濃度，Ni為分析物的凈峰面積，SIS為內標物相對靈敏度，NIS為內標物的凈峰面積，Si為分析物的相對靈敏度。

2 結果與討論

2.1 儀器性能評價

通過對經過認證的參考材料黃芪(GBW 10028(GSB-19)，中國地球物理與地球化學勘查研究所)進行測量評估了TXRF測量方法的準確性和檢測限。在LP-TXRF測量過程中，在確保測量精度的條件下，選擇了較短的測量時間(600 s)和常用的進樣量(10 μL)。制備樣品時，將20 mg的黃芪和5 mL含有10 μg Ga的去離子水置于試管中，其中Ga作為內標元素。使用內標法作為定量方法，同時應用下列公式來計算TXRF測量中的檢出限[5]

(2)

式(2)中，LOD是元素的檢出限，ci是元素i的濃度，Ni-net是元素i熒光峰的凈峰面積，Ni-bg是i元素在其熒光峰附近的背景面積。表1為TXRF對黃芪標準物質的測量結果，數據顯示P，S，K，Ca和Fe元素的測量精度均處于80%～100%之間，這表明該儀器對該植物粉末樣品中多元素的測量具有良好的準確性[2, 5]。

表1 標準樣品的認證和測量值以及在測量條件下的元素檢出限與相對標準偏差Table 1 The certified and measured values of standard samples, detection limits of elements and relative standard deviations under the measurement condition

2.2 懸浮制樣方法的不確定度分析

通過實驗量化了儀器與制樣方法分別對TXRF測量結果整體精度所產生的影響。整體不確定度由儀器不確定度與樣品不確定度構成，通過對粒徑范圍大于180目的茶葉粉末樣品的五個獨立重復試樣進行分析，測試了以去離子水作分散劑的懸浮制樣方法的TXRF測量整體精密度。此外，對其中一個試樣重復進行了5次測量，由于這種不確定度與儀器的穩(wěn)定性和計數統(tǒng)計有關，結果的相對標準偏差(RSD)則代表了儀器不確定度。因此，通過誤差傳播公式可以估計樣品制備引起的不確定度

(3)

式(3)中，udep為樣品制備不確定度，uemp為整體不確定度，uinst為儀器不確定度。

圖1顯示了儀器和樣品制備分別對TXRF整體精度所產生的影響。如圖1所示，各元素的相對標準偏差在6.7%和16.74%之間，整體精度滿足檢測標準的要求。對于P，S代表的輕元素，其RSD值更高，均勻性相對較差，輕元素的熒光產率相對較低，并且較低的能量更易發(fā)生衰減，制樣引起的不確定度占比更大。對于Mn(～3 mg·L-1)與Fe(～1 mg·L-1)所代表的低濃度的元素，由儀器所引起的不確定度均超過10%，隨著濃度越低、越發(fā)接近元素的檢出限，其由儀器所引起的不確定度在整體不確定度中所占的比例越高。特別對于Ca的RSD是最高的，這是由于制樣與測量過程中容易受到粉塵污染所引起的。不論在何種元素與濃度范圍下，與樣品制備步驟相關的不確定度對獲得的結果的全局精度都有顯著貢獻(>60%)?，F代儀器的自動化程度非常高，儀器的漂移與波動小，軟件也十分智能，由其造成的不確定度占比小，樣品制備已成為影響測量結果準確性、產生誤差的主要原因。

圖1 儀器和樣品制備不確定度對TXRF結果整體精度的影響Fig.1 Contribution of instrument and sample preparation uncertainties to the global precision of the TXRF results

2.3 分散劑分析

一些研究表明，如果使用表面活性劑溶液來制備懸浮液，可以有效改善懸浮液的均勻性[9]。常用的表面活性劑溶液有Triton X-100，通常將Triton X-100稀釋至1%使用，同時也有研究表明，在使用去離子水制備懸浮液時，樣品斑點的直徑更小，均勻性更好[10]。對此進行了實驗測試，對分散于兩種分散劑中粒徑范圍大于180目的茶葉粉末樣品進行測量計算，測量結果與經過驗證的ICP檢驗結果進行比較，結果列于表2中。輕元素(P，S，K)通過外部校準進行校正，從表2可以看出，兩種分散劑的定量結果均吻合良好，但輕元素定量結果與1% Triton X-100作分散劑的更接近，而原子序數較大的元素則相反。同時以獨立重復4次實驗對樣品進行TXRF分析結果的相對標準偏差數據來描述精密度，計算了兩種分散劑下各元素的RSD列于表中，結果表面以去離子水作為分散劑的樣品中各元素的相對標準偏差均小于1% Triton X-100作分散劑的樣品，從中可以看出以去離子水作為分散劑的樣品的重復性是明顯優(yōu)于1% Triton X-100作分散劑的樣品。由此證明了以去離子水作為分散劑制備懸濁液樣品是一種行之有效的方法，其制樣重復性更好，且使得中、高Z元素的定量結果更為準確。

表2 去離子水和1% Triton X-100作為分散劑的定量結果與ICP元素測定結果對比Table 2 De-ionized water, and Triton X-100 (1%) as disperser agents compared with ICP

2.4 樣品量分析

用于制備懸浮液的樣品量也會顯著影響TXRF分析。為了在全反射條件下進行分析，必須將樣品作為薄層置于反射載體上，因此沉積樣品的厚度(例如植物懸浮液的量)被視為是與基體效應相關的關鍵參數并且會影響元素測定。本實驗通過添加不同重量的粉末樣品于5 mL去離子水中制備了6種濃度懸濁液，從而對添加的樣品量進行分析。圖2顯示了凈計數隨樣品量的變化關系，懸濁液中各元素的凈計數會隨進樣量的增加而增加，但明顯能看出P，S，Ca這三種元素在樣品量大于6 mg·mL-1后趨于飽和，這是由于進樣量過高會導致元素達到飽和狀態(tài)，樣品薄膜厚度超過了射線的測量厚度，有可能不再處于全反射條件下，樣品中元素不能全部被X射線激發(fā)。圖3則顯示了進樣量對相對標準偏差的影響，樣品量在1 mg·mL-1時重復性較差，大于1 mg·mL-1的樣品量重復性沒有顯著差異，但當樣品量增加至8 mg·mL-1時，重復性也略微降低。同時計算了各進樣量下的檢出限，結果如圖4所示，結果顯示隨著樣品量的增加，檢出限也略微改善，但影響并不顯著。鑒于過高的樣品量會導致在玻片上形成的樣斑不再適用于全反射的測量，并考慮到結果的可重復性與檢出限，在進一步的實驗中使用4 mg·mL-1的樣品量。

圖2 進樣量對凈計數的影響Fig.2 Effect of sample amount on net counts

圖3 進樣量對相對標準偏差的影響Fig.3 Influence of sample amount on relative standard deviation

圖4 進樣量對檢出限的影響Fig.4 Influence of sample amount on limits of detection

2.5 粒徑分析

經過2.1對懸浮制樣方法的不確定度的分析可知樣品的制備是分析誤差的主要來源，我們針對粉末樣品懸浮制樣過程中一個重要的影響因素——粒徑進行了深入的研究，每種樣品均獨立重復測量4次取其平均值作為最終結果。首先對凈計數隨粒徑范圍的變化關系進行了研究，圖5顯示了粒徑范圍對凈計數的影響，對于凈計數，在粒徑小于180目的范圍內凈計數隨粒徑的減小而增大，而當粒徑大于一定目數(180目)后，凈計數則處于相對穩(wěn)定。這是因為樣品粒徑會對熒光強度產生影響，熒光強度隨樣品粒徑的減小而增強，達一定粒徑后熒光強度也保持穩(wěn)定的強度。隨后對精密性和準確性隨粒徑范圍的變化關系進行了探究，圖6展示了不同的粒徑范圍對結果的精密性和準確性的影響，每種粒徑下的3個樣品點9次重復測量的數據從最小到最大分別顯示在箱形圖中。我們以結果的分布表示精密度，準確性則以重復測量的中位數與經過驗證的ICP-OES/ICP-MS分析結果的一致性來評估，并于圖中右上角給出了經過驗證的ICP-OES/ICP-MS分析數據。

圖5 粒徑分布對凈計數的影響Fig.5 Effect of particle distribution size on net counts

樣品的粒徑大也代表著樣品顆粒間的間隙大，由于顆粒之間間隙過大，樣品不能被X射線有效激發(fā)，因此檢測結果的精密度與重復性較差，但隨著粒徑的減小，顆粒間隙小且密實，更容易被X射線激發(fā)。同時已有研究證明在玻片上沉積樣品時出現的微觀山體團聚效應會導致TXRF測量結果值出現較大偏差，而TXRF分析固體樣品中的團聚效應與固體顆粒大小有關[11]。正如圖6中結果顯示的，總體而言隨著粒徑范圍的減小，結果的分布范圍逐漸減小，表明隨著粒徑范圍的減小精密性提升，由于制樣與測量過程中的粉塵污染，Ca的精密性會受到一定的影響。對于測量結果的準確性，對于濃度較低的Mn準確性隨粒徑的減小而提升，對其他元素產生的影響差異并不大，粒徑大于200目后各元素的回收率均處于80%～120%之間。分析實驗結果可以明顯看出P和S所代表的輕元素的回收率隨粒徑的變化是一致的，精密度隨粒徑的減小而提高但準確性降低； K和Ca兩種元素的測量精密度均隨粒徑范圍的減小而提升但對準確性的影響并不顯著； Mn代表著低濃度元素，在粒徑小于200目的范圍內其精密度與準確性隨粒徑范圍的減小而優(yōu)化，但在粒徑大于200目后沒有明顯變化。

圖6 粒徑分布對TXRF測量結果的影響Fig.6 Influence of particle size distribution on TXRF measurement result

最后我們對不同粒徑下TXRF測量的不確定度進行了評估，通過式(4)量化每一個元素測量的不確定度，對于每種評估元素，應用k=2進行不確定性擴展[12]

(4)

圖7 粒徑分布對平均不確定度的影響Fig.7 Influence of particle size distribution on average uncertainty

3 結 論

以茶葉樣品為分析對象，對適用于全反射X射線熒光光譜法測量分析的植物粉末樣品制備成懸濁液的前處理方法進行研究，通過研磨將茶葉樣品制備成粉末樣品，對制備成懸濁液時的表面活性劑，樣品量與粉末樣品的粒徑進行分析，探討了分散劑，樣品量及粒徑對測量準確性的影響。研究結果為TXRF分析技術對粉末樣品定量分析提供了參考。獲得的主要結果：

(1)通過分析粒徑范圍大于180目的茶葉粉末樣品的五個獨立重復試樣，測試了TXRF法的整體精密度，分析了儀器的穩(wěn)定性與樣品制備過程中的不確定度。各元素的相對標準偏差在6.7%和16.74%之間，整體精度滿足檢測標準的要求。對于輕元素，其RSD值更高，均勻性相對較差，制樣引起的不確定度占比更大。對于濃度較低(～1 mg·L-1)的元素，儀器引起的不確定度更高。不論在何種元素與濃度范圍下，與樣品制備步驟相關的不確定度對獲得的結果的全局精度都有顯著貢獻(>60%)，由此樣品制備是分析誤差的主要來源。

(2)通過將粒徑范圍大于180目的茶葉粉末樣品分散于1% Triton X-100與去離子水兩種分散劑中，對分散劑的所產生的影響進行研究，結果與ICP進行比較后表明原子序數較大的元素定量結果與去離子水作分散劑的更為接近，同時以去離子水作為分散劑的樣品中各元素的相對標準偏差更小，樣品的重復性更好。證明了以去離子水作為分散劑是一種行之有效的方法。

(3)通過添加不同質量的粉末樣品于5 mL去離子水中對樣品量進行分析。結果顯示樣品量過低會導致制樣重復性較差，而過高的進樣量會導致元素達到飽和狀態(tài)，樣品薄膜厚度超過射線的測量厚度，有可能不再處于全反射條件下。對于植物粉末樣品20 mg/5 mL是一個較為合適的樣品量。

(4)通過對7種粒徑范圍的粉末樣品進行測量分析，研究了粒徑對測量結果的影響。在粒徑小于180目的范圍內凈計數隨粒徑的減小而增大； 在粒徑小于200目的范圍內精密度隨粒徑的減小而提升； 對于濃度較低的Mn準確性隨粒徑的減小而提升，對其他的元素沒有明顯提升； 在80～200目的范圍內，不確定度迅速降低，粒徑范圍大于200目后，不確定度低于10%，同時優(yōu)化程度減緩。綜合考慮凈計數、精密性與準確性，在制樣過程中樣品的粒徑范圍建議研磨至200～300目之間。

全反射X射線熒光技術是一種功能強大的分析工具，但在分析前需要將樣品進行預處理，原樣很少能直接分析，一種合適的制樣方法是準確分析樣品的重要前提，針對植物樣品利用懸濁法制樣時，粒徑是影響測量的重要因素，針對制樣方法及影響因素進行研究是定量結果準確性的重要保障。