傅里葉變換紅外光譜的牛乳中αs1-酪蛋白和κ-酪蛋白含量的快速檢測

肖仕杰，王巧華, 2*，樊懿楷，劉 銳, 阮 健，溫 萬，李季奇, 邵懷峰, 劉維華，張淑君*

1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，湖北 武漢 430070 2. 農(nóng)業(yè)部長江中下游農(nóng)業(yè)裝備重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070 3. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳育種與繁殖教育部實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070 4. 寧夏回族自治區(qū)畜牧工作站，寧夏 銀川 750002 5. 寧夏回族自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，寧夏 銀川 750011

引 言

牛乳中含有豐富的蛋白質(zhì)，對人體的生長發(fā)育起著重要作用，尤其對于嬰幼兒來說是不可或缺的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源，但同時，牛乳也是一種過敏原。FAO/WHO已經(jīng)將牛奶和乳制品確定為引發(fā)人類食物過敏現(xiàn)象的8種主要食物之一[1]，相關(guān)數(shù)據(jù)表明牛乳過敏患病率在嬰兒中高達(dá)2%～7.5%[2]，隨著乳制品銷量的增加，牛乳過敏率不斷上漲已變?yōu)椴豢珊雎缘氖称钒踩珕栴}。對牛乳過敏，實(shí)際上是對牛乳中的蛋白質(zhì)敏感，乳蛋白的兩個主要類別分別是乳清蛋白和酪蛋白，其中酪蛋白的含量約占總蛋白質(zhì)含量的80%，約65%的牛乳過敏人員對酪蛋白過敏。其中，αs1和κ-酪蛋白為主要的過敏原[3]。牛乳過敏目前無法根治，只能避免飲用牛奶或食用乳制品。牛乳蛋白過敏病人通常在消化系統(tǒng)和皮膚兩個方面有明顯的癥狀表現(xiàn)，如嘔吐、腹瀉、腹痛和濕疹、蕁麻疹等[4]，因此很多國家都制定了食品過敏原強(qiáng)制標(biāo)識條例來保障大眾健康[3]，我國制定的GB 7718—2011《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》[5]和GB/T 23779—2009《預(yù)包裝食品中的致敏原成分》[6]建議商家標(biāo)明可能的致敏物。

如果能夠可靠地檢測出牛乳中αs1和κ-酪蛋白的含量，就能為牛乳敏感人員提供飲用參考指示。乳成分的主要檢測方法有氣相色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和高效液相色譜法等，這些方法靈敏度高、可靠性好，但成本高、技術(shù)難度大、分析時間長，因此找到一種簡單高效的替代方法非常重要。紅外光譜法具有快速無損、簡單易行的優(yōu)點(diǎn)，相比于近紅外光譜，中紅外光譜的波段范圍更廣、包含的信息量更豐富，在國外被廣泛應(yīng)用于牛乳中各營養(yǎng)成分如蛋白成分的檢測。Etzion等[7]表明中紅外光譜法可以預(yù)測乳蛋白的含量，Bonfatti等[8]基于中紅外光譜對牛乳中的酪蛋白等的含量進(jìn)行了預(yù)測，Niero等[9]表明UVE算法可以提高中紅外光譜對乳蛋白組分含量的預(yù)測精度，McDermott等[10]基于中紅外光譜預(yù)測了牛乳中的蛋白質(zhì)和氨基酸含量。但在國內(nèi)，利用光譜技術(shù)檢測牛乳中蛋白成分的研究鮮有報道。

為此，本文利用傅里葉變換中紅外光譜技術(shù)對牛乳中αs1和κ-酪蛋白兩種過敏原進(jìn)行分析，利用競爭性自適應(yīng)重加權(quán)算法(competitive adaptive reweighed sampling, CARS)、無信息變量消除法(uninformative variables elimination, UVE)和連續(xù)投影算法(successive projections algorithm, SPA)篩選出能代表酪蛋白含量的特征變量，并利用支持向量機(jī)(support vector regression, SVR)模型分別構(gòu)建了αs1-酪蛋白含量和κ-酪蛋白含量的無損檢測模型, 模型的預(yù)測精度優(yōu)于Bonfatti等[8]、Niero等[9]和McDermott等[10]前人研究結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來源于河南、湖北、寧夏和內(nèi)蒙古四省區(qū)的211頭中國荷斯坦牛，一頭牛采集一份牛乳，牛乳采集利用自動擠奶裝置完成，先用消過毒的毛巾擦拭牛乳房，然后用碘甘油混合溶液再次消毒，擠出前三把乳汁后進(jìn)行牛乳采集，每份牛乳采集40 mL，分裝到直徑3.5 cm，高9 cm的圓柱形全新采樣瓶里，依次編號，并向每個采樣瓶里立即加入溴硝丙二醇防腐劑，緩慢搖晃使其充分溶解，運(yùn)回途中在牛乳樣品周圍放置冰袋防止變質(zhì)，到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后立即放入冰箱保存(4 ℃)，并于第二天進(jìn)行光譜采集。

1.2 儀器、設(shè)備和試劑

MilkoScanTM FT+[傅里葉變換中紅外光譜儀(FTIR)，丹麥FOSS公司]； 電熱恒溫水浴鍋； 十萬分之一電子天平； Waters e2695液相色譜儀。

αs-酪蛋白(lot C-6780，純度≥70%)、κ-酪蛋白(lot C-0406，純度≥80%)標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma 公司)； 乙腈(色譜級，純度≥99.8%)、鹽酸胍、三氟乙酸(TFA)(上海生工公司)； 其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 中紅外光譜的采集

利用MilkoScanTMFT+進(jìn)行光譜采集，具體采集步驟： 將牛乳分批放入45 ℃電熱恒溫水浴鍋內(nèi)預(yù)熱5 min，預(yù)熱好的牛乳放在檢測架上上下?lián)u晃數(shù)次使牛乳混合均勻，將檢測架放在檢測履帶上，打開瓶蓋，依次進(jìn)行檢測，采集完光譜后的牛乳置于-20 ℃冷凍保存。

1.3.2 αs1-酪蛋白和κ-酪蛋白的含量測定

(1)標(biāo)準(zhǔn)樣品的處理

先用去離子水將混合標(biāo)樣溶解，直到濃度約為10 g·L-1左右，然后往1 600 μL處理液(6 mol·L-1鹽酸胍溶液，內(nèi)含 0.1 mmol·L-1EDTA-Na2，pH 6.0)中滴加400 μL配好的標(biāo)樣溶液，于室溫下孵育90 min，上機(jī)前用0.22 μm尼龍濾膜過濾。

(2)牛乳的處理

取80 μL牛乳于320 μL處理液中，室溫孵育90 min，將離心機(jī)轉(zhuǎn)速調(diào)為14 000 r·min-1，5 min后取上清液。上機(jī)前用0.22 μm尼龍濾膜過濾。

(3)RP-HPLC的色譜條件

色譜柱： ZORBAX 300SB-C18； 進(jìn)樣量： 50 μL； 柱溫： 40 ℃； 流速： 1 mL·min-1； 洗脫時間： 42 min； 檢測波長： 214 nm。

流動相A： 10%乙腈+90%去離子水+0.1%TFA； B： 90%乙腈+10%去離子水+0.1% TFA。流動相B梯度(變化率)如下： 從33%到38%洗脫10 min(0.50%B·min-1)，從38%到40%洗脫6 min(約0.33%B·min-1)，保持40%洗脫6 min(0.00%B·min-1)，從40%到40.5%洗脫2 min(0.25%B·min-1)，保持40.5%洗脫2 min(0.00%B·min-1)，從40.5%到48%洗脫14 min(約0.54%B·min-1)，最后立刻以初始梯度平衡色譜柱2 min，準(zhǔn)備下一批牛乳的檢測，平均每批次檢測牛乳30份。

同一批次檢測結(jié)束后用10%甲醇+90%去離子水與100%甲醇清洗色譜柱，以保證下一批次牛乳的正常檢測。

1.4 光譜預(yù)處理、特征提取

牛乳膠束的散射以及儀器運(yùn)行過程中產(chǎn)生的隨機(jī)噪聲會對光譜造成干擾，因此光譜中不僅包含許多有用的化學(xué)信息，還存在大量的背景噪聲和無用信息。為了最大可能的削弱干擾信息，保留有效信息，提高模型的穩(wěn)鍵性，正式建模前先對光譜預(yù)處理。分別利用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(standard normal variate transformation, SNV)、多元散射校正(multivariate scatter correction, MSC)、一階導(dǎo)數(shù)、一階差分、歸一化(normalize)、二階導(dǎo)數(shù)和二階差分7種方法進(jìn)行預(yù)處理。

中紅外光譜的波段范圍廣，冗余信息繁多，通過特征提取算法，能夠大大減少光譜維數(shù)，優(yōu)化算法，提高模型的識別率。本文利用CARS、UVE和SPA算法提取特征變量。

CARS算法[11]基于“優(yōu)勝劣汰”準(zhǔn)則剔除不適應(yīng)的波長變量，在有效去除無信息變量的同時壓縮共線性變量，最終選擇出針對預(yù)測目標(biāo)最為關(guān)鍵的變量。

UVE算法[12]基于PLS回歸系數(shù)進(jìn)行變量選擇，該算法的基本思想是利用回歸系數(shù)來衡量變量的權(quán)重，消除模型中低貢獻(xiàn)率的特征變量。

SPA算法[13]是一種讓變量間共線性最小化的算法，能夠減少干擾信息。

1.5 模型的評價指標(biāo)

通過訓(xùn)練集相關(guān)系數(shù)(Rc)和訓(xùn)練集均方根誤差(RMSEC)以及測試集相關(guān)系數(shù)(Rp)和測試集均方根誤差(RMSEP)對模型的精度和可信度進(jìn)行評價。Rc(Rp)高，則預(yù)測結(jié)果好，RMSEC(RMSEP)低，則穩(wěn)定性好。各評價指標(biāo)的相關(guān)計算公式如式(1)和式(2)

(1)

(2)

其中，ypi為訓(xùn)練集或測試集中第i份牛乳的預(yù)測值，ymi為訓(xùn)練集或測試集中第i份牛乳的實(shí)測值，ymean為訓(xùn)練集或測試集牛乳實(shí)測值的平均值，n為訓(xùn)練集或測試集的牛乳總數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜分析

圖1 牛乳的原始光譜Fig.1 Original spectra of cow’s milk

圖2 牛乳的平均光譜Fig.2 Average spectra of cow’s milk

考慮到酰胺Ⅰ帶與水的吸收區(qū)域1 597～1 712 cm-1基本重合，同時Etzion等[7]的研究表明酰胺Ⅰ帶最有可能不受水的影響，對比了去除1 597～1 712 cm-1前后的效果，發(fā)現(xiàn)保留該部分的效果更好。在3 680～4 000 cm-1譜區(qū)，沒有觀察到特征峰，對比了去除3 680～4 000 cm-1前后的效果，發(fā)現(xiàn)去除該部分的效果更好，于是選擇925.92～3 005.382 cm-1的光譜區(qū)域。此外，經(jīng)探索研究發(fā)現(xiàn)先對光譜手動降維，即每隔一個波點(diǎn)(對應(yīng)波數(shù)為3.858 cm-1)取一個透射率，再進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，可以優(yōu)化模型的最終效果。因此，先對光譜手動降維，使波數(shù)范圍由925.92～3 005.382 cm-1變?yōu)?25.92～3 001.524 cm-1，波點(diǎn)數(shù)由540變?yōu)?70，最終選擇925.92～3 001.524 cm-1的光譜區(qū)域用于后續(xù)建模。

2.2 MCCV法剔除奇異樣本

由于牛乳膠狀結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，容易發(fā)生沉淀和析出，可能出現(xiàn)奇異樣本，本研究利用蒙特卡洛交叉驗(yàn)證法(Monte-Carlocross-validation，MCCV)對αs1和κ-酪蛋白分別進(jìn)行奇異樣本檢測與剔除。MCCV基于 PLS獲取最佳主成分?jǐn)?shù)，利用隨機(jī)數(shù)按4∶1的原則將光譜數(shù)據(jù)和酪蛋白測定值劃分為訓(xùn)練集和測試集，分別建立PLS回歸模型，設(shè)定循環(huán)次數(shù)為2 500，計算出各牛乳的預(yù)測殘差后分別求均值與方差[16]，結(jié)果如圖3所示，αs1-酪蛋白模型的奇異樣本編號為39號、75號和141號，κ-酪蛋白模型的奇異樣本編號為61號、75號、76號、141號和144號。

圖3 (a)αs1和(b)κ-酪蛋白的均值-方差分布圖Fig.3 Mean value and variance distributions of (a)αs1 and (b) κ-casein

2.3 樣本劃分

SPXY(sample set partitioning based on joint X-Y distances)法在劃分樣本時同時了考慮光譜數(shù)據(jù)和測定的理化指標(biāo)，被劃分的樣本集更合理[11]，本文利用SPXY將剔除異常后的樣本按7∶3劃分為訓(xùn)練集和測試集。其中，αs1-酪蛋白的訓(xùn)練集和測試集樣本數(shù)量分別為146和62，κ-酪蛋白的訓(xùn)練集和測試集樣本數(shù)量分別為145和61，各樣本集的數(shù)據(jù)統(tǒng)計情況如表1所示。

表1 利用SPXY算法劃分樣本集的數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 1 Data statistics of partitioning sample sets by SPXY algorithm

2.4 光譜預(yù)處理和特征變量選擇

在導(dǎo)數(shù)預(yù)處理中，利用Savitzky-Golay求導(dǎo)法進(jìn)行9點(diǎn)平滑、3點(diǎn)差分寬度的導(dǎo)數(shù)預(yù)處理。使用CARS，UVE和SPA分別對預(yù)處理后的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行特征提取，分別找出能夠代表αs1-酪蛋白含量與κ-酪蛋白含量的特征變量。因?yàn)棣羢1和κ-酪蛋白的特征變量選擇過程相同，下文僅以αs1-酪蛋白的特征變量選擇為例分別對CARS、UVE和SPA的變量選擇過程進(jìn)行闡述。

(1)CARS進(jìn)行變量選擇的過程如圖4所示，將CARS的采樣次數(shù)設(shè)為50，采用5折交叉驗(yàn)證，重采樣率為0.8。圖4(a)表明，隨著取樣運(yùn)行次數(shù)的增加，被選取的特征變量數(shù)量在逐步減少。圖4(b)的均方根誤差(RMSECV)值先逐漸減小，表明無用信息被消除，再逐漸增加，表明有效信息被消除。圖4(c)豎線處迭代22次，取得最小RMSECV值。

圖4 CARS變量選擇Fig.4 Variable selection of CARS

(2)UVE進(jìn)行變量選擇的過程如圖5所示，將UVE的閾值參數(shù)設(shè)為0.99，結(jié)合20個主成分?jǐn)?shù)建立PLS模型進(jìn)行變量選擇。圖中左側(cè)曲線表示實(shí)變量，右側(cè)曲線表示添加的隨機(jī)變量，兩條水平虛線為隨機(jī)變量的最大閾值線，兩條水平線之間為被剔除的非有用變量，水平線之外則為建模的特征變量，共選出108個變量組合。

圖5 UVE消除算法篩選特征波長Fig.5 Screening characteristic wavelengths by UVE

(3)SPA進(jìn)行變量選擇的過程如圖6所示，根據(jù)RMSE的變化來確定被選取的特征變量。在變量個數(shù)的增加過程中，RMSE先迅速下降，說明光譜中的無效信息被高效剔除，然后趨于平穩(wěn)，說明無效信息基本有效剔除，選擇此過渡點(diǎn)處的變量作為被選取的特征變量組合。

圖6 (a)RMSE； (b)選取的最優(yōu)波長編號索引Fig.6 (a) RMSE； (b) Selected optimal wavelength number index

2.5 模型建立與分析

將不同的預(yù)處理和特征選擇算法結(jié)合獲得的特征變量組合分別帶入SVR模型，αs1-酪蛋白的預(yù)測結(jié)果如表2所示。對于CARS算法，一階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理的光譜數(shù)據(jù)帶入SVR模型取得了最優(yōu)效果，選擇的特征變量數(shù)量為24，占建模光譜變量的8.89%； 對于UVE算法，一階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理的光譜數(shù)據(jù)代入SVR模型取得了最優(yōu)效果，選擇的特征變量數(shù)量為108，占建模光譜變量的40%； 對于SPA算法，直接將建模光譜帶入SVR模型取得了最優(yōu)效果，選擇的特征變量數(shù)量為23，占建模光譜變量的8.52%。

表2 基于3種特征選擇算法建立的αs1-酪蛋白SVR預(yù)測模型Table 2 SVR prediction model of αs1-casein based on 3 characteristic variable selection methods

κ-酪蛋白的預(yù)測結(jié)果分別如表3所示。對于CARS算法，二階差分預(yù)處理的光譜數(shù)據(jù)帶入SVR模型取得了最優(yōu)效果，選擇的特征變量數(shù)量為16，占建模光譜變量的5.93%； 對于UVE算法，一階差分預(yù)處理的光譜數(shù)據(jù)帶入SVR模型取得了最優(yōu)效果，選擇的特征變量數(shù)量為55，占建模光譜變量的20.37%； 對于SPA算法，一階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理的光譜數(shù)據(jù)帶入SVR模型取得了最優(yōu)效果，選擇的特征變量數(shù)量為14，占建模光譜變量的5.19%。

表3 基于不同特征選擇算法建立的κ-酪蛋白SVR預(yù)測模型Table 3 SVR prediction model of κ-casein based on different characteristic variable selection methods

2.6 最優(yōu)模型的比較

對于αs1-酪蛋白預(yù)測模型，CARS算法與UVE算法建立的SVR模型訓(xùn)練集Rc和測試集Rp均在0.85以上，SPA算法建立的SVR模型訓(xùn)練集Rc和測試集Rp在0.82和0.85之間，一階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理和CARS算法結(jié)合建立的SVR模型最優(yōu)，訓(xùn)練集Rc和測試集Rp分別為0.882 7和0.899 8，訓(xùn)練集RMSEC和測試集RMSEP分別為1.136 3和1.372 6。對于κ-酪蛋白，CARS算法、UVE算法和SPA算法建立的SVR模型訓(xùn)練集Rc和測試集Rp均在0.85以上，一階差分預(yù)處理和UVE算法結(jié)合建立的SVR模型最優(yōu)，訓(xùn)練集Rc和測試集Rp分別為0.880 8和0.890 3，訓(xùn)練集RMSEC和測試集RMSEP分別為0.534 5和0.535 4。分別將αs1和κ-酪蛋白含量的最優(yōu)SVR回歸模型用散點(diǎn)圖表示，預(yù)測結(jié)果如圖7和圖8所示。

圖7 基于CARS的αs1-酪蛋白最優(yōu)模型Fig.7 Optimal model for αs1-casein based on CARS

圖8 基于UVE的κ-酪蛋白最優(yōu)模型Fig.8 Optimal model for κ-casein based on UVE

3 結(jié) 論

基于傅里葉變換中紅外光譜技術(shù)，分別建立了牛乳中αs1和κ-酪蛋白含量的SVR無損快速檢測模型。

對于αs1-酪蛋白，一階導(dǎo)數(shù)結(jié)合CARS算法、一階導(dǎo)數(shù)結(jié)合UVE算法和原始光譜結(jié)合SPA算法的最優(yōu)模型提取的特征變量數(shù)分別為24，108和23。結(jié)果表明，αs1-酪蛋白含量的最佳預(yù)測模型為一階導(dǎo)數(shù)與CARS算法結(jié)合建立的SVR回歸模型，訓(xùn)練集Rc和RMSEC分別為0.882 7和1.136 3，測試集Rp和RMSEP分別為0.899 8和1.372 6； UVE算法提取的特征變量包含無效信息，影響了預(yù)測精度；CARS算法與SPA算法提取的特征變量數(shù)相當(dāng)，但SPA算法的精度遠(yuǎn)低于CARS算法，表明SPA算法不適合αs1-酪蛋白含量預(yù)測模型的建立。

對于κ-酪蛋白，二階差分結(jié)合CARS算法、一階差分結(jié)合UVE算法和一階導(dǎo)數(shù)結(jié)合SPA算法的最優(yōu)模型提取的特征變量數(shù)分別為16，55和14； 結(jié)果表明，κ-酪蛋白含量的最佳預(yù)測模型為一階差分和UVE算法結(jié)合建立的SVR模型，訓(xùn)練集Rc和RMSEC分別為0.880 8和0.534 5，測試集Rp和RMSEP分別為0.890 3和0.535 4。三種算法的預(yù)測精度較為接近，UVE算法優(yōu)于CARS算法與SPA算法，表明κ-酪蛋白含量最佳預(yù)測模型的建立需要提取更多的特征變量。

本研究可為后續(xù)利用中紅外光譜法對牛乳中其他與過敏有關(guān)的蛋白含量進(jìn)行快速無損檢測提供重要參考。