miR-374-5p調(diào)控Bax影響缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制

朱磊 付攀 王立莎

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院 1心血管內(nèi)科，湖北 襄陽 441000；2放射影像科)

心肌梗死(MI)是致死率最高的心血管疾病之一，持續(xù)性的心肌缺血引起的缺氧是引起心肌梗死時細(xì)胞凋亡的主要原因〔1〕。因此，如何有效地增強(qiáng)心肌細(xì)胞活力、減少心肌細(xì)胞凋亡、改善血流障礙是治療心肌梗死的重要策略。B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2相關(guān)X蛋白(Bax)基因是Bcl-2家族成員之一，其編碼的Bax蛋白通過誘導(dǎo)細(xì)胞色素c的釋放，激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔2,3〕。研究表明芹菜素和黃芩莖葉總黃酮通過下調(diào)Bax表達(dá)對缺血或缺氧造成的心肌細(xì)胞凋亡有一定的保護(hù)作用〔4,5〕。miRNAs是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平參與調(diào)控各種生物學(xué)過程。何淑芳等〔6〕在用芯片法篩選缺氧處理誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞差異表達(dá)的miRNA時發(fā)現(xiàn)，缺氧可以下調(diào)大鼠心肌細(xì)胞中miR-374-5p的表達(dá)。但miR-374-5p對缺氧誘導(dǎo)的大鼠凋亡的影響且miR-374-5p能否介導(dǎo)Bax表達(dá)參與對缺氧誘導(dǎo)的大鼠凋亡的調(diào)控目前并不清楚。本實驗以H9c2細(xì)胞缺氧處理建立細(xì)胞模型，旨在探討miR-374-5p對缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響及其可能的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要實驗材料、試劑與儀器 大鼠心肌細(xì)胞H9c2和CP-R073購自ATCC；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基及1%青/鏈霉素購自美國Hyclone公司；LipofectamineTM2000相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑和Trizol試劑購自美國Invitrogen公司。miR-NC、miR-374-5p、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Bax、WT-Bax和MUT-Bax由上海生工生物工程有限公司構(gòu)建和測序；miR-374-5p、Bax、U6和GAPDH引物購自廣州銳博公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；RIPA裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑、DMSO、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、Western洗滌液及封閉液購自北京索萊寶生物技術(shù)公司；Bax、GAPDH、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、Bcl-2和p21等鼠抗人一抗購自美國Santa Cruz公司；Annexin V/PI試劑盒購自貝博生物公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗鼠二抗購自武漢博士德公司。凝膠成像系統(tǒng)購自BIO-RID公司；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀購自美國ABI公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；酶標(biāo)儀購于美國Awareness Technology公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 用含有10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)心肌細(xì)胞(H9c2和CP-R073)，當(dāng)細(xì)胞約鋪滿瓶底的80%時，用胰酶處理后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對數(shù)期生長良好的H9c2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，以2×105個/孔細(xì)胞數(shù)接種于96孔培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到50%時，利用LipofectamineTM2000將miR-NC和miR-374-5p分別轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞，于細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h，隨后進(jìn)行缺氧處理8 h后進(jìn)行后續(xù)實驗。將心肌細(xì)胞H9c2和CP-R073分別在缺氧條件(37℃、5%CO2和95%N2)下培養(yǎng)8 h，以缺氧處理的H9c2細(xì)胞建立心肌細(xì)胞缺氧模型，實驗分為6組：H9c2常氧培養(yǎng)組(不做處理)、H9c2缺氧培養(yǎng)組(缺氧處理)、缺氧+miR-374-5p組(轉(zhuǎn)染miR-374-5p后，進(jìn)行缺氧處理)、缺氧+miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC后，進(jìn)行缺氧處理)、缺氧+miR-374-5p+pcDNA3.1-Bax組(轉(zhuǎn)染miR-374-5p和pcDNA3.1-Bax后，進(jìn)行缺氧處理)和缺氧+miR-374-5p+pcDNA3.1組(轉(zhuǎn)染miR-374-5p和pcDNA3.1后，進(jìn)行缺氧處理)。

1.3qRT-PCR檢測 按照Trizol試劑使用說明書分別從各組細(xì)胞中提取總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。U6和GAPDH分別作為miR-374-5p和Bax mRNA的內(nèi)源性對照，用2-ΔΔCt方法計算目標(biāo)基因的相對表達(dá)量。

1.4MTT檢測 取各處理組H9c2細(xì)胞，分別于轉(zhuǎn)染完成后24 h、48 h和72 h時間點每孔加入20 μl的MTT溶液，室溫反應(yīng)4 h后吸去孔內(nèi)上清液，每孔再加入150 μl的DMSO，震蕩5 min至完全溶解。用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定各孔的OD值(以空白孔進(jìn)行調(diào)零)。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測 取各組H9c2細(xì)胞，用胰酶(不含EDTA)消化后離心，棄上清收集各組細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗細(xì)胞后，加入300 μl的1×結(jié)合緩沖液吹打重懸細(xì)胞，然后加入5 μl的Annexin V-FITC混勻，室溫避光孵育15 min，隨后加入5 μl的PI染色，補(bǔ)加200 μl的1×結(jié)合緩沖液后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.6Western印跡檢測 收集各組細(xì)胞后加入RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用洗滌液洗膜后加入封閉液室溫封閉2 h，吸盡封閉液后加入相應(yīng)的稀釋好的抗Bax、GAPDH、CyclinD1和P21的特異性抗體4℃孵育過夜，用洗滌液后，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶500)室溫孵育膜2 h，用洗膜液洗膜3次后，用化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)進(jìn)行顯色，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，并利用ImageJ軟件分析各蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量(以GAPDH作為內(nèi)參)。

1.7雙熒光素酶報告基因檢測 利用靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫Targetscan網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/vert/)預(yù)測miR-374-5p的靶基因。發(fā)現(xiàn)miR-374-5p的5′端可與Bax的3′-UTR特異性結(jié)合，猜測Bax是miR-374-5p的靶基因。為驗證這一猜想，構(gòu)建野生型WT-Bax和突變型MUT-Bax的Bax 3′-UTR熒光素酶報告載體。利用LipofectamineTM2000將miR-374-5p和miR-NC分別與WT-Bax和MUT-Bax共轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測點各組H9c2細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-374-5p在正常培養(yǎng)及缺氧處理的大鼠心肌細(xì)胞H9c2和CP-R073中的表達(dá) 與H9c2常氧培養(yǎng)組miR-374-5p的表達(dá)水平(0.86±0.08)相比，H9c2缺氧培養(yǎng)組表達(dá)顯著降低(0.34±0.03，P<0.05)；與CP-R073常氧培養(yǎng)組miR-374-5p的表達(dá)水平(0.73±0.07)相比，CP-R073缺氧培養(yǎng)組表達(dá)顯著降低(0.52±0.05，P<0.05)。表明缺氧處理可抑制大鼠心肌細(xì)胞中miR-374-5p的表達(dá)。

2.2過表達(dá)miR-374-5p對缺氧培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞H9c2增殖的影響 與miR-NC組相比，miR-374-5p組缺氧培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞H9c2中miR-374-5p表達(dá)顯著增加(P<0.05)，表明成功構(gòu)建了過表達(dá)miR-374-5p的H9c2細(xì)胞株。與miR-NC組相比，miR-374-5p組缺氧培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞H9c2在24 h、48 h和72 h時間點細(xì)胞增殖活力顯著上升，CyclinD1蛋白表達(dá)顯著升高，P21蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖1、表1。表明過表達(dá)miR-374-5p可減輕缺氧處理對大鼠心肌細(xì)胞的增殖抑制。

圖1 過表達(dá)miR-374-5p對缺氧培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞增殖蛋白表達(dá)的影響

表1 過表達(dá)miR-374-5p對缺氧處理的H9c2細(xì)胞增殖及凋亡的影響

2.3過表達(dá)miR-374-5p對缺氧處理的大鼠心肌細(xì)胞H9c2凋亡的影響 與miR-NC組相比，miR-374-5p組缺氧處理的H9c2細(xì)胞的凋亡率顯著降低，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)顯著降低，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表1、圖2、圖3。表明過表達(dá)miR-374-5p可減弱缺氧處理對大鼠心肌細(xì)胞的促凋亡作用。

圖2 過表達(dá)miR-374-5p對缺氧處理的H9c2細(xì)胞凋亡的影響

圖3 過表達(dá)miR-374-5p對缺氧處理的H9c2細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

2.4miR-374-5p靶向調(diào)控Bax miR-374-5p與WT-Bax的3′UTR之間存在特異性結(jié)合位點。見圖4。野生型Bax基因熒光素酶表達(dá)載體WT-Bax和miR-374-5p mimics共轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞后，miR-374-5p組H9c2細(xì)胞熒光素酶活性較再轉(zhuǎn)染miR-NC組明顯降低(P<0.05)；而突變型Bax基因熒光素酶表達(dá)載體MUT-Bax和miR-374-5p mimics共轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞后，miR-374-5p組H9c2細(xì)胞熒光素酶活性較再轉(zhuǎn)染miR-NC組差異不顯著(P>0.05)。見表2。與miR-NC組比較，miR-374-5p組H9c2細(xì)胞Bax mRNA和Bax蛋白的表達(dá)量顯著減低；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-374-5p組H9c2細(xì)胞Bax mRNA和Bax蛋白的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見圖5、表3。表明Bax是miR-374-5p的靶基因，miR-374-5p可負(fù)性調(diào)控Bax的表達(dá)。

圖4 Bax的3′UTR含有miR-374-5p的互補(bǔ)序列

表2 雙熒光素酶報告實驗

1～4：miR-NC組，miR-374-5p組，anti-miR-NC組，anti-miR-374-5p組圖5 miR-374-5p調(diào)控Bax的表達(dá)

表3 miR-374-5p調(diào)控Bax的表達(dá)

2.5過表達(dá)Bax能逆轉(zhuǎn)miR-374-5p對缺氧處理的大鼠心肌細(xì)胞H9c2增殖的促進(jìn)作用 與miR-374-5p+pcDNA3.1相比，miR-374-5p+pcDNA3.1-Bax組缺氧處理的大鼠心肌細(xì)胞H9c2在24 h、48 h和72 h時間點細(xì)胞增殖活力顯著下降，CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低，P21蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見圖6、表4。表明過表達(dá)Bax能逆轉(zhuǎn)miR-374-5p對缺氧處理的H9c2細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。

2.6過表達(dá)Bax能逆轉(zhuǎn)miR-374-5p對缺氧處理的大鼠心肌細(xì)胞H9c2凋亡的抑制作用 與miR-374-5p+pcDNA3.1組相比，miR-374-5p+pcDNA3.1-Bax組缺氧處理的H9c2細(xì)胞的凋亡率顯著升高，Bax蛋白的表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著降低。見表4，圖7。表明過表達(dá)Bax能逆轉(zhuǎn)miR-374-5p對缺氧處理的大鼠心肌細(xì)胞H9c2的凋亡抑制作用。

1,2：miR-NC組，miR-374-5p組，下圖同圖6 過表達(dá)Bax能逆轉(zhuǎn)miR-374-5p對缺氧處理的H9c2細(xì)胞增殖蛋白的表達(dá)

表4 過表達(dá)Bax能逆轉(zhuǎn)miR-374-5p對缺氧處理的H9c2細(xì)胞增殖及凋亡的影響

圖7 過表達(dá)Bax能逆轉(zhuǎn)miR-374-5p對缺氧處理的H9c2細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)

3 討 論

研究表明miRNA通過調(diào)控心肌細(xì)胞的凋亡，在心肌缺氧/復(fù)氧和缺血/再灌注等過程中發(fā)揮重要作用〔7〕。miRNA-340-5p通過調(diào)控Act1/NF-κB通路對缺氧/復(fù)氧引起的心肌細(xì)胞凋亡具有抑制作用〔8〕；miRNA-133a通過下調(diào)凋亡蛋白Bcl-xl和Bcl-xs的表達(dá)減少再灌注后心肌細(xì)胞凋亡，對缺血處理的心肌具有保護(hù)作用〔9〕；然而，miR-145-5p靶向雙特異性磷酸酶6誘導(dǎo)缺血再灌注后細(xì)胞凋亡〔10〕。miR-374-5p是心肌細(xì)胞中異常低表達(dá)的miRNA之一，有報道稱，在七氟烷預(yù)處理后大鼠心肌缺血再灌注模型中，miRNA-374通過激活PI3K/Akt通路抑制SP1發(fā)揮保護(hù)作用；miR-374還可通過抑肌營養(yǎng)不良蛋白(dtna)介導(dǎo)的Notch1軸活性，對胸硬膜外麻醉小鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用〔11，12〕。Bax被認(rèn)為是最重要的促凋亡基因，缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡是在對多種凋亡相關(guān)基因的調(diào)控下進(jìn)行的。多項研究表明，通過抑制Bax基因表達(dá)，可減輕缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷〔13，14〕。

CyclinD1和P21是主要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，CyclinD1通過與CDKs結(jié)合，促進(jìn)Rb的磷酸化，進(jìn)而通過調(diào)控一系列核內(nèi)過程，促進(jìn)細(xì)胞增殖〔15〕；P21則通過抑制CyclinD1/CDKs復(fù)合物的活性抑制細(xì)胞增殖〔16〕。Bax和Bcl-2是兩種結(jié)構(gòu)相似作用相反的可溶性蛋白，當(dāng)細(xì)胞凋亡信號發(fā)出時，Bax通過胞質(zhì)進(jìn)入線粒體，與線粒體膜上的Bcl-2結(jié)合形成二聚體發(fā)揮作用〔17，18〕。當(dāng)Bcl-2表達(dá)較高時，形成異源二聚體(Bax/Bcl-2)抑制細(xì)胞凋亡；當(dāng)Bax表達(dá)較高時，形成同源二聚體(Bax/Bax)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。miR-374-5p可能通過下調(diào)P21和Bax表達(dá)，上調(diào)CyclinD1和Bcl-2表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)H9c2細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。本研究結(jié)果提示miR-374-5p通過下調(diào)Bax表達(dá)抑制缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。

綜上，miR-374-5p在缺氧誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞中低表達(dá)，且miR-374-5p可通過靶向下調(diào)Bax表達(dá)抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。