美膚散對(duì)黃褐斑模型小鼠SOD、MDA、TYR、LF和黑色素細(xì)胞的影響

王彩霞

(寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004)

黃褐斑又稱“肝斑”“黧黑斑”，是一種好發(fā)于女性顏面部且治療困難的色素增多性皮膚病〔1〕。皮損為黃褐色或深褐色斑片，常對(duì)稱分布于面頰部、顴部，呈蝴蝶形，或累及口、鼻、前額和頦部呈不規(guī)則形狀〔2〕。本病病程長(zhǎng)，病情頑固，屬難治性皮膚病，對(duì)患者生理、心理、精神等方面造成嚴(yán)重影響〔3〕。其主要致病因素為內(nèi)分泌紊亂、日曬、情緒、遺傳、化妝品及長(zhǎng)期口服避孕藥等，其他危險(xiǎn)因素包括甲狀腺疾病、光毒性藥物、抗癲癇藥物等〔4〕。美膚散為自擬方是寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)(中醫(yī))院中醫(yī)美容科外敷治療黃褐斑的經(jīng)驗(yàn)用方，臨床應(yīng)用療效顯著。本研究主要探討美膚散對(duì)黃褐斑的治療作用及機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥物 美膚散組成為丹參、當(dāng)歸、白附子、僵蠶、黃芪等(均由寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)院中藥房提供)。將上述中藥材清洗干凈，烘干后按照重量配比混合在一起，然后將混合的中草藥研磨成粉末，并將粉末過(guò)150～300目篩，收集過(guò)篩后的粉末并攪拌均勻，再用鈷60照射滅菌，得到美膚散中藥面膜粉，將其密封保存待用。每次實(shí)驗(yàn)時(shí)將美膚散用市售純牛奶調(diào)配成1.2 g/ml美膚散混懸液，供小鼠外敷使用。黃體酮注射液：每支10 mg/ml(山西晉新雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司)，維生素C注射液(徐州萊恩藥業(yè)有限公司)，濃度：0.5 g/2 ml。

1.2動(dòng)物 C57BL/6J小鼠40只，清潔級(jí)，雌性，體重(20±2)g，均由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3試劑 超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、脂褐質(zhì)(LF)、考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒(均購(gòu)于南京建成生物工程研究所)，酪氨酸酶(TYR)測(cè)定試劑盒(由南京建成生物工程有限公司代購(gòu))。鼠抗人單克隆抗體HMB45即用型試劑盒(購(gòu)于福建邁新公司)。

1.4儀器 EB-160/FE紫外燈(美國(guó)spectronics公司)，DY89-Ⅱ電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(上海將來(lái)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，DK-420S型三用恒溫水箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，TDL-5-A型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，F(xiàn)L45熒光分光光度計(jì)(美國(guó)PE公司)，722分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)，ELx808全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)佰騰)。

1.5動(dòng)物分組與造模 將小鼠按數(shù)字分組法分為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(維生素C組)、美膚散組，每組10只。采用黃體酮注射液聯(lián)合中波紫外線照射的方法進(jìn)行造模。實(shí)驗(yàn)前24 h，各組小鼠均用8%硫化鈉(Na2S)水溶液脫去小鼠背部短毛(面積約2.0 cm×2.0 cm)，脫毛后用溫水清洗干凈，實(shí)驗(yàn)期間每周脫毛1次。除空白組外，其余各組均以波長(zhǎng)為280～320 nm的中波紫外線(UVB)每日照射小鼠背部皮膚1次，照射時(shí)間為1 h，光源距離小鼠20 cm，連續(xù)照射30 d。同時(shí)，除空白組外，其余各組均肌肉注射黃體酮注射液20 mg/(kg·d)，而空白組肌肉注射滅菌注射用水2 ml/(kg·d)。各組均注射于小鼠大腿根部，每日1次，兩腿交替進(jìn)行，連續(xù)30 d。

1.6給藥方法 造模同時(shí)，美膚散組外敷美膚散混懸液，陽(yáng)性對(duì)照組外涂維生素C水溶液，空白組及模型組外涂滅菌注射用水。以上治療每日1次，每次30 min，連續(xù)給藥30 d。

1.7生化指標(biāo)檢測(cè) 于第30天末次給藥2 h后將所有小鼠斷頸處死，迅速取其經(jīng)紫外線照射部位皮膚0.5 g左右，冰浴中制成10%組織勻漿，再將10%勻漿離心，取上清液，并嚴(yán)格按照試劑盒提供的方法，測(cè)定皮膚和肝臟組織中SOD活性及MDA、酪氨酸酶(TYR)、LF水平。

1.8皮膚黑色素細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)觀察 分別取小鼠照射部位皮膚組織1塊(1 cm×1 cm)，用10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片后，再經(jīng)脫蠟至水、抗原修復(fù)，用HMB45(黑素瘤)為第一抗體，采用免疫組化技術(shù)顯示表皮中的黑素顆粒，觀察黑色素細(xì)胞在表皮中的分布及分泌功能情況。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1美膚散皮膚組織中黑色素細(xì)胞數(shù)、TYR、MDA、LF及 SOD 活性的影響 與空白組比較，模型組皮膚組織中黑色素細(xì)胞數(shù)目、TYR、MDA及LF含量均顯著增加，SOD顯著降低(P<0.01)，提示造模成功；與模型組比較，美膚散組明顯減少黑色素細(xì)胞數(shù)目，明顯降低皮膚中TYR、MDA及LF含量(P<0.01)，同時(shí)提高皮膚中 SOD 活性(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組黑色素細(xì)胞數(shù)、TYR、MDA、LF含量及SOD活性的影響

2.2美膚散對(duì)黃褐斑肝臟組織中TYR、MDA、LF及 SOD 活性的影響 與空白組比較，模型組小鼠肝臟組織中TYR、MDA及LF含量均顯著增加；SOD顯著降低(P<0.001)；與模型組比較，美膚散組明顯降低皮膚中TYR、MDA及LF含量(P<0.01)，同時(shí)顯著提高皮膚中 SOD 活性(P<0.05)，見(jiàn)表1。

3 討 論

黃褐斑是一種臨床上常見(jiàn)的慢性面部色素代謝障礙性皮膚病〔5〕。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，黃褐斑是由人體黑色素生成異常導(dǎo)致，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，可能的相關(guān)因素也較多，目前認(rèn)為人體內(nèi)分泌失調(diào)、紫外線照射、遺傳因素是其主要因素〔4〕。而氧化與抗氧化之間的平衡失調(diào)，是黃褐斑公認(rèn)的主要誘因〔6〕。當(dāng)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化增強(qiáng)，氧自由基生成過(guò)量時(shí)，體內(nèi)的SOD、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等抗氧化物質(zhì)就會(huì)增加，從而清除多余的氧自由基，使機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)〔7〕。黃褐斑患者體內(nèi)氧化應(yīng)激系統(tǒng)大多出現(xiàn)障礙，氧自由基生成過(guò)多和抗氧化酶活性降低均可造成生物膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，使膜的結(jié)構(gòu)和功能受損而引發(fā)黃褐斑〔8〕。因此，抗氧化也是黃褐斑治療的重要機(jī)制之一。

黑色素生成過(guò)多是黃褐斑形成的根本原因〔4〕。黑色素主要由人體皮膚表皮基底層的黑色素細(xì)胞產(chǎn)生，其含量和分布決定了皮膚的顏色〔9〕。但黑色素在基底層的異常蓄積會(huì)造成色素沉著過(guò)度從而引起黃褐斑、雀斑和老年斑等，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量〔10〕。研究表明，TYR在黑色素生物合成中扮演著重要角色，它是一種含銅的多酚氧化酶，廣泛存在于微生物、動(dòng)植物及人體中，是酪氨酸和多巴向黑色素轉(zhuǎn)變過(guò)程中的關(guān)鍵酶、限速酶，它的活性大小決定著黑色素合成的數(shù)量〔11,12〕。因此，通過(guò)抑制TYR活性，即可阻斷黑色素生物合成反應(yīng)鏈，有效防止黑色素的過(guò)度沉積，從而起到抑制黃褐斑的作用〔13,14〕。

美膚散為自擬方，是根據(jù)黃褐斑的皮損特點(diǎn)，選用具有活血養(yǎng)血、祛斑化瘀、美容養(yǎng)顏、補(bǔ)血消斑功效的中藥組成的復(fù)方。本方由丹參、當(dāng)歸、白附子、僵蠶、黃芪等中藥組成。其中丹參活血祛瘀，養(yǎng)血涼血〔15〕；當(dāng)歸養(yǎng)血活血，潤(rùn)澤亮膚〔16〕；白附子解毒散結(jié)，增白淡斑〔17〕。僵蠶疏風(fēng)散熱，駐顏祛斑；黃芪補(bǔ)氣益血，美白潤(rùn)膚〔18〕。將上述藥物打磨配置后應(yīng)用于黃褐斑患者，療效顯著。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，美膚散局部外敷可降低黃褐斑模型小鼠皮膚和肝臟組織中TYR、MDA及LF含量，增強(qiáng)SOD活性，同時(shí)可以明顯減少黃褐斑小鼠皮膚組織中黑色素細(xì)胞數(shù)目。提示美膚散對(duì)黃褐斑模型小鼠具有較好的治療作用，其作用機(jī)制可能與抑制黑色素細(xì)胞的增殖和TYR的活性，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力有關(guān)。