黃芩苷對系膜增生性腎小球腎炎大鼠細胞凋亡及NLRP3/caspase-1通路的影響

張晶晶 李濤 鐘黎

(貴州中醫(yī)藥大學 1第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，貴州 貴陽 550001；2第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科；3第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科)

系膜增生性腎小球腎炎的特征在于腎小球系膜細胞(GMC)增殖和細胞外基質(zhì)(ECM)沉積，系膜增生性腎小球腎炎是終末期腎病的主要原因，但其機制尚未完全闡明〔1,2〕。免疫復(fù)合物清除、免疫調(diào)節(jié)功能障礙可促進系膜增生性腎小球腎炎發(fā)作。系膜增生性腎小球腎炎的綜合措施包括皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑、抗血小板藥和抗血脂藥〔3,4〕，因此，抑制炎癥、GMC增殖和ECM沉積的干預(yù)措施對延緩系膜增生性腎小球腎炎進展具有重要意義。炎性體NOD樣受體蛋白(NLRP)3在調(diào)節(jié)細菌和無菌炎癥中起重要作用，其在炎癥過程中誘導白細胞介素(IL)-1β和IL-18的產(chǎn)生〔5,6〕。NLRP3與銜接分子和凋亡相關(guān)的斑點樣蛋白相互作用，后者具有含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)募集結(jié)構(gòu)域，可用于募集和激活caspase-1。NLRP3主要存在外周血單核細胞、巨噬細胞、常規(guī)脾臟中性粒細胞和樹突狀細胞中〔7〕。NLRP3的不當激活炎癥小體可導致各種疾病的進展。例如，NLRP3炎性體的激活誘導腎臟炎癥，導致慢性腎臟病〔8〕。黃芩苷是一種從黃芩中提取的黃酮類化合物，具有強大的抗炎和抗氧化活性，黃芩苷已被用于治療各種炎性疾病，包括牙周炎、肝炎和潰瘍性結(jié)腸炎〔9〕。本研究擬探討黃芩苷對系膜增生性腎小球腎炎大鼠細胞凋亡及NLRP3/caspase-1通路的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 黃芩苷、異硫氰酸熒光素(FITC)綴合的膜聯(lián)蛋白V細胞凋亡檢測試劑盒(美國sigma公司，批號23454、65474)；貝那普利(北京諾華制藥有限公司，批號20186365)；抗Thy1.1單克隆抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號471585)；RNA plus酶、DNA酶Ⅰ、Omniscript RT試劑盒、實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，批號180513、180427、180528、180620)；含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液(美國Sigma-Aldrich公司，批號DS4789)；二喹啉甲酸(BCA)-200蛋白質(zhì)測定試劑盒(美國Pierce公司，批號10265)；兔抗鼠NLRP3、caspase-1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、辣根過氧化物酶綴合的二抗(美國Abcam公司，批號ab61037、ab20916、ab27155、ab90174)；AU-480全自動生化儀(美國貝克曼庫爾特公司)；FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)；ABI 7500定量PCR儀(美國ABI公司)；ADVIA Centaur CP全自動化學發(fā)光免疫分析儀(德國西門子公司)；CKX53顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.2實驗動物及分組 清潔級SD大鼠100只，由匯智泰康生物技術(shù)(北京)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2018-0012，動物質(zhì)量合格證號：00180617。大鼠隨機分成5組：對照組、模型組、貝那普利組(50 mg/kg，預(yù)試驗求出貝那普利的LC50為100 mg/kg，以1/2 LC50為作用劑量)、黃芩苷低、高劑量組(50、100 mg/kg)〔10〕。

1.3各實驗組的制備 模型組、貝那普利組、黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組通過靜脈內(nèi)注射2.5 mg/kg抗Thy1.1單克隆抗體誘導實驗性抗Thy1.1系膜增生性急性腎小球腎炎大鼠〔11〕。建模成功后各藥物組給予相應(yīng)藥物灌胃，每天給藥1次，連續(xù)4 w，對照組、模型組給予生理鹽水，給藥體積均為10 ml/kg。

1.4腎/體比值、24 h尿蛋白、血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平測定 試驗結(jié)束后，獲取大鼠體重、24 h尿液、腎臟組織，測定24 h尿蛋白、腎/體比值(腎臟質(zhì)量/體重×100%)；同時獲取大鼠血液，分離血清，AU-480全自動生化儀測定Scr、BUN。

1.5大鼠腎組織病理觀察 腎臟組織經(jīng)過脫水、脫蠟、包埋、蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡觀察大鼠腎臟病理改變。

1.6大鼠腎小球細胞凋亡水平檢測 腎組織切片磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗15 min，加入蛋白酶工作液，37℃孵育60 min，加入100 μl FITC綴合的膜聯(lián)蛋白V反應(yīng)液，避光孵育30 min，終止反應(yīng)。將切片置于FACS Calibur流式細胞儀下觀察，細胞核中的棕黃色顆粒顯示為凋亡細胞。

1.7大鼠腎臟NLRP3、caspase-1 mRNA水平檢測 使用RNA plus酶從腎臟組織中提取總RNA，用不含RNase的DNA酶Ⅰ處理。使用Omniscript RT試劑盒將1 μg總RNA用作模板以制備第一鏈互補DNA，使用關(guān)時熒光PCR主混合試劑在ABI 7500定量PCR儀中進行qRT-PCR，共40個循環(huán)。每個PCR循環(huán)的變性、退火、延伸條件是95℃30 s，95℃5 s，60℃34 s和95℃15 s。使用GAPDH作為內(nèi)參基因，將靶基因表達的相對量或倍數(shù)變化標準化。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，qRT-PCR中使用的引物序列：NLRP3正義鏈：5′-GGTAGGCACCGTCAAGGCTGAGAGTGATAC-3′，反義鏈：5′-AAGTCGCCTGTTCCTGTGATGTGCCGTAG AG-3′；caspase-1正義鏈：5′-TTGACCAGGGACAGGATATTTGAGGAGCGGTA-3′，反義鏈：5′-AAGTCGCACCGTCAAGGCTGAGTGCATAAC-3′；GAPDH正義鏈：5′-GAATGCGGATTCGAAACACGTGCATCTGATT A-3′；反義鏈：5′-TGGACTGCACCGTCAAGGCTGATGGACGAAC-3′。

1.8大鼠腎臟NLRP3、caspase-1蛋白水平檢測 裂解緩沖液提取腎臟組織總蛋白質(zhì)，測定蛋白濃度后進行凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，用含有5%脫脂奶粉的Tris緩沖鹽水封閉膜2 h，將膜在4℃下用1∶500稀釋的兔抗鼠NLRP3、caspase-1抗體探測過夜，然后用辣根過氧化物酶綴合的二抗(1∶1 000)孵育2 h，通過使用ADVIA Centaur CP全自動化學發(fā)光免疫分析儀在X射線膠片上顯現(xiàn)蛋白質(zhì)條帶，使用Quantity One分析軟件通過光密度測定法定量相對蛋白質(zhì)表達強度。

1.9統(tǒng)計學分析 采用SPSS23.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組BUN、Scr、24 h尿蛋白、腎/體比值比較 與對照組比較，模型組BUN、Scr、24 h尿蛋白、腎/體比值水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，貝那普利組、黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組水平均顯著降低(P<0.05)；黃岑苷低劑量組上述指標水平均顯著高于貝那普利組(P<0.05)；黃芩苷高劑量組上述指標水平均顯著低于黃芩苷低劑量組(P<0.05)；黃芩苷高劑量組與貝那普利組上述指標水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組BUN、Scr、24 h尿蛋白、腎/體比值水平及凋亡率比較

2.2各組腎組織HE染色比較 對照組腎小球結(jié)構(gòu)正常；模型組基底膜、腎小球系膜細胞明顯增生腫脹，伴炎癥細胞浸潤；貝那普利組及黃芩苷高劑量組腎小球系膜細胞輕度增生，炎癥細胞浸潤減少；黃芩苷低劑量組仍然可見炎癥細胞浸潤，腎小球腫脹增生。見圖1。

圖1 各組腎組織病理學改變(HE，×400)

2.3各組腎小球細胞凋亡率比較 與對照組比較，模型組腎小球細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，貝那普利組、黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組腎小球細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；黃芩苷低劑量組腎小球細胞凋亡率顯著高于貝那普利組(P<0.05)；黃芩苷高劑量組腎小球細胞凋亡率顯著低于黃芩苷低劑量組(P<0.05)；黃芩苷高劑量組與貝那普利組腎小球細胞凋亡率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表1。

2.4各組腎臟NLRP3、caspase-1 mRNA水平比較 與對照組比較，模型組腎臟NLRP3、caspase-1 mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，貝那普利組、黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組上述指標水平均顯著降低(P<0.05)；黃芩苷低劑量組上述指標水平均顯著高于貝那普利組(P<0.05)；黃芩苷高劑量組上述指標水平均顯著低于黃芩苷低劑量組(P<0.05)；黃芩苷高劑量組與貝那普利組上述指標水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組腎臟NLRP3、caspase-1 mRNA及NLRP3、caspase-1蛋白水平比較

2.5各組腎臟NLRP3、caspase-1蛋白水平比較 與對照組比較，模型組腎臟NLRP3、caspase-1蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，貝那普利組、黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組上述指標水平降低(P<0.05)；黃芩苷低劑量組上述指標水平均顯著高于貝那苷利組(P<0.05)；黃芩苷高劑量組上述指標水平均顯著低于黃芩苷低劑量組(P<0.05)，黃芩苷高劑量組與貝那普利組上述指標水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表2、圖2。

1～5:對照組，模型組，貝那普利組，黃芩苷低劑量組，黃芩苷高劑量組圖2 各組腎臟NLRP3、caspase-1蛋白水平比較

3 討 論

黃芩苷已被證明具有抗氧化、抗菌、抗炎和清除自由基的活性。黃芩苷還在體外和體內(nèi)表現(xiàn)出抗流感病毒A(H1N1)活性，其作為細胞中干擾素(IFN)-γ的有效誘導劑，可抑制病毒在vero細胞內(nèi)的復(fù)制。黃芩苷可誘導人肝癌HepG2和SMMC-7721細胞凋亡，并顯著抑制裸鼠中異種移植物的生長〔12〕。在HBE16氣道上皮細胞中，黃芩苷通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號通路激活進而抑制IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子(TNF)-α表達，抑制輔助性T細胞17反應(yīng)并減少二氧化硅誘導的炎癥和纖維化〔13〕。貝那普利可抑制血管緊張素Ⅰ向血管緊張素Ⅱ轉(zhuǎn)化，其能降低周身系統(tǒng)血壓，擴張腎小球出入動脈，降低腎小球內(nèi)的壓力，延緩腎小球損害，是治療系膜增生性腎小球腎炎的首選藥物〔14〕，因此將貝那普利作為陽性對照藥物。本次研究結(jié)果說明黃芩苷對大鼠系膜增生性腎小球腎炎具有保護作用；能明顯抑制系膜增生性腎小球腎炎大鼠細胞炎癥及凋亡。

NLRP3是最佳表征的細胞內(nèi)受體，在免疫和炎癥中起著至關(guān)重要的作用；其激活后，NLRP3經(jīng)歷構(gòu)象變化并與稱為凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)相互作用〔15,16〕，ASC又通過caspase活化和募集結(jié)構(gòu)域?qū)RLP3橋接至天冬氨酸蛋白水解酶-1前體(procaspase-1)，進而激活caspase-1，得到NLRP3、ASC、caspase-1多蛋白復(fù)合物，其作為介導半胱天冬酶1自激活的分子平臺。caspase-1由無活性的半胱天冬酶-1合成，并在多蛋白復(fù)合物(包括ASC和NLRP3，稱為炎性體)內(nèi)通過二聚化和自身蛋白水解活化〔17〕。活化的caspase-1是IL-1β和IL-18釋放，細胞死亡所必需的，并且在炎癥中起關(guān)鍵作用〔18～20〕。本研究結(jié)果說明黃芩苷可抑制系膜增生性腎小球腎炎大鼠腎臟NLRP3、caspase-1 mRNA和蛋白表達進而抑制NLRP3/caspase-1通路的激活。

綜上，黃芩苷能明顯抑制系膜增生性腎小球腎炎大鼠細胞炎癥及凋亡，其機制可能與黃芩苷抑制系膜增生性腎小球腎炎大鼠腎臟NLRP3、caspase-1 mRNA和蛋白表達進而抑制NLRP3/caspase-1通路的激活有關(guān)。