m6A-RNA甲基化在急性髓系白血病中的研究進(jìn)展

全海薇，張亞麗，王 涵，鄒雨彤，程美玉，姜賀然，夏 薇

(北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一種由于造血干/祖細(xì)胞累積各種獲得性遺傳畸變，導(dǎo)致血細(xì)胞發(fā)生生長(zhǎng)/分化改變的惡性克隆性疾病[1]。由于AML發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性、異質(zhì)性，目前仍然不能在分類(lèi)系統(tǒng)上得到完全反映，AML的發(fā)病機(jī)制、分類(lèi)及診斷治療面臨著研究瓶頸[2]。近年“表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)”的建立，為AML的診治提供了新的研究方向?！氨碛^轉(zhuǎn)錄組學(xué)”是在RNA水平上發(fā)現(xiàn)的一種新興基因表達(dá)調(diào)控方式。在RNA的化學(xué)修飾中N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)修飾是真核生物mRNAs和lncRNA最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄后修飾。在此背景下，首次在AML中發(fā)現(xiàn)了m6A沉積并直接參與癌癥發(fā)生。m6A修飾的可逆性和動(dòng)態(tài)性以及其微調(diào)和協(xié)調(diào)基因表達(dá)程序的能力，對(duì)白血病細(xì)胞分化、發(fā)育和AML的臨床診治產(chǎn)生巨大貢獻(xiàn)[3]。本文綜述了m6A-RNA甲基化修飾在AML中的作用，并為小分子藥物靶向治療AML提供新思路。

1 m6A-RNA甲基化概述

RNA形態(tài)功能多樣性是以RNA的四個(gè)典型堿基進(jìn)行大量修飾為基礎(chǔ)。自20世紀(jì)60年代以來(lái)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了150多種RNA的化學(xué)修飾[4]。其中m6A修飾即腺苷殘基的N-6位置添加甲基是真核生物最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄后修飾。m6A修飾由甲基化轉(zhuǎn)移酶(writers)、去甲基轉(zhuǎn)移酶(erasers)、甲基化相關(guān)閱讀蛋白(readers)以及可能影響這些調(diào)節(jié)的其他蛋白動(dòng)態(tài)控制。m6A修飾影響mRNA剪接、核輸出、穩(wěn)定性和翻譯等不同階段，在基因表達(dá)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。

Writers包括甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3(methyltransferase-like 3，METTL3)、甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14(methyltransferase-like 14,METTL14)以及m6A-METTL相關(guān)復(fù)合物(MACOM)。MACOM復(fù)合物由腫瘤相關(guān)蛋白(WTAP)、RNA結(jié)合基序15(RBM15)、Vir樣m6A甲基轉(zhuǎn)移酶(VIRMA，也稱(chēng)KIAA1429)、Cbl原癌基因1(CBLL1)和鋅指蛋白ZC3H13等多種蛋白質(zhì)組成。在體內(nèi)，METTL3-METTL14二聚體活性受MACOM調(diào)節(jié)。MACOM中的RBM15及其類(lèi)似物RBM15B通過(guò)與WTAP結(jié)合，協(xié)助WTAP與METTL3-METTL14二聚體結(jié)合，招募METTL3-METTL14至核小斑對(duì)底物進(jìn)行修飾[5-6]。在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，METTL3和METTL14誘導(dǎo)m6A沉積在內(nèi)含子區(qū)域新生RNA上[7]，完成mRNA剪接。沉默METTL3可減緩mRNA核輸出。

在真核細(xì)胞中，erasers包括脂肪和肥胖相關(guān)蛋白(fat-mass and obesity associated protein，F(xiàn)TO)和Alk B同源物5(Alk B homolog 5，ALKBH5)，二者均屬于AlkBα-戊二酸依賴(lài)的雙加氧酶。敲除人源細(xì)胞中FTO或ALKBH5均導(dǎo)致m6A水平全面上調(diào)。FTO針對(duì)多個(gè)RNA底物，對(duì)不同組織和生物系統(tǒng)有不同的功能。下調(diào)ALKBH5可加速mRNA的核輸出[8]。

Readers包括含YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白家族、胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA結(jié)合蛋白(IGF2BPs)、RNA結(jié)合蛋白以及“間接”readers。含YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白家族包括YTHDF1[9]、YTHDF2[9]、YTHDF3[9]、YTHDC1[10]和YTHDC2[11]，是一組主要的m6A readers，在mRNA穩(wěn)定性[12]、mRNA剪接[13]、mRNA結(jié)構(gòu)[14]、mRNA輸出[15]、翻譯效率[16]和miRNA生物發(fā)生[17]等方面發(fā)揮重要作用。IGF2BPs包括IGF2BP1/2/3，是一類(lèi)獨(dú)特的m6A readers，通過(guò)識(shí)別GG(m6A)C序列(典型的m6A序列)與目標(biāo)mRNA靶向結(jié)合，提高mRNA的穩(wěn)定性[18]。此外，“間接”readers HNRNPC、HNRNPG可作為優(yōu)先結(jié)合m6A修飾的RNA結(jié)構(gòu)“開(kāi)關(guān)”。

2 m6A-RNA甲基化在AML中的作用

2.1 METTL3-METTL14復(fù)合物在AML中的作用

RNA甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3是復(fù)合物中唯一的催化亞基，METTL14在體內(nèi)與METTL3連接形成穩(wěn)定的二聚體，在維持復(fù)合物完整性、定位靶向mRNA方面起非催化作用[19]。AML是METTL3和METTL14表達(dá)水平最高的癌癥之一，與正常造血祖細(xì)胞相比，AML細(xì)胞中METTL3和METTL14均過(guò)度表達(dá)[20-21]。METTL3-METTL14甲基化復(fù)合物能促進(jìn)AML的發(fā)展并維持原始白血病細(xì)胞[20-21]。在AML細(xì)胞系和原代母細(xì)胞中過(guò)表達(dá)METTL3和METTL14均可促進(jìn)增殖，下調(diào)則誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡[20-21]。對(duì)AML移植小鼠模型進(jìn)行全基因組CRISPR/CAS9篩查，結(jié)果表明METTL3、METTL14和METTL16是影響AML生存的關(guān)鍵基因[21]。

在AML細(xì)胞中，METTL3和METTL14主要結(jié)合到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，早期的m6A共轉(zhuǎn)錄沉積促進(jìn)與AML增殖相關(guān)的mRNA的翻譯，如c-MYC、BCL2、PTEN、SP1和MYB[20-21]。METTL14通過(guò)SPI1-METTL14-MYB/MYC信號(hào)軸調(diào)節(jié)骨髓生成和白血病發(fā)生[20]，髓系轉(zhuǎn)錄調(diào)控子SPI1負(fù)調(diào)控METTL14，使其誘導(dǎo)m6A修飾致癌基因MYB和MYC，從而抑制AML細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞自我更新。轉(zhuǎn)錄因子CEBPZ(CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白)是AML中的一個(gè)新的突變基因[22]，可在基因啟動(dòng)子上招募METTL3[21]，提示AML中METTL3的共轉(zhuǎn)錄招募下降。研究表明在AML中，METTL3異位于細(xì)胞質(zhì)，與負(fù)責(zé)翻譯的核糖體互相作用[23]。胞質(zhì)中的METTL3可以促進(jìn)特定mRNA(如癌基因EGFR和TAZ)的翻譯，而不依賴(lài)于METTL3自身的催化活性[23-24]。此外，較高水平的胞質(zhì)METTL3導(dǎo)致WTAP蛋白水平隨之增加[23]，維持WTAP蛋白在AML中的致癌作用。

2.2 WTAP在AML中的作用

Wilms腫瘤1(WT1)基因在白血病的發(fā)生中具有致癌作用，其過(guò)度表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)[25]。WTAP與WT1配對(duì)，調(diào)節(jié)靜止和增殖之間的平衡。研究發(fā)現(xiàn)WTAP蛋白在AML中上調(diào)。下調(diào)AML細(xì)胞系中WTAP，可抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，延緩白血病病程[26]。另外，WTAP在RNA代謝的表觀轉(zhuǎn)錄調(diào)控中可作為m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體中的一個(gè)調(diào)節(jié)亞單位來(lái)發(fā)揮作用[27]。

2.3 RBM15在AML中的作用

部分急性巨核細(xì)胞白血病(AMKL)患者常產(chǎn)生染色體異位，攜帶融合癌基因RBM15-MKL1[28]。RBM15可直接結(jié)合并控制巨核生成基因GATA1、RUNX1、TAL1和c-MPL的pre-mRNA選擇性剪接[29]。蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(PRMT1)在AMKL細(xì)胞系中的過(guò)表達(dá)可下調(diào)RBM15蛋白水平，影響RNA的剪切，從而阻遏巨核細(xì)胞的終末分化[29]。敲除RBM15可導(dǎo)致B細(xì)胞分化、髓系和巨核細(xì)胞擴(kuò)張受阻[30]。靶向PRMT1可能是恢復(fù)AMKL巨核細(xì)胞分化的一種根治療法。

2.4 FTO在AML中的作用

已有報(bào)道，在攜帶MLL-AF9、PML-RARA和FTL3-ITD易位的AML亞型中FTO表達(dá)升高[31]。R-2-羥基戊二酸(R-2HG)在體內(nèi)、外通過(guò)抑制白血病細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯和凋亡而發(fā)揮廣泛的抗白血病活性。R-2HG可通過(guò)抑制FTO高表達(dá)，靶向FTO-m6A-MYC/CEBPA信號(hào)軸，下調(diào)MYC和CEBPA表達(dá)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[32]。在癌細(xì)胞系中進(jìn)行的大規(guī)模基因敲除篩查顯示，白血病細(xì)胞不存在普遍的FTO依賴(lài)[33]，F(xiàn)TO在m6A修飾中的去甲基化作用還存在爭(zhēng)議。

3 m6A-RNA甲基化作為抗癌藥物靶點(diǎn)的研究

參與m6A-RNA甲基化的writers、erasers和readers這三類(lèi)物質(zhì)，目前已成為小分子靶向治療AML的潛在靶點(diǎn)。主要針對(duì)METTL3-METTL14復(fù)合物探索開(kāi)發(fā)新的治療策略和小分子藥物。研究人員獲得了METTL3-METTL14復(fù)合物的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，這兩種蛋白都屬于Ⅰ類(lèi)甲基轉(zhuǎn)移酶家族[34]，其中METTL3的結(jié)合口袋是由Ⅰ類(lèi)甲基轉(zhuǎn)移酶家族通用的折疊酶產(chǎn)生的。由此，為設(shè)計(jì)藥物的結(jié)構(gòu)提供導(dǎo)向：可根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)利用計(jì)算機(jī)工具CADD來(lái)設(shè)計(jì)新的抑制劑[35]；也可考慮采用已發(fā)現(xiàn)的針對(duì)Ⅰ類(lèi)甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員的有效抑制劑，例如蛋白賴(lài)氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、PRMTs和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)來(lái)治療AML。

METTL3-METTL14復(fù)合物催化甲基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，是通過(guò)復(fù)合物的催化部位與腺苷蛋氨酸(SAM)或S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)結(jié)合[35](如METTL3與SAM結(jié)合[34])完成的。甲基供體SAM輔因子和甲基受體腺苷底物結(jié)合在METTL3[36]的不同位點(diǎn)。已報(bào)道的METTL3-METT14抑制劑只有反應(yīng)產(chǎn)物SAH和核苷酸類(lèi)似物西那霉素[37]。因此，在構(gòu)思潛在METTL3-METTL14抑制劑時(shí)，可以考慮以核苷酸、SAM或者雙底物配體為靶點(diǎn)。針對(duì)核苷酸靶點(diǎn)的藥物，如氮胞苷和地西他濱，可作用于DNMT，已批準(zhǔn)用于AML臨床治療之中[38]，但這些藥物的生物利用度差且毒性強(qiáng)。相比之下，與SAM結(jié)合的小分子抑制劑有良好的藥理特性和口服生物利用度。目前針對(duì)混合型白血病1H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶的MM-401抑制劑[39]、針對(duì)套細(xì)胞淋巴瘤蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶-5的EPZ015666口服抑制劑[40]、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L抑制劑[41]等治療藥物已進(jìn)入臨床研究。雙底物抑制劑與SAM和核苷酸抑制劑相比，基于結(jié)構(gòu)層面而言，具有更強(qiáng)的選擇性。科學(xué)家設(shè)計(jì)了DNMT3A和DNMT1雙底物抑制劑喹唑啉-喹啉衍生物，其可誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞CDKN2A啟動(dòng)子去甲基化并于治療7 d后重新激活[42]。這種思路同樣適用于AML的治療中。

隨著人們對(duì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的逐步深入，發(fā)現(xiàn)RNA轉(zhuǎn)錄水平的改變與多種癌癥密切相關(guān)，并在轉(zhuǎn)移和耐藥中發(fā)揮重要作用[43]。已發(fā)現(xiàn)AML中m6A修飾的改變可以破壞正常的細(xì)胞分化并促進(jìn)癌癥的發(fā)展?？梢灶A(yù)見(jiàn)，m6A修飾酶的活性易被化合物靶向，并最終可能在未來(lái)的癌癥治療中提供重大創(chuàng)新。