姜黃素提高人前列腺癌細(xì)胞系PC-3放療敏感性

程 繼，付 國(guó)，趙華才，王志剛，高 丹，董青川

(陜西省人民醫(yī)院 泌尿外科,陜西 西安 710068)

前列腺癌(prostate cancer)是常見的惡性腫瘤，放射治療是常規(guī)手段，但輻射抵抗是目前面臨的臨床難題，降低患者臨床治療效果，嚴(yán)重影響患者康復(fù)和生活質(zhì)量[1-2]。多酚類物質(zhì)姜黃素(curcumin)是姜黃中最重要的有效活性成份，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等的藥理作用[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)[5-6]，姜黃素可調(diào)控p53、Nrf2等信號(hào)通路，抑制結(jié)胰腺癌、乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤的病理進(jìn)程。姜黃素可降低IκB 激酶磷酸化水平，抑制NF-κB活性，減少IL-6和IL-11等細(xì)胞因子分泌，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖等[7]。但是否姜黃素可作為一種放射增敏劑，提高前列腺癌放射治療的敏感性，其具體分子機(jī)制和信號(hào)通路如何？目前仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)依據(jù)來證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)中，前列腺癌細(xì)胞PC-3給予體外放射治療處理，同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用姜黃素，觀察前列腺癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的變化，明確姜黃素是否具有放射增敏效應(yīng)，同時(shí)分析和闡明其具體作用的分子機(jī)制，為前列腺癌臨床放射治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

人前列腺癌細(xì)胞系PC-3(ATCC公司)；姜黃素(curcumin，Sigma-Aldrich公司)；caspase活性檢測(cè)試劑盒(江蘇碧云天公司)；MTT試劑盒(Abcam公司)；血清、Annexin V、PI(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組和處理：將細(xì)胞分為對(duì)照組、放射組(4 Gy，1次/2 d，共2次，劑量率2.4 Gy/min)，姜黃素組(10 μmol/L，3 d)，放射+姜黃素組(4 Gy + 10 μmol/L)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，5×103個(gè)/孔，收集細(xì)胞，通過MTT法觀察上述處理方式對(duì)PC-3細(xì)胞增殖的影響。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)mRNA：分別給予4 Gy劑量的放射處理和10 μmol/L的姜黃素。收集上述細(xì)胞，提取RNA，通過定量PCR觀察PCNA mRNA表達(dá)變化，分析各組間差異。

1.2.4 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期：收集細(xì)胞，70%的乙醇固定和碘化丙啶染色，通過流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞周期的變化。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：收集各組細(xì)胞，與Annexin V/PI溶液室溫孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同處理組細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 Caspase活性的檢測(cè)：按caspase活性檢測(cè)試劑盒操作規(guī)范要求，處理細(xì)胞，離心20 min，2 000 r/min，上清孵育60 min，測(cè)定各組樣品吸光度值的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 姜黃素聯(lián)合放射治療對(duì)細(xì)胞增殖的影響

放射治療和姜黃素處理組細(xì)胞，其細(xì)胞存活率均低于對(duì)照組(P<0.05)；而姜黃素聯(lián)合放射治療組，其細(xì)胞存活率低于放射組(P<0.05)(表1)。放射治療和姜黃素組處理組細(xì)胞，其細(xì)胞中PCNA mRNA水平低于對(duì)照組(P<0.05)；而姜黃素聯(lián)合放射治療組，其細(xì)胞中PCNA mRNA水平低于放射組細(xì)胞(P<0.05)(圖1)。

表1 姜黃素聯(lián)合放射治療對(duì)細(xì)胞增殖率的影響Table 1 Effect of curcumin combined with irradiation on cell proliferation n=6)

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with irradiation group圖1 姜黃素聯(lián)合放射治療對(duì)PCNA mRNA水平的影響Fig 1 Effect of curcumin combined with irradiation on PCNA mRNA

2.2 姜黃素聯(lián)合放射治療對(duì)細(xì)胞周期的影響

放射治療和姜黃素處理組細(xì)胞，其S期和G2/M期細(xì)胞比例均高于對(duì)照組(P<0.05)；而姜黃素聯(lián)合放射治療組，其S期和G2/M期細(xì)胞比例高于單獨(dú)放射治療組(P<0.05)(表2，圖2)。Cdc2分子mRNA水平直接反應(yīng)腫瘤細(xì)胞G2/M期水平，放射治療和姜黃素處理組細(xì)胞，其細(xì)胞中Cdc2 mRNA水平均低于對(duì)照組PC-3細(xì)胞(P<0.05)；而姜黃素聯(lián)合放射治療組，其細(xì)胞中Cdc2 mRNA水平低于放射組細(xì)胞(P<0.05)(圖3)。

圖2 姜黃素聯(lián)合放射治療對(duì)細(xì)胞周期的影響Fig 2 Effect of curcumin combined with irradiation on cell cycle

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with irradiation group圖3 姜黃素聯(lián)合放射治療對(duì)Cdc2 mRNA水平的影響Fig 3 Effect of curcumin combined with irradiation on Cdc2 mRNA

表2 姜黃素聯(lián)合放射治療對(duì)細(xì)胞周期的影響Table 2 Effect of curcumin combined with irradiation on cell cycle n=6)

2.3 姜黃素聯(lián)合放射治療對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

放射治療和姜黃素處理組細(xì)胞，其細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組(P<0.05)；姜黃素聯(lián)合放射治療組，其細(xì)胞凋亡率高于單獨(dú)放射治療組(P<0.05)(表3，圖4)。放射治療和姜黃素處理組細(xì)胞，其細(xì)胞中caspase-9和caspase-3活性高于對(duì)照組(P<0.05)；姜黃素聯(lián)合放射治療組，其細(xì)胞中caspase-9和caspase-3活性高于單獨(dú)放射治療組(P<0.05)(圖5)。

圖4 姜黃素聯(lián)合放射治療對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響Fig 4 Effect of curcumin combined with irradiation on cell apoptosis

表3 姜黃素聯(lián)合放射治療對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響Table 3 Effect of curcumin combined with irradiation on cell apoptosis

3 討論

腫瘤是目前發(fā)達(dá)國(guó)家位居第一位的死亡因素，但腫瘤耐藥性和放射抵抗性等因素，嚴(yán)重影響腫瘤治療的臨床效果[8]。前列腺癌是常見惡性腫瘤，研究其分子機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和手段，提高臨床療效，減輕常規(guī)化療藥物和放射治療引起的副作用，對(duì)于改善患者生存質(zhì)量，具有重要的臨床意義。

姜黃素作為一種傳統(tǒng)植物藥物，因其抗氧化和抗炎效應(yīng)，已被認(rèn)定為天然健康保健品[9]。在炎性反應(yīng)、風(fēng)濕、代謝紊亂、肝臟疾病、肥胖、神經(jīng)退行性疾病和惡性腫瘤等疾病中，姜黃素的藥理效應(yīng)具有廣泛的應(yīng)用[10]。姜黃素可顯著降低IκB 激酶磷酸化水平，抑制NF-κB活性，阻止NF-κB亞單位p65核轉(zhuǎn)錄作用，抑制腫瘤細(xì)胞增殖[11]。

PCNA 分子mRNA水平可反應(yīng)腫瘤細(xì)胞增殖的狀態(tài)[12]，研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)姜黃素聯(lián)合放射治療處理的前列腺癌細(xì)胞，其存活率低于放射組細(xì)胞，同時(shí)其細(xì)胞中PCNA mRNA水平低于放射組細(xì)胞，表明姜黃素可通過抑制前列腺癌細(xì)胞中PCNA 分子水平，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性。細(xì)胞周期變化和放射敏感性有關(guān)，Cdc2分子mRNA水平可直接反映腫瘤細(xì)胞周期變化[13]，姜黃素聯(lián)合放射治療處理后，可增加S期和G2/M期細(xì)胞比例，降低Cdc2 mRNA水平，提示姜黃素可通過調(diào)控細(xì)胞周期，引起G2/M期阻滯效應(yīng)，增加腫瘤細(xì)胞放射敏感性，發(fā)揮放射增敏效應(yīng)。Caspase-3和caspase-9是調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵分子，在腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[14]。Caspase-3和caspase-9分別通過啟動(dòng)死亡受體途徑和線粒體途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。FasL、TRAIL等信號(hào)分子可激活caspase-3途徑，而細(xì)胞線粒體跨膜電位變化和細(xì)胞色素C是caspase-9途徑的活化因素[15]。研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)姜黃素聯(lián)合放射治療處理后，可增加前列腺癌細(xì)胞中caspase-9和caspase-3活性，同時(shí)提高PC-3細(xì)胞凋亡率，表明姜黃素可通過調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)的因素，提高腫瘤細(xì)胞放射敏感性。

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with irradiation group圖5 姜黃素聯(lián)合放射治療對(duì)caspase活性的影響Fig 5 Effect of curcumin combined with irradiation

本研究結(jié)果表明，姜黃素具有明顯的放射增敏效應(yīng)，可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、調(diào)控caspase活性、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞周期，增加腫瘤細(xì)胞的放射治療效果。姜黃素的這一放射增敏效應(yīng)，可作為潛在的放射增敏劑，提高臨床放射治療效果，將為前列腺癌放射治療提供新策略。