雷公藤內(nèi)酯醇通過抑制HIF-1α通路逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥的研究

朱四紅 譚布珍 胡 輝 陳庚發(fā)

卵巢癌是全球女性癌癥死亡原因的第5位[1]，其預(yù)后與基礎(chǔ)病變、轉(zhuǎn)移途徑和化療的耐藥性密切相關(guān)。目前卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)治療是腫瘤減滅術(shù)和以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療方案，但卵巢癌耐藥問題日趨嚴(yán)重，患者多因耐藥而導(dǎo)致治療失敗和腫瘤復(fù)發(fā)[2-3]。雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide，TP)是從雷公藤中分離到的二萜內(nèi)酯化合物，具有多效抗癌活性。已有大量實驗研究證實，雷公藤內(nèi)酯醇對各種癌癥細(xì)胞及動物模型具有一定的抗癌作用[4-6]，其機制主要與抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)多種腫瘤的凋亡有關(guān)。

本課題組前期通過一系列體內(nèi)外實驗觀察了雷公藤內(nèi)酯醇對卵巢癌細(xì)胞具有明顯的殺傷和促凋亡作用，其機制可能與上調(diào)Caspase-3和Caspase-7的表達、下調(diào)PIK3、p-Akt、p-GSK3β、MMP2、Sorcin、VEGF的表達，阻滯細(xì)胞周期、抑制PIK3/AKT/GSK3β信號通路和NF-kB轉(zhuǎn)錄等有關(guān)。本課題擬進一步探索雷公藤內(nèi)酯醇是否通過抑制HIF-1α信號通路，進而導(dǎo)致MMP2、Sorcin、VEGF表達下降，促進細(xì)胞凋亡，并逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞耐藥。

1 材料與方法

1.1 材料

雷公藤內(nèi)酯醇購自Solarbio公司；SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；一抗鼠源GAPDH抗體購自proteintech公司；一抗兔抗Scorin、MMP2和VEGF蛋白單克隆抗體購自Abcam公司；二抗山羊抗兔和山羊抗鼠、普通敏化學(xué)發(fā)光試劑盒購自北京全式金公司；TUNEL檢測試劑盒、RIPA裂解液(強)購自碧云天公司；Western及IP裂解液購自北京普利萊公司；胰蛋白酶、Tween20購自美國Sigma公司；胎牛血清(FBS)購自HyClone公司；超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒、蛋白Marker、Western膜再生液購自美國賽默飛公司。

1.2 方法

1.2.1 Western blot實驗檢測雷公藤內(nèi)酯醇對HIF-1α蛋白的影響 實驗分為2組：SKOV3/DDP細(xì)胞組和SKOV3/DDP細(xì)胞+TP組。在2組樣本加入相應(yīng)的裂解液中，4 ℃裂解30 min，在10 000 rpm/min離心10 min，小心吸取上清液，即得總蛋白。利用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定。蛋白變性、上樣、電泳1～2 h，濕法轉(zhuǎn)膜30～50 min。4 ℃孵育一抗溶液過夜；室溫孵育二抗1～2 h。在膜上滴加ECL曝光液，曝光。用“Quantity one”軟件分析各抗體條帶灰度值。

1.2.2 SKOV3/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染HIF-1α干擾質(zhì)粒 實驗分為2組：SKOV3/DDP細(xì)胞組(NC)和轉(zhuǎn)染HIF-1α干擾質(zhì)粒后的SKOV3/DDP細(xì)胞組(shHIF-1α)。將對數(shù)生長期的SKOV3/DDP細(xì)胞，接種于6孔板；孵育48 h；將脂質(zhì)體、質(zhì)粒置于室溫，用前混勻；用Opti-MEM將4 μg質(zhì)粒DNA稀釋成250 μl，輕輕混勻；用250 μl Opti-MEM將脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 10 μl稀釋，孵育5 min；將稀釋的質(zhì)粒DNA和稀釋的脂質(zhì)體混合，孵育25 min；每孔加入質(zhì)粒DNA脂質(zhì)體復(fù)合物500 μl，孵育至相應(yīng)時間，進行相應(yīng)的檢測，每一項實驗均重復(fù)3次；6 h后，更換完全培養(yǎng)基，中止轉(zhuǎn)染。48 h后，在熒光顯微鏡下觀察SKOV3/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況。

1.2.3 Western blot檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染后HIF-1α、MMP2、Sorcin、VEGF的表達 實驗分組同1.2.2。實驗方法同1.2.1。

1.2.4 TUNEL觀察細(xì)胞凋亡情況 實驗分組同1.2.2。制片后將組織切片入放入65 °C烤箱中烤2 h；切片在二甲苯放置10 min，更換二甲苯再放置10 min；將切片依次放入100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇和純化水中各5 min。將切片移入濕盒中，每個樣本上滴加 50 μg/ml Proteinase K工作液，37℃反應(yīng) 30 min。PBS充分洗滌3次，每次5 min。用吸水紙吸掉組織周圍的PBS，每張玻片滴加足夠量的TUNEL檢測液，45 °C避光孵育2 h，PBS洗滌3次，每次5 min；用吸水紙吸干玻片上的液體，用抗熒光淬滅封片后，熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用 SPSS 25.0軟件分析，計量資料采用t檢驗。若P<0.05，則認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測雷公藤內(nèi)酯醇對HIF-1α蛋白的影響

Western bolt檢測2組細(xì)胞中HIF-1α的表達情況，結(jié)果示：SKOV3/DDP組中HIF-1α蛋白灰度值為1.057±0.008，SKOV3/DDP+TP組中HIF-1α蛋白灰度值為0.357±0.031。由此可見，與SKOV3/DDP組細(xì)胞相比，SKOV3/DDP+TP組的HIF-1α表達明顯降低(t=37.96，P<0.05)，見圖1。

圖1 Western blot檢測各組HIF-1α的表達情況

2.2 熒光顯微鏡觀察SKOV3/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染HIF-1α干擾質(zhì)粒

SKOV3/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染HIF-1α干擾質(zhì)粒48 h后，在熒光倒置顯微鏡下用藍光激發(fā)，激發(fā)波長為480 nm，發(fā)射波長為520 nm，可見細(xì)胞中出現(xiàn)綠色熒光，表明SKOV3/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功，并且能夠正常表達其功能(如圖2箭頭所示所示)。

圖2 熒光顯微鏡下觀察SKOV3/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的熒光反應(yīng)

2.3 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后HIF-1α的表達情況

在SKOV3/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染HIF-1α干擾質(zhì)粒后，Western blot檢測2組HIF-1α的表達情況，結(jié)果示：SKOV3/DDP(NC)組中HIF-1α蛋白灰度值為1.063±0.161；轉(zhuǎn)染HIF-1α干擾質(zhì)粒后的SKOV3/DDP細(xì)胞(shHIF-1α)組中HIF-1α蛋白灰度值為0.223±0.106。由此可見，轉(zhuǎn)染HIF-1α干擾質(zhì)粒后的SKOV3/DDP細(xì)胞的HIF-1α蛋白表達水平顯著下降，與對空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.53，P<0.05)，見圖3。

圖3 SKOV3/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染后HIF-1α的表達情況

2.4 Western blot檢測MMP2、Sorcin、VEGF的表達情況

在SKOV3/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染HIF-1α干擾質(zhì)粒后，SKOV3/DDP細(xì)胞的HIF-1α蛋白表達水平顯著下降。Western blot檢測2組MMP2、Sorcin、VEGF的表達情況，結(jié)果示：①NC組：MMP-2蛋白灰度值為1.032±0.153，Sorcin蛋白灰度值為1.049±0.053，VEGF蛋白灰度值為1.084±0.122。②shHIF-1α組：MMP-2蛋白灰度值為0.246±0.029，Sorcin蛋白灰度值為0.324±0.015，VEGF蛋白灰度值為0.285±0.014。由此可見，在卵巢癌SKOV3/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，HIF-1α的表達降低后，MMP2、Sorcin、VEGF的表達均有所下降，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(如圖4及表1所示)。

圖4 2組MMP2、Sorcin、VEGF的表達情況

表1 2組間MMP-2、Sorcin、VEGF 蛋白灰度值的比較

2.5 TUNEL觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡情況

TUNEL觀察轉(zhuǎn)染HIF-1α干擾質(zhì)粒后SKOV3/DDP細(xì)胞凋亡情況結(jié)果示：SKOV3/DDP組：每個視野細(xì)胞凋亡數(shù)目為7.33±2.08；SKOV3/DDP+TP組：每個細(xì)胞凋亡數(shù)目為31.33±3.06。由此可見，在卵巢癌SKOV3/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染HIF-1α干擾質(zhì)粒后，降低HIF-1α的表達后，凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增加，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.23，P<0.05)，如圖5。

圖5 TUNEL檢測轉(zhuǎn)染HIF-1α干擾質(zhì)粒后細(xì)胞凋亡情況

3 討論

腫瘤微環(huán)境的特點為組織缺氧、酸中毒、間質(zhì)高壓、大量生長因子和蛋白水解酶產(chǎn)生及免疫炎性反應(yīng)等，其中最典型的就是缺氧和酸中毒[7-8]。腫瘤細(xì)胞需要上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)，激活細(xì)胞增殖，促進血管新生和下調(diào)細(xì)胞凋亡水平，使其在缺氧條件下能繼續(xù)存活并增殖[9-11]。

HIF1-α是介導(dǎo)細(xì)胞低氧反應(yīng)的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)控，對卵巢癌多藥耐藥的形成起到多方面作用[12-13]。HIF-1α在多種惡性腫瘤中過表達，如卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等，作為腫瘤組織低氧性適應(yīng)中的關(guān)鍵因子，其已成為惡性腫瘤治療研究的重要靶點之一[14-15]。多項實驗研究證實低氧環(huán)境所誘導(dǎo)的HIF-1與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，其機制可能與促進MMP2、Sorcin、VEGF表達增高有關(guān)[16-18]。監(jiān)測腫瘤組織中HIF1-a和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達率，能輔助早期診斷卵巢癌并預(yù)測其侵襲性[19]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)是一類參與多種組織細(xì)胞外基質(zhì)降解的蛋白酶家族，其中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2在腫瘤的血管化、腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的形成中均起著重要作用?？扇苄阅退幭嚓P(guān)鈣結(jié)合蛋白基因(Soluble resistance-associated calcium-blinding protein，Sorcin)是一種可溶性耐藥相關(guān)鈣結(jié)合蛋白，與癌細(xì)胞的多藥耐藥有關(guān)。HIF-1還可介導(dǎo)內(nèi)皮素-1、P-gp上調(diào)而促進卵巢癌細(xì)胞播散和侵襲[20-22]。研究[23-25]發(fā)現(xiàn)沉默或下調(diào)人卵巢癌細(xì)胞的HIF-1α表達后，能抑制卵巢癌多藥耐藥，并可增加其對順鉑的敏感性。

本實驗中，SKOV3/DDP+TP組的HIF-1α表達明顯降低，SKOV3/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染HIF-1α干擾質(zhì)粒，降低了HIF-1α的表達，且MMP2、Sorcin、VEGF的表達均有所下降，且細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增加。由此推測，雷公藤內(nèi)酯醇可降低HIF-1α的表達，并通過抑制HIF-1α信號通路，進而導(dǎo)致MMP2、Sorcin、VEGF蛋白的表達下降，促進細(xì)胞凋亡，從而逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞的耐藥性，增加其對順鉑的敏感性。本研究將為雷公藤內(nèi)酯醇成為新的化療藥物，或作為化療增敏劑與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用治療難治性或耐藥性卵巢癌提供重要的實驗依據(jù)。