苦碟子注射液預處理對急性缺血性腦卒中后腦缺血再灌注損傷血瘀毒損證模型大鼠神經(jīng)功能及海馬神經(jīng)元的影響研究

馬瑞雪，張綦慧

急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）是一種由于各種原因突然引起腦內(nèi)血液供應障礙，最終導致腦組織出現(xiàn)缺血缺氧壞死并迅速影響神經(jīng)功能的腦血管疾?。?］。《中國腦卒中防治報告2019》指出，近年我國急性腦卒中的發(fā)生率呈暴發(fā)式上升，是造成我國成年人殘疾、死亡的首要疾?。?］。AIS患者常屬于血瘀毒損證，而苦碟子注射液是治療該證的代表藥物之一，其具有活血止痛、清熱化瘀的功效［3］?；颊甙l(fā)生AIS后無論是否及時實現(xiàn)血管再通，其腦功能均會受到一定損傷，即腦缺血再灌注損傷，而苦碟子注射液可以對腦缺血再灌注損傷起到一定保護作用［4-5］，具有極高的臨床意義。本研究通過構(gòu)建AIS后腦缺血再灌注損傷血瘀毒損證模型大鼠，觀察苦碟子注射液預處理對其神經(jīng)功能及海馬神經(jīng)元的影響，以期揭示苦碟子注射液預處理治療AIS后腦缺血再灌注損傷血瘀毒損證的最佳起效時間。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2020年10月至2021年2月。

1.2 實驗動物 64只SPF級成年雄性Wistar大鼠〔實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006〕由北京維通利華公司提供，體質(zhì)量230～250 g，適應性飼養(yǎng)3 d，飼養(yǎng)條件嚴格按照北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院SPF級實驗動物中心標準執(zhí)行，飼養(yǎng)溫度21～25 ℃，濕度40%～70%，自由攝食飲水。本研究已獲得北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院動物倫理委員會批準（202016）。實驗過程中對實驗動物的處理符合實驗動物3R原則。

1.3 主要藥物及試劑 苦碟子注射液（購自通化華夏藥業(yè)有限公司，國藥準字Z20025450，規(guī)格：10 ml×10支），多聚甲醛溶液（購自北京索萊寶科技有限公司，P1110-500），戊二醛溶液（購自北京索萊寶科技有限公司，P1126-100），角叉菜膠（購自上海源葉生物科技有限公司，S30559-100），大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）線栓（購自北京西濃科技有限公司，2634A4，規(guī)格：0.34 mm）。

1.4 主要儀器 4 ℃低溫冰箱（購自青島海爾冰箱股份有限公司，HXC-106），超薄切片機（購自德國LEICA公司，UC7），光學顯微鏡（購自德國LEICA公司，DP72-SET），透射電鏡（購自日本Hitachi公司，H-7650）。

1.5 實驗方法

1.5.1 實驗分組及干預措施 采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組和治療組，每組18只，余10只備用。治療組構(gòu)建AIS后腦缺血再灌注損傷血瘀毒損證模型，術(shù)前7 d開始腹腔注射苦碟子注射液8.4 g?kg-1?d-1至手術(shù)當天，術(shù)前腹腔注射角叉菜膠3 d至術(shù)前24 h，1次/d。模型組構(gòu)建AIS后腦缺血再灌注損傷血瘀毒損證模型，術(shù)前7 d開始腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液至手術(shù)當天，術(shù)前腹腔注射角叉菜膠3 d至術(shù)前24 h，1次/d。假手術(shù)組不構(gòu)建AIS后腦缺血再灌注損傷血瘀毒損證模型，只給予術(shù)前麻醉，分離頸部血管，不結(jié)扎和插入MCAO線栓。

1.5.2 AIS后腦缺血再灌注損傷血瘀毒損證模型構(gòu)建方法 通過腹腔注射角叉菜膠制備血瘀毒損證模型［6］：采用0.9%氯化鈉溶液將角叉菜膠配成4%的濃度，治療組、模型組大鼠以20 mg/kg腹腔注射，1次/d，連續(xù)3 d。以爪甲腫脹紅紫、出現(xiàn)黑尾現(xiàn)象、體溫呈增高趨勢為血瘀毒損證模型構(gòu)建成功。末次注射角叉菜膠后正常飼養(yǎng)24 h，參照Longa改良法［7］構(gòu)建MCAO模型，即AIS后腦缺血再灌注損傷模型：術(shù)前12 h禁食不禁水。采用10%水合氯醛溶液以400 mg/kg腹腔注射來麻醉大鼠，大鼠仰臥位固定、消毒、備皮，沿頸部正中線切開皮膚，逐層鈍性分離頸部肌肉組織，充分暴露并分離左側(cè)頸總動脈（common carotid artery，CCA）、頸外動脈（external carotid artery，ECA）和頸內(nèi)動脈（internal carotid artery，ICA），置線備用。用動脈夾夾閉CCA、ICA，結(jié)扎ECA近心端及遠心端，中間剪斷。將ECA游離端拉至與ICA成一條直線，由ECA插入MCAO線栓，打開ICA處動脈夾，將MCAO線栓插入ICA并繼續(xù)插入顱內(nèi)至微感阻力，插入深度為（18.5±0.5）mm，使MCAO線栓頭端通過大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA）起始處，以阻塞左側(cè)MCA的血液供應，結(jié)扎ICA以固定MCAO線栓和防止出血，打開CCA處動脈夾，逐層縫合，留1 cm MCAO線栓殘端于皮外。術(shù)后1 h拔出MCAO栓線以再灌注。采用Zea Longa評分評估大鼠神經(jīng)功能缺損情況，1～4分為造模成功，由于神經(jīng)功能缺損評分為4分的大鼠腦缺血再灌注損傷較重，故選擇神經(jīng)功能缺損評分為1～3分的大鼠進行后續(xù)取材。將實驗過程中未達到取材時間而死亡的大鼠剔除（共8只），并進行補充造模，其中模型組補充造模5只，治療組補充造模3只。

1.6 觀察指標

1.6.1 癥狀、體征 觀察各組大鼠整個實驗過程中的癥狀、體征，包括皮毛顏色、爪甲顏色、精神狀態(tài)、行為能力。

1.6.2 Zea Longa評分 分別于造模后1、3、6、24、72 h及7 d選取各組大鼠4只，評估其Zea Longa評分以觀察其神經(jīng)功能缺損情況。0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：存在輕度神經(jīng)功能缺損，對側(cè)前肢不能完全伸展；2分：存在中度神經(jīng)功能缺損，行走時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：存在嚴重神經(jīng)功能不全，走路時向?qū)?cè)傾倒；4分：意識喪失，無法自發(fā)行走。Zea Longa評分越高表示大鼠神經(jīng)功能缺損越嚴重。

1.6.3 海馬神經(jīng)元形態(tài)及超微結(jié)構(gòu) 分別于造模后1、3、6、24、72 h及7 d選取各組大鼠3只，采用10%水合氯醛以400 mg/kg腹腔注射來麻醉大鼠，剪開胸腹腔，暴露心臟，用9#針頭穿刺左心室至主動脈，用止血鉗夾閉固定針頭，剪開右心耳，用37 ℃、0.9%氯化鈉溶液200 ml+12 500 U肝素鈉快速灌洗全身血液至右心耳流出無色透明液體，再用4%多聚甲醛溶液緩慢灌洗及固定腦組織和身體，待大鼠僵硬后，迅速斷頭取腦。取出大腦后在冰上分離出患側(cè)海馬區(qū)，將其切成1 mm3，置于2.5%戊二醛溶液中2 h，置于磷酸鹽緩沖液中10 min，每隔10 min更換磷酸鹽緩沖液1次，連續(xù)更換2次后置于4 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。取出樣本后?%鋨酸固定2 h，梯度乙醇脫水，丙酮置換，經(jīng)Epon812環(huán)氧樹脂包埋、體視顯微鏡下修塊、天青-美藍染色后，于光學顯微鏡下定位，采用超薄切片機切片（厚度為50～60 nm），進行醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重電子染色，置于透射電鏡下觀察切片上海馬神經(jīng)元形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 癥狀、體征 假手術(shù)組大鼠毛發(fā)富有色澤，活動靈活，四肢對稱，正常進食；模型組大鼠隨著造模時間的延長，逐漸出現(xiàn)皮毛粗糙發(fā)黃，呈倒立針刺狀，爪甲腫脹，鼠尾黑紫甚至出現(xiàn)斷尾，易激惹，活動受限，輕者右側(cè)肢體伸展不全，中重度者活動轉(zhuǎn)圈或向右側(cè)傾倒，以造模后24、72 h時最為明顯；治療組大鼠皮毛無光澤，爪甲腫脹及黑尾、斷尾程度較模型組減輕，活動輕微受限，四肢稍顯不對稱，但仍差于假手術(shù)組。

2.2 Zea Longa評分 假手術(shù)組大鼠Zea Longa評分均為0分。模型組和治療組大鼠造模后1、3、6 h Zea Longa評分比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；治療組大鼠造模后24 h、72 h、7 d Zea Longa評分低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。模型組大鼠造模后24 h、72 h、7 d Zea Longa評分高于本組造模后1 h，造模后72 h、7 d Zea Longa評分高于本組造模后3、6 h，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；治療組大鼠造模后7 d Zea Longa評分高于本組造模后1 h，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠不同時間點Zea Longa評分比較（±s，分，n=4）Table 1 Comparison of Zea Longa score in each group at different time points

表1 各組大鼠不同時間點Zea Longa評分比較（±s，分，n=4）Table 1 Comparison of Zea Longa score in each group at different time points

注：a表示與本組造模后1 h比較，P＜0.05；b表示與本組造模后3 h比較，P＜0.05；c表示與本組造模后6 h比較，P＜0.05

組別 造模后1 h 造模后3 h 造模后6 h 造模后24 h 造模后72 h 造模后7 d模型組 1.50±0.58 2.00±0.82 2.25±0.50 2.75±0.50a 3.25±0.50abc 3.25±0.50abc治療組 1.25±0.50 1.50±0.58 1.75±0.50 1.50±0.58 2.00±0.82 2.25±0.50a t值 0.655 1.000 1.414 3.273 2.611 2.828 P值 0.537 0.356 0.207 0.017 0.040 0.030

2.3 海馬神經(jīng)元形態(tài)及超微結(jié)構(gòu) 假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，細胞核大而圓，核膜清晰，呈雙層結(jié)構(gòu)，可見核孔，核液中常染色質(zhì)均勻分布，異染色質(zhì)少，電子密度較低，胞質(zhì)中可見豐富、結(jié)構(gòu)完整的細胞器，核糖體廣泛分布，見圖1A。

模型組大鼠造模后6 h海馬神經(jīng)元體積縮小，核膜皺縮，異染色質(zhì)增多，隨著時間的延長，異染色質(zhì)逐漸匯聚成塊并聚集在核膜周圍，線粒體結(jié)構(gòu)松散，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊性變、脫顆粒、斷裂，游離核糖體減少，溶酶體結(jié)構(gòu)完整；造模后24、72 h可見細胞核破碎，核膜不完整甚至消失，細胞器大量減少，線粒體腫脹、嵴斷裂，甚至出現(xiàn)空泡、脫顆粒狀態(tài)，高爾基體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊性擴張、腫脹，脂褐素增加；造模后7 d可見神經(jīng)元大量減少，形態(tài)不規(guī)則，細胞器結(jié)構(gòu)破壞嚴重，線粒體呈空泡狀態(tài)，見圖1B～1G。

治療組大鼠造模后6 h海馬神經(jīng)元與模型組相比細胞膜完整，常染色質(zhì)均勻，電子密度較低，細胞器增多，細胞器結(jié)構(gòu)輕度改變，空泡明顯減少；造模后72 h可見細胞核深染，線粒體腫脹程度減輕，嵴結(jié)構(gòu)存在，高爾基體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)較好，空泡減少甚至消失，各細胞器結(jié)構(gòu)狀態(tài)明顯好于同期模型組，見圖1H～1M。

圖1 各組大鼠患側(cè)海馬神經(jīng)元形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)（×1 500）Figure 1 Morphology and ultrastructure of hippocampal neurons on the affected side of rats in each group

3 討論

AIS屬于中醫(yī)學中的“中風”范疇，臨床患者以面色晦暗、肌膚甲錯、痰黃、脈疾、舌紅、苔黃膩等中醫(yī)四診信息較為常見［8］。成年人首次發(fā)病后，隨著時間的推移，1年內(nèi)腦卒中復發(fā)率高達14.7%，近年來腦卒中發(fā)病率和死亡率也逐年增長［2］。張錦等［9］、王永炎［10］指出，“毒損腦絡”是AIS的基本病機，中風后血瘀、火熱、痰濕等病理產(chǎn)物與毒邪交織相夾、郁積日久形成瘀毒、火毒、痰毒，共同侵襲、損傷腦絡，是中風病程發(fā)展、病情轉(zhuǎn)變的重要結(jié)點。隨著發(fā)病時間的延長，腦絡損傷加重，會引起一系列神經(jīng)功能缺損癥狀，包括認知障礙，而海馬是學習、記憶等神經(jīng)功能的映射區(qū)域，是易受腦缺血后損傷累及的腦區(qū)，AIS發(fā)生后可導致海馬變形［11］。線粒體能夠為細胞供能，對損傷極為敏感，其腫脹程度可以反映神經(jīng)元的損傷程度，因此通過觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的變化研究保護海馬神經(jīng)元對抑制AIS后腦缺血再灌注損傷具有重要作用。張伯禮等［12］研究表明，苦碟子注射液能夠降低中風的致殘率、病死率，提高患者的生存質(zhì)量。亦有Meta分析發(fā)現(xiàn)，苦碟子注射液的臨床治療有效率優(yōu)于其他常規(guī)用藥［13］。但苦碟子注射液治療AIS后腦缺血再灌注損傷血瘀毒損證的最佳起效時間點尚未見報道，本研究構(gòu)建AIS后腦缺血再灌注損傷血瘀毒損證模型大鼠，觀察苦碟子注射液預處理對其神經(jīng)功能及海馬神經(jīng)元的影響。

本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠活動靈活，四肢對稱；模型組大鼠隨著造模時間的延長，逐漸出現(xiàn)爪甲腫脹，鼠尾黑紫甚至出現(xiàn)斷尾，易激惹，活動受限；治療組大鼠爪甲腫脹及黑尾、斷尾程度較模型組減輕，活動輕微受限，四肢稍顯不對稱；提示苦碟子注射液預處理能夠減輕AIS后腦缺血再灌注損傷血瘀毒損證模型大鼠的缺血性損傷表現(xiàn)。治療組大鼠造模后24 h、72 h、7 d Zea Longa評分低于模型組；模型組大鼠造模后24 h、72 h、7 d Zea Longa評分高于本組造模后1 h，造模后72 h、7 d Zea Longa評分高于本組造模后3、6 h；治療組大鼠造模后7 d Zea Longa評分高于本組造模后1 h；從行為學角度證實了苦碟子注射液預處理能夠改善AIS后腦缺血再灌注損傷血瘀毒損證模型大鼠的神經(jīng)功能，且其最佳起效時間可能為24、72 h。模型組大鼠造模后6 h海馬神經(jīng)元體積縮小；造模后24、72 h可見細胞核破碎，細胞器大量減少，線粒體腫脹，高爾基體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊性擴張、腫脹；造模后7 d可見神經(jīng)元大量減少，形態(tài)不規(guī)則，細胞器結(jié)構(gòu)破壞嚴重，線粒體呈空泡狀態(tài)。治療組大鼠造模后6 h海馬神經(jīng)元與模型組相比細胞器增多，細胞器結(jié)構(gòu)輕度改變；造模后72 h可見線粒體腫脹程度減輕，高爾基體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)較好，空泡減少甚至消失，各細胞器結(jié)構(gòu)狀態(tài)明顯好于同期模型組。提示模型組和治療組大鼠海馬神經(jīng)元較假手術(shù)組出現(xiàn)不同程度的損傷，從形態(tài)學角度證實苦碟子注射液預處理能夠在一定程度上改善AIS后腦缺血再灌注損傷血瘀毒損證模型大鼠的海馬神經(jīng)元損傷情況，且其最佳起效時間為6～72 h。而從行為學與形態(tài)學角度確定的苦碟子注射液預處理的最佳起效時間存在差異，可能與海馬相較軀體癥狀而言對神經(jīng)功能缺損更加敏感有關(guān)?，F(xiàn)代藥理研究表明，苦碟子注射液可增加纖溶酶活性、抑制血栓形成、增加腦血流量［14］；而既往研究表明，腦缺血再灌注損傷過程中神經(jīng)環(huán)路信息傳遞出現(xiàn)障礙［15-17］。本研究結(jié)果在與既往動物實驗結(jié)果［18］一致的基礎(chǔ)上，以優(yōu)先保護組織形態(tài)學改變?yōu)樵瓌t，進一步明確了造模后6～72 h可能為改善神經(jīng)功能缺損的最佳時間點，推測可能與某種神經(jīng)傳導信號通路有關(guān)。

本研究尚存在一定局限性：本研究樣本量較小，結(jié)果可能存在偏倚，需進一步擴大樣本量加以驗證；此外，本研究雖明確了苦碟子注射液預處理能早期抑制腦缺血級聯(lián)反應損傷并有效減輕腦損傷、維持神經(jīng)元的形態(tài)與功能，但仍未確定苦碟子注射液預處理治療AIS后腦缺血再灌注損傷血瘀毒損證模型大鼠的具體作用靶點，這也是未來的研究方向。

綜上所述，苦碟子注射液預處理可以減輕AIS后腦缺血再灌注損傷血瘀毒損證模型大鼠的神經(jīng)功能缺損情況，抑制大鼠患側(cè)海馬神經(jīng)元形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的改變，對腦組織具有一定的保護作用，且在造模后6～72 h的作用最明顯，為臨床上使用苦碟子注射液治療AIS后腦缺血再灌注損傷血瘀毒損證患者提供了一定的實驗依據(jù)和臨床切入點。

作者貢獻：馬瑞雪、張綦慧進行研究方案設(shè)計與可行性分析；馬瑞雪進行動物實驗、數(shù)據(jù)收集、整理和分析，撰寫與修訂論文；張綦慧進行質(zhì)量控制與審校，并對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。