ATP6蛋白影響異沙葉蟬對小麥藍矮植原體的傳播效率

丁 磊,陸文靜,2,楊彥君,馬 歡,吳云鋒,*

(1.西北農(nóng)林科技大學植物保護學院,旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室,農(nóng)業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點實驗室, 陜西楊凌 712100;2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所,黑龍江佳木斯 154026)

小麥藍矮病是我國西北麥區(qū)一種重要植原體病害，對小麥危害嚴重(Wuetal.,2010)。該病害由異沙葉蟬Psammotettixalienus持久?；詡鞑ィ轶w葉蟬傳毒成為病害流行的中心環(huán)節(jié)(顧沛雯等,2007)。明確小麥藍矮植原體(wheat blue dwarf phytoplasma,WBDp)蟲傳相關(guān)蛋白與何種葉蟬蛋白互作及葉蟬傳播小麥藍矮植原體的分子機制，探索植原體病害防治新途徑成為當前面臨的關(guān)鍵問題。

作者前期經(jīng)過序列比對發(fā)現(xiàn)，pWBD-2-ORF4(WBDp第2個質(zhì)粒編碼的ORF4,P2-4)與泡桐叢枝植原體蟲傳蛋白pPaWBNy-1-ORF5的氨基酸序列(耿顯勝,2013)一致性為79.14%(Chenetal.,2014)。隨后進行蟲傳和嫁接對比實驗，qRT-PCR檢測表明傳染初期葉蟬傳播長春花植株中的P2-4表達量要明顯高于嫁接接種WBDp的植株中的，推測P2-4參與WBDp介體傳播。但如何影響沒有研究報道。因此，本研究構(gòu)建了異沙葉蟬分離泛素酵母雙雜交膜系統(tǒng)cDNA文庫，用P2-4蛋白從文庫中篩選，獲得ATP6等異沙葉蟬互作蛋白；利用RNAi技術(shù)沉默互作蛋白，明確互作蛋白在WBDp傳播過程中的功能，對于阻斷異沙葉蟬的傳播過程和WBDp病害綠色防控具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

WBDp毒源、無毒介體異沙葉蟬由本實驗室提供。異沙葉蟬飼養(yǎng)于小麥小偃6號幼苗上，人工氣候室控制溫度24℃，相對濕度20%～40%，光周期16L∶8D，每15 d更換一次小麥幼苗。NMY51酵母菌株、pNubG-Fe65,pTSU2-APP,pBT3STE,pPR3-N和pOST1-NubI載體質(zhì)粒購自上海海科生物技術(shù)有限公司，T7 RiboMAXTMExpress RNAi System購自Promega公司。

1.2 異沙葉蟬分離泛素酵母雙雜交膜系統(tǒng)cDNA文庫構(gòu)建

異沙葉蟬總RNA的提取參照Trizol?Reagent (Invitrogen)操作手冊進行，分別用1.3%瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計檢測RNA質(zhì)量和濃度。使用Oligotex mRNA Kits(Qiagen)分離純化樣本mRNA。參照SMART cDNA Library Construction方法(Zhuetal.,2001)合成ds cDNA，將cDNA純化產(chǎn)物和pPR3-N同時用SfiⅠ酶切連接完成異沙葉蟬cDNA文庫的構(gòu)建，并檢測文庫質(zhì)量和滴度。

1.3 P2-4誘餌載體的構(gòu)建

根據(jù)P2-4基因(GenBank登錄號:JX668988)序列設(shè)計帶有SfiⅠ酶切位點的克隆引物對P2-4-pBT3STE-F/R(表1)，使用CTAB法提取帶WBDp小麥葉片總DNA，再以總DNA為模板擴增P2-4基因，通過同源重組將目的基因構(gòu)建到酵母雙雜交誘餌載體pBT3STE上，用引物P2-4-F/R(表1)和引物pBT3-F1/R1(表1)分別擴增目的片段無誤后，測序驗證。PCR反應體系(25 μL):DNA 模板2 μL,2×Taq Master Mix 12.5 μL,正反向引物(10 μmol/L)各 1 μL以及 ddH2O 8.5 μL。反應條件:94℃ 3 min;94℃ 30 s,51℃ 60 s,72℃ 90 s,30個循環(huán);最終延伸 72℃ 10 min。

1.4 誘餌載體pBT3STE-P2-4篩選葉蟬cDNA文庫

參照DUALhunter System操作方法(M?cklietal.,2008)，將誘餌載體pBT3STE-P2-4和異沙葉蟬cDNA文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到NMY51酵母菌中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在DDO和QDO選擇培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)4～5 d。挑取單菌落重新在四缺培養(yǎng)基(QDO)培養(yǎng)基上培養(yǎng)并進行α-半乳糖苷酶檢測，挑選陽性克隆進行PCR鑒定并測序，測序結(jié)果在NCBI BLAST比對分析。同時對篩選到的互作蛋白進行GO注釋以及KEGG通路分析。

1.5 ATP6基因片段擴增

利用Primer Premier 5.0軟件在ATP6基因(GenBank登錄號:KX437742)功能區(qū)設(shè)計引物ATP6-F/R(表1)擴增ATP6基因片段。綠色熒光蛋白基因GFP(GenBank登錄號:KF718991)片段通過特異性引物(表1)從本實驗室保存的pCambia1302-GFP質(zhì)粒上擴增。將ATP6和GFP片段純化后分別與pMD-18T載體(TaKaRa)連接得到pMD-18T-ATP6和pMD-18T-GFP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞，鑒定出陽性克隆后提取質(zhì)粒送測序驗證。

1.6 RNAi沉默ATP6基因后異沙葉蟬傳播WBDp能力的檢測

使用引物ATP6-TF/R(表1)和GFP-TF/R(表1)從1.5節(jié)構(gòu)建的重組載體pMD-18T-ATP6和pMD-18T-GFP中PCR擴增目的基因ATP6和GFP，反應體系和反應條件見1.3節(jié)。以PCR產(chǎn)物為模板合成dsRNA。利用Promega公司的T7 Ribomax Express RNAi System試劑盒合成ATP6和GFP的dsRNA，dsGFP用于對照組。將2 μL dsRNA (5 μg/μL)與20 μL液體人工飼料混勻后，在玻璃雙通管內(nèi)飼喂無毒異沙葉蟬3齡若蟲2 d(Fuetal.,2001;田宏剛,2009)，在飼喂結(jié)束后的第1,3,5,7,9和11天取樣進行qRT-PCR檢測異沙葉蟬3齡若蟲體內(nèi)ATP6的表達情況，引物序列見表1。PCR反應體系(20 μL):cDNA模板1 μL,UltraSYBR Mixture 10 μL,正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL以及 ddH2O 8 μL。反應條件:95℃ 10 min;95℃ 15 s,60℃退火/延伸 60 s,40個循環(huán)。生物學重復和技術(shù)重復各3次，每個生物學重復來自3頭個體，內(nèi)參基因為Actin，內(nèi)參基因引物序列為qActin-F/R(表1)。參照 2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達量變化(Livak and Schmittgen,2001)，使用Microsoft Excel 2010對數(shù)據(jù)進行整理并作圖。

轉(zhuǎn)接無毒異沙葉蟬3齡若蟲至含有dsRNA的人工飼料飼喂2 d后再飼喂WBDp 7 d，每株小麥轉(zhuǎn)接3頭異沙葉蟬若蟲傳毒7 d，培養(yǎng)生長14 d后PCR檢測植株感病情況并分析沉默ATP6基因及對異沙葉蟬傳播WBDp能力的影響。先提取小麥葉片總DNA，再以總DNA為模板使用引物P1/P7(表1)和引物R16F2n/R2(表1)進行巢式PCR檢測小麥帶WBDp的情況。PCR反應體系和反應條件見1.3節(jié)。之后統(tǒng)計dsATP6組和dsGFP組(每處理組實驗重復3次，每次檢測小麥30株)帶WBDp的小麥植株數(shù)量，分別計算兩組小麥帶WBDp的百分率，即為異沙葉蟬對WBDp的傳播率。

1.7 數(shù)據(jù)分析

基因的相對表達量和WBDp傳播率著性檢驗方法采用SAS 9.2軟件中獨立樣本T檢驗(P<0.01)進行，結(jié)果表示為3次重復的平均值±標準誤。

2 結(jié)果

2.1 異沙葉蟬分離泛素酵母雙雜交膜系統(tǒng)cDNA文庫構(gòu)建和質(zhì)量檢測

電泳結(jié)果顯示提取的異沙葉蟬總RNA未降解，完整性較好，純化出3.9 μg mRNA，條帶清晰且分布均勻，符合建庫需要(圖1)。mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物ds cDNA經(jīng)SfiⅠ酶切后連接pPR3-N文庫載體，獲得了以pPR3-N為載體的酵母雙雜交膜系統(tǒng)cDNA文庫，原始文庫庫容量約為1.25×107cfu。PCR檢測顯示插入片段平均長度大于1.2 kb，文庫陽性率為100%(圖2)。擴繁文庫菌液并抽提質(zhì)粒，得到文庫質(zhì)粒2.5 mg。

圖1 異沙葉蟬總RNA和純化mRNA電泳Fig.1 Electrophoresis of total RNA and purified mRNA isolated from Psammotettix alienusM:DL12000;1:總RNA Total RNA;2:純化的mRNA Purified mRNA.

圖2 異沙葉蟬cDNA文庫插入片段的PCR檢測Fig.2 Detection of inserted fragments of cDNA library of Psammotettix alienus by PCRM:DL12000;1-24:24個隨機選取的克隆24 clones randomly selected.

2.2 P2-4雜交異沙葉蟬分離泛素酵母雙雜交膜系統(tǒng)cDNA文庫篩選互作蛋白

使用帶酶切位點的P2-4-pBT3STE-F/R引物擴增目的基因，經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收后將P2-4同源重組法連接至pBT3STE載體，構(gòu)建了誘餌蛋白載體pBT3STE-P2-4。使用P2-4-F/R和pBT3-F1/R1引物擴增分別得到489 bp和591 bp條帶(圖3)，送測序驗證重組質(zhì)粒序列無誤。

圖3 小麥藍矮植原體的P2-4基因及其重組質(zhì)粒pBT3STE-P2-4的PCR電泳檢測Fig.3 Gel electrophoresis of P2-4 gene of wheat blue dwarf phytoplasma and its recombinant plasmid pBT3STE-P2-4 detected by PCRM:DS5000;1:P2-4;2:pBT3STE-P2-4.

將誘餌載體pBT3STE-P2-4與異沙葉蟬文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母NMY51感受態(tài)細胞，在DDO和QDO培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。結(jié)果獲得總菌落數(shù)為1.57×106cfu，轉(zhuǎn)化效率為5.39×104cfu/μg。提取酵母菌陽性克隆質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中進行測序，將測序結(jié)果在BLAST分析后，獲得ATP synthase F0subunit 6(ATP6)等8種候選蛋白(表2)，回復驗證和α-半乳糖苷酶檢測結(jié)果顯示P2-4與以上8種蛋白互作(圖4)，其中與ATP6為強互作。

圖4 異沙葉蟬cDNA文庫中與WBDp的P2-4互作蛋白陽性克隆的α-半乳糖苷酶檢測Fig.4 Detection of α-galactosidase of positive clones interacting with P2-4 of WBDp in the cDNA library of Psammotettix alienusP:陽性Positive;N:陰性Negative;1-8:陽性克隆，對應的蛋白信息見表2 Positive clones,their corresponding proteins as in Table 2.

表2 從異沙葉蟬cDNA文庫篩選出與小麥藍矮植原體的P2-4互作的蛋白Table 2 Putative proteins screened in the cDNA library of Psammotettix alienus interacting with P2-4 of wheat blue dwarf phytoplasma

對篩選到的互作蛋白進行GO注釋，結(jié)果顯示上述蛋白參與的生物學進程包括ATP合成耦合質(zhì)子運輸(ATP synthesis coupled proton transport)、三磷酸鳥苷生物合成過程(GTP biosynthetic process)、凋亡過程(apoptotic process)、調(diào)節(jié)肌肉細胞細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)(muscle cell cellular homeostasis)、消化過程(digestive process)、運輸(transport)及細胞質(zhì)翻譯(cytoplasmic translation)等；分子功能包括質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運體活性(proton transmembrane transporter activity)、核糖體結(jié)構(gòu)成分(structural constituent of ribosome)、催化活性(catalytic activity)、細胞色素C的凋亡釋放(apoptotic release of cytochrome c)、肌動蛋白與金屬離子結(jié)合(actin and metal ion binding)、半胱氨酸型肽酶活性(cysteine-type peptidase activity)及脂質(zhì)結(jié)合(lipid binding)等；細胞組成包括線粒體(mitochondrion)、細胞膜(membrane)、細胞質(zhì)溶膠(cytosol)、線粒體內(nèi)膜(mitochondrion inner membrane)和細胞骨架(cytoskeleton)等(圖5)。參考KEGG數(shù)據(jù)庫，上述蛋白參與異沙葉蟬體內(nèi)能量代謝、跨膜運動和其他代謝調(diào)控過程。

圖5 異沙葉蟬cDNA文庫中與小麥藍矮植原體的P2-4互作蛋白的GO注釋Fig.5 GO annotation of proteins in cDNA library of Psammotettix alienus interacting with P2-4 of wheat blue dwarf phytoplasmaA:分子功能 Molecular function;B:生物學進程 Biological process;C:細胞組成 Cellular component.

2.3 ATP6片段擴增和dsRNA的合成

經(jīng)基因擴增，得到525 bp的ATP6和284 bp的GFP片段條帶(圖6)，分別純化后插入pMD-18T載體，得到pMD-18T-ATP6和pMD-18T-GFP，以從克隆載體中擴增的目的基因的PCR產(chǎn)物為模板合成dsRNA，經(jīng)過洗滌和純化，獲得ATP6的dsRNA和GFP的dsRNA。

圖6 ATP6和GFP擴增片段的電泳檢測Fig.6 Gel electrophoresis of ATP6 and GFP fragmentsM:DS2000;1:ATP6;2:GFP.

2.4 沉默ATP6對異沙葉蟬傳毒能力的影響

用ATP6和GFP的dsRNA 分別飼喂無毒異沙葉蟬3齡若蟲后，在6個時間點取樣進行qRT-PCR檢測，結(jié)果表明飼喂ATP6的dsRNA第1-11天異沙葉蟬體內(nèi)ATP6的表達量降低，僅為對照組(dsGFP)的30%～40%(P<0.01)，第5天下降最明顯(圖7)，表明飼喂dsATP6能夠降低異沙葉蟬若蟲體內(nèi)ATP6 mRNA水平。用飼喂dsRNA 2 d后的異沙葉蟬3齡若蟲進行傳毒能力測定，結(jié)果表明dsATP6飼喂組葉蟬的WBDp傳播率比對照組(dsGFP飼喂組)下降了23.33%±3.33%(圖8)。說明篩選到的ATP6蛋白對異沙葉蟬傳播小麥藍矮植原體的能力有一定影響，是一種重要的傳毒相關(guān)蛋白。

圖7 RNAi干擾ATP6對健康異沙葉蟬3齡若蟲中ATP6的相對表達量的影響Fig.7 Effect of RNAi of ATP6 on the relative expression level of ATP6 in the 3rd instar nymphs of healthy Psammotettix alienus圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；柱上星號表示差異顯著(P<0.01,T檢驗)。Data in the figure are mean±SE.Asterisk above bars indicates significant differences (P<0.01,T-test).下同The same below.

3 討論

本研究運用SMART技術(shù)構(gòu)建了高質(zhì)量的異沙葉蟬分離泛素酵母雙雜交膜系統(tǒng)cDNA文庫，并以P2-4蛋白為誘餌，篩選到ATP合成酶等8種互作蛋白(表1)，可能與WBDp傳播相關(guān)。利用RNAi技術(shù)沉默ATP6基因表達后，異沙葉蟬3齡若蟲傳播WBDp的效率明顯降低了23.33%(圖8)，說明異沙葉蟬ATP6蛋白影響了WBDp的持久?；詡鞑?。從異沙葉蟬體內(nèi)鑒定出的ATP6互作蛋白為研究WBDp與昆蟲介體互作機制和植原體病害的田間防治提供了理論基礎(chǔ)。

圖8 ATP6 RNAi對異沙葉蟬3齡若蟲的WBDp傳播率的影響Fig.8 Effect of RNAi of ATP6 on the WBDp transmission rate by the 3rd instar nymphs of Psammotettix alienus將無毒異沙葉蟬3齡若蟲飼喂含有dsRNA的人工飼料2 d后再飼喂WBDp 7 d，之后每株小麥轉(zhuǎn)接3頭異沙葉蟬若蟲傳毒7 d，接蟲14 d后PCR檢測小麥植株帶WBDp的情況；每處理組實驗重復3次，每次檢測30株小麥。The 3rd instar nymphs of healthy P. alienus were fed with WBDp for 7 d after fed with the artificial diet containing dsRNA for 2 d,and then three nymphs were transferred to a wheat plant for 7 d.The presence of WBDp in wheat plants were detected at 14 d after nymph infestation.Three repeat experiments were performed for each treatment,and a total of 30 wheat plants were examined for each repeat.

本實驗利用P2-4蛋白篩選異沙葉蟬酵母文庫，共獲得8種可能與WBD植原體傳播相關(guān)的異沙葉蟬蛋白。其中，ATP6的克隆數(shù)為7個，遠多于其他7種互作蛋白的克隆數(shù)。已有研究表明ATP合成酶通過兩個結(jié)構(gòu)域F1和F0相互作用與細胞膜結(jié)合催化ATP的合成(Boyer,1997)，為各種細胞活動提供能量。由于植原體本身缺乏ATP合成途徑(Oshimaetal.,2004;Jietal.,2010)，在一定程度上依賴介體昆蟲體內(nèi)的ATP完成運輸和繁殖(Christensenetal.,2005;Hogenhoutetal.,2008)。我們推測異沙葉蟬ATP6蛋白參與WBDp的傳播并首選ATP6蛋白進行后續(xù)驗證。利用RNAi技術(shù)沉默ATP6后，異沙葉蟬傳播WBDp的效率明顯下降(圖8)。表明異沙葉蟬ATP6蛋白是參與WBDp傳播的關(guān)鍵蛋白。太平洋白蝦LitopenaeusvannameiATP synthase β與白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus,WSSV)結(jié)合，并在宿主侵襲過程中發(fā)揮作用(Liangetal.,2010)。同時作為病毒受體，介導病毒顆粒進入宿主細胞(Fongsaranetal.,2014;Liangetal.,2015)。ATP synthase β也與植原體的免疫膜蛋白互作并參與植原體介體傳播(Galettoetal.,2011)。本研究中WBDp的P2-4蛋白和ATP6存在特異性互作，推測WBDp在進入介體消化系統(tǒng)的過程中，利用葉蟬體內(nèi)ATP完成運輸和繁殖。本研究結(jié)合酵母雙雜交和RNAi技術(shù)，鑒定出一種參與WBDp傳播的關(guān)鍵蛋白ATP6，但是對于P2-4與ATP6蛋白的結(jié)合方式及互作機理仍不明確。在接下來的研究中，我們將利用GST-pull down和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)等方法進一步驗證二者的互作關(guān)系，并結(jié)合免疫熒光(immunofluorescence,IF)等技術(shù)揭示異沙葉蟬傳播WBDp的分子機理。

RNAi技術(shù)已經(jīng)有20余年的發(fā)展歷史，而且在害蟲控制中顯示出重要價值和巨大的應用潛力(Zhangetal.,2017)。RNAi不僅是基因功能鑒定的有效分子工具，也是開發(fā)害蟲和病害控制的新途徑，對環(huán)境影響小，目標特異性強，已經(jīng)廣泛應用于害蟲防治(Gu and Knipple,2013;Lietal.,2013;Jogaetal.,2016;Kanakala and Ghanim,2016)。本研究通過飼喂法將ATP6 dsRNA導入異沙葉蟬體內(nèi)后沉默效果明顯(圖7)，表明ATP6在結(jié)合WBDp進入異沙葉蟬體內(nèi)發(fā)揮重要作用。同時ATP6也有望成為降低異沙葉蟬對小麥藍矮植原體的傳播效率的有效靶標，對小麥藍矮植原體病害的防治具有重要意義。

致謝本研究異沙葉蟬RNAi實驗得到西北農(nóng)林科技大學植物保護學院田宏剛老師的指導和幫助，特此致謝。